工程化血管肌瓣
January 11th, 2016
迄今为止，厚组织缺损通常通过应用自体组织皮瓣或工程组织来重建。在该协议中，我们提出了一种新方法，用于设计带有自体椎弓根的血管化组织皮瓣，以替代自体皮瓣。
该程序的总体目标是创建一个血管化良好的组织瓣，用于重建全层腹壁缺损。这是通过首先制备可生物降解的聚乳酸聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架来实现的。接下来，接种内皮细胞、肌肉细胞和成纤维细胞，并在体外培养移植物以使细胞自组装。
然后将工程组织植入小鼠的股动脉和静脉周围，在那里它与宿主血管发生吻合并变得高度血管化。最后，组织作为带蒂的皮瓣转移到全层腹壁缺损。最终，通过超声、T 葡聚糖注射和 CD31 免疫染色证明移植物血管形成，并使用生物动力学测试仪器检查皮瓣刚度。
与现有方法相比，这种方法的主要优点是供体部位迁移率低，并且工程皮瓣的活力高，可用于构建全层软组织。这种方法可以帮助患有全层腹壁缺损的患者。演示该程序将由整形外科医生 Dana Egozi 博士与我的实验室合作完成，Anina Freimann 将协助她。
根据文本方案准备支架和包埋细胞后，高压灭菌以下手术工具：小细直剪刀、弹簧剪刀、直细尖镊子、锯齿镊子、哈德逊镊子、持针器和 15 号刀片手术刀。在微量离心管中制备 425 微升氯胺酮和 75 微升西洛辛的混合物，然后转移到注射器中。然后在无菌盐水中稀释每毫升 0.3 毫克丁丙诺啡 1 至 20。
根据文本方案麻醉鼠标后，将其放在载物台上，加热至 37 摄氏度，以保持正常体温，并使用粘性绷带将其固定在载物台上。使用棉签，先用碘酒，然后用 70% 乙醇清洁切口部位，以建立一个无菌的工作区域。验证镇静程度后，用手术刀从膝盖到平行于股血管的腹股沟韧带穿过皮肤切开，直到暴露股动脉和静脉血管。
使用夹子或针头压住皮肤。然后，使用弹簧剪刀和镊子，从深部下方的股动脉 AV 开始，到胫骨和腓骨 AV 的分叉上方，小心地将股动脉和静脉血管与周围组织隔离。保持深部不动，以保持流向腿部的血液并防止随后的缺血。
接下来，将先前准备好的移植物折叠在暴露的股骨 AV 周围，在深部下方和胫骨和鼻翼分叉上方，并使用 8-0丝绸缝合线连接其末端。为了确保仅通过从股 AV 血管发芽的毛细血管形成植入物血管化，在移植物下放一块消毒过的乳胶，然后使用 6-0 丝将其缠绕在移植物上并缝合。然后使用 4-0 丝缝合线闭合上覆的皮肤。
每天两次皮下注射安丙奥啡，持续 2 到 3 天。密切监测小鼠，直到从麻醉中恢复，此后每天监测，直到移植物作为皮瓣转移。植入后一到两周，麻醉小鼠后，将动物放在加热的载物台上并固定。
如本视频前面所示清洁切口部位后，使用剪刀和镊子小心地打开皮肤上的缝合线，然后用手术刀在垂直于腹股沟韧带的皮肤上切开一个切口，继续穿过腹侧皮肤。使用手术刀在腹壁上切开一个切口。小心地取出乳胶片并露出血管化皮瓣。
然后用剪刀和镊子从周围组织中解剖组织瓣。8-0丝缝合，结扎股骨 AV 的远端以防止 AV 出血。然后在膝盖处烧灼 AV，远端折叠的植入组织和 8-0缝线。轻轻地将移植物包裹的股动脉房室移向腹侧腹壁，避免损伤动脉，以确定应在多远处形成全层缺损。
用弹簧剪刀在腹直肌上切开一个切口，然后去除大约 1 厘米 x 0.8 厘米的肌肉段和覆盖的皮肤。使用 8-0 将血管化移植物包裹的股静脉作为轴向皮瓣转移到腹侧腹壁的全层缺损预防疝气的丝线缝合线。将皮瓣缝合到周围的肌肉组织上。
然后用 4-0 丝绸缝合腿部皮肤。让腹侧皮肤暴露在外，以模拟全腹壁缺损的效果。用碘纱布和无菌绷带覆盖皮肤伤口，以防止暴露区域受到污染。
按照本视频中前面所述的施用丁丙诺啡。密切监测动物，直到从麻醉中恢复，此后每天监测，直到恢复皮瓣，用于文本方案中概述的研究。在植入后 1 周和 2 周，对移植物区域的粗略观察显示，CD31 免疫染色阳性确定组织移植物是活的和高度血管化的。
组织移植物也高度灌注，如 FITC-葡聚糖尾静脉注射和超声测量所见。该图显示，在植入后一周已经观察到许多血管，在 AV 血管附近再增加一周后，这一数字显着上升。如图所示，移植物植入后股骨通畅和完整性通过彩色多普勒模式下的超声成像证实。
蓝色和红色代表移植物中的血流。此外，超声图形检查显示移植物区域内有灌注，与一周相比，植入后灌注略高。转移后一周对皮瓣的粗略检查显示，它们对周围环境有很强的依恋。
当比较前维管化细胞包埋的皮瓣时，对照无细胞非血管化移植物前者表现出优异的机械性能，包括刚度和强度，这也导致较少的裂开和突出。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约 30 分钟内完成。开发后，这项技术为整形外科医生治疗患有全层腹壁缺损以及其他复杂和严重的软组织缺损的患者铺平了道路。
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概述
本协议介绍了一种新颖的方法，用于构建带有自体蒂的血管化组织瓣，旨在重建全层腹壁缺损。该方法利用生物可降解支架来支持细胞组装和血管化。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 再生医学
- 血管生物学
背景
- 传统重建方法涉及自体组织瓣。
- 工程化组织为复杂组织缺损提供了潜在的替代方案。
- 血管化对于工程化组织的活力至关重要。
- 本研究探索了一种增强组织瓣血管化的方法。
研究目的
- 开发用于腹壁重建的血管化组织瓣。
- 利用自体蒂来改善移植物整合。
- 在临床前模型中评估工程化组织的有效性。
使用的方法
- 制备生物可降解聚乳酸支架。
- 将内皮细胞、肌肉细胞和成纤维细胞接种到支架上。
- 体外培养以促进细胞自组装。
- 在小鼠模型中将工程化组织植入股动脉和静脉周围。
主要结果
- 工程化组织成功与宿主血管进行吻合。
- 通过超声和CD31免疫染色确认了显著的血管化。
- 使用生物动力学测试仪评估了瓣的刚度。
- 该方法显示出作为自体瓣替代品的潜力。
结论
- 研究提出了一种传统组织重建方法的可行替代方案。
- 通过描述的工程方法，可以实现增强血管化。
- 该技术可能改善重建手术的结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
Engineering vascularized muscle flaps addresses a critical barrier in tissue construct viability by enabling oxygen and nutrient delivery at clinically relevant thicknesses. This capability supports translational advancement in reconstructive and regenerative medicine, particularly for full-thickness soft tissue defects. The approach enhances predictive confidence for tissue integration and functional restoration in preclinical models, informing portfolio decisions for next-generation biomaterials.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vascularization mechanisms in engineered tissues for functional validation.
- Supports biological de-risking by demonstrating in vivo integration and perfusion of constructs.
- Facilitates predictive assessment of tissue viability and mechanical properties in preclinical settings.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for evaluating scaffold-cell combinations under physiological vascularization.
- Standardizes quantitative assessment of graft perfusion and mechanical strength using imaging and biodynamic testing.
- Enables screening of biomaterial formulations for optimal integration and reduced rejection risk.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered constructs with disease-relevant models for abdominal wall and soft tissue reconstruction.
- Supports continuity from in vitro assembly to in vivo functional validation and integration.
- Informs risk-adjusted advancement of tissue engineering candidates toward clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This engineered vascularized flap method bridges early discovery, preclinical validation, and translational research for reconstructive tissue engineering.
- Discovery Biology: Demonstrates hypothesis testing for vascular integration and tissue viability in vivo.
- Screening: Delivers quantitative outputs on perfusion, vascularization, and mechanical properties for candidate comparison.
- Analytics: Utilizes ultrasound, immunostaining, and biodynamic testing to generate reproducible readouts.
- Translational Research: Provides a preclinical model for evaluating engineered tissue performance in clinically relevant defects.
- Enterprise Reuse: Establishes a workflow adaptable to various tissue types and biomaterial platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tissue viability and integration for regenerative applications.
- Operational Value: Standardizes vascularization and mechanical testing protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for biomaterial and tissue engineering programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates with demonstrated in vivo performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in scaffold fabrication, cell culture, and microsurgical implantation.
- Demands access to imaging modalities (ultrasound, immunostaining) and mechanical testing instruments.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible construct preparation and analysis.
- Adaptable to different cell types and defect models with protocol optimization.
- Limited by the need for in vivo validation and specialized surgical skills.
