Name: 胃食管反流与小鼠手术模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: 学习小鼠胃食管反流手术模型的建立方法，用于研究胃食管反流病及其并发症的发病机制。该视频详细演示了胃反流、混合反流和十二指肠反流三种模型的手术操作步骤。

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本研究受到中国国家自然科学基金（编号：81400590）、美国国立卫生研究院（U54 CA156735）以及武田药品工业有限公司（MA-NC-D-156）研究资助的支持。

所有动物实验均已获得机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 小鼠准备
<ol>
	<li>使用体重超过约20 g或年龄超过约6周的小鼠进行手术。</li>
	<li>手术前，给予小鼠实验室饲料和水 随意摄取 并维持在12小时光照-12小时黑暗的循环条件下。</li>
	<li>用毛发剪刀剃除手术区域的毛发。通过腹腔注射给予小鼠80 mg/kg氯胺酮和12 mg/kg赛拉嗪进行麻醉。此剂量可在数分钟内使小鼠进入睡眠状态，并为后续手术操作提供充分的麻醉效果。</li>
	<li>通过捏压足垫，确认角膜反射和肢体回缩反应消失，以判断麻醉是否充分。涂抹润滑性眼膏&#160;以防止眼睛干涩。</li>
	<li>使用聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。</li>
</ol>
2. 胃反流模型（图1B）
<ol>
	<li>从剑突开始，沿腹中线上方向肛门方向做一条长约 2 cm 的切口。</li>
	<li>沿腹中线切开腹腔。使用剪刀切除剑突以增强术野暴露。</li>
	<li>分离并切断肝脏与胃之间的结缔组织。结扎并切断脾脏与胃底之间的血管束，以完全游离胃底。</li>
	<li>将胃底轻柔向左翻转，显露食管胃交界处的左侧区域。使用锐利剪刀在远端食管的肌层做一条 5 mm 的纵行切口，暴露上皮层。</li>
	<li>沿相同方向切开上皮层（切口 1，图 1B）。在前胃部分做三个切口（切口 2、3 和 4，图 1B），使用锐利手术剪将大部分前胃组织剪除。若胃内非空虚，需小心清除胃内容物。</li>
	<li>使用 8-0 Prolene 缝线（带锥形针头）从 a 点（位于食管）穿过至 a’ 点（位于前胃），确保黏膜与黏膜准确对合。同样方式将缝线穿过 b 点与 b’ 点及其他对应点对。各缝线之间应均匀间隔 3–4 mm。</li>
	<li>用生理盐水冲洗腹腔，清除血液及胃内容物。使用丝线缝合腹壁，金属夹闭合皮肤。</li>
</ol>
3. 混合反流模型（图1C）
<ol>
	<li>按照步骤 2.1 至 2.4 暴露食管胃交界处。</li>
	<li>轻柔地将食管背侧与食管后方的血管分离。将一小团棉签头插入食管与血管之间。 
	注意：可部分去除棉签头上的棉絮以减小其体积。该棉签头具有两个作用：抬高食管并保护血管。</li>
	<li>使用锐利的手术剪，在食管胃交界处及邻近幽门的十二指肠近端分别做两个 5 mm 的纵向切口。在十二指肠上的切口应避开血管，并置于对系膜缘。</li>
	<li>使用间断的 8-0 Prolene 缝线准确对合黏膜层，将两个切口进行吻合。通常在背侧放置 3–4 针，在腹侧放置 2–3 针。</li>
	<li>移除棉签头。用生理盐水冲洗腹腔，然后关闭腹壁和皮肤。</li>
</ol>
4. 十二指肠反流模型（图1D）
<ol>
	<li>按照步骤 3.1 至 3.4 生成混合反流。</li>
	<li>小心抬起胃部以暴露其背面。肝脏的一个叶可能被肝与胃后壁之间的结缔组织牵连。仔细切断这些结缔组织，妥善保护肝脏，并暴露食管背侧的血管。</li>
	<li>结扎并切断血管。在食管胃交界处结扎并切断食管。</li>
	<li>在幽门处结扎十二指肠。结扎并切断肠系膜。完整切除整个胃。</li>
	<li>用生理盐水冲洗腹腔。缝合腹壁和皮肤。</li>
</ol>
5. 术后治疗
<ol>
	<li>术后使用加热垫维持体温。只有在小鼠恢复胸卧位后，方可将其放回与其他动物同笼饲养。</li>
	<li>给予抗生素和镇痛药以预防感染并缓解疼痛。注射拜耳锐（Baytril，10&#160;mg/kg，i.p., q.d，连续3天）以预防感染，以及盐酸丁丙诺啡（Buprenorphine hydrochloride，0.05 mg/kg，s.c., b.i.d，持续两天）作为镇痛药物。术后无需禁食。&#160; 
	可提供液体或软质饮食。&#160;</li>
	<li>每日评估小鼠的一般健康状况。若小鼠出现以下症状（体重显著下降 &#62;15%、食欲减退、发出叫声、口、鼻或眼部有分泌物、蜷缩姿势、活动减少、理毛行为异常），应实施安乐死。</li>
</ol>

<ol><li>Kandulski, A., Malfertheiner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroesophageal+reflux+disease--from+reflux+episodes+to+mucosal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).</li>
<li>Orlando, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+integrity+of+the+esophageal+mucosa.+Balance+between+offensive+and+defensive+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).</li>
<li>Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx+genes%2C+inflammation%2C+and+the+pathogenesis+of+intestinal+metaplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).</li>
<li>Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+mechanisms%2C+and+endoscopic+treatment+of+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origins+and+molecular+mechanisms+of+Barrett%27s+esophagus+and+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma.</a> Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).</li>
<li>Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Experimental+models+for+Barrett%27s+esophagus+and+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).</li>
<li>Baruah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+research+on+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Translational research on Barrett's esophagus.</a> Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).</li>
<li>Lechpammer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavopiridol+reduces+malignant+transformation+of+the+esophageal+mucosa+in+p27+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice.</a> Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).</li>
<li>Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroesophageal+reflux+leads+to+esophageal+cancer+in+a+surgical+model+with+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice.</a> BMC Gastroenterol. 9, 59(2009).</li>
<li>Mari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pSMAD%2FCDX2+complex+is+essential+for+the+intestinalization+of+epithelial+metaplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia.</a> Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroesophageal+reflux+activates+the+NF-kappaB+pathway+and+impairs+esophageal+barrier+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+deficiency+impairs+the+barrier+function+of+mouse+oesophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium.</a> Gut. 63 (5), 711-719 (2014).</li>
</ol>

其中一位作者（XC）获得了武田药品工业有限公司提供的资助，该资助用于支持与胃食管反流病相关的基础研究。本文所使用的试剂或仪器均非该公司生产。

已建立了多种手术模型以模拟啮齿类动物中的胃、十二指肠及混合性反流。本文所述的这三种手术方法适用于长期实验，且术后存活率较为理想。具备外科经验的研究人员经过短期练习后即可掌握这些技术。
术前腹腔注射麻醉剂、分离肝脏与胃之间结缔组织时造成肝脏撕裂，以及意外损伤血管均可能导致出血。应尽可能避免上述情况。如确需止血，可酌情使用电池驱动的微型电凝器。操作器官和组织时，应尽可能避免过度牵拉。镊子尖端可用棉絮包裹，或使用棉签代替镊子，如同使用筷子般进行操作。小鼠食管具有两层结构，即外层呈红色的“肌层管”和内层呈白色的“上皮管”。当对食管进行切开时，需将两层同时切开。缝合时应保持针距均匀，并准确对合黏膜与黏膜。若缝合间距过大，可能导致漏液；若间距过小，则可能引发狭窄。然而，狭窄可阻塞食物通过，导致术后死亡；而轻微漏液通常可通过局部粘连及纤维化反应自行修复，一般不危及生命。
在实验方案中，有几个至关重要的通用原则需要遵循。手术时间应尽可能缩短（在实验室中约为20-30分钟）。&#160;手术前后无需禁食。事实上，长时间禁食（&#62;1天）可能...

胃食管反流病（GERD）是一种慢性疾病，由远端食管长期暴露于胃内容物或胃十二指肠内容物所引起1。长期暴露于这些有害的反流物会损害食管上皮的内在防御机制，从而导致食管炎2。巴雷特食管发生在慢性反流的背景下，是一种癌前病变，可增加食管腺癌的发生风险3,4。尽管该类疾病具有重要的临床意义，但胃食管反流病、巴雷特食管及腺癌的发生机制尚未被充分阐明。
动物模型对于研究人类疾病的病因、病理、分子机制、预防和治疗至关重要。迄今为止，研究人员已利用模式动物建立了多种胃食管反流病（GERD）、巴雷特食管和腺癌的动物模型5,6。小鼠食管内衬复层鳞状上皮，其组织学结构与人类食管相似。尽管小鼠食管在角化程度以及缺乏黏膜下腺体方面与人类食管存在差异，但由于其维持成本相对较低且易于进行复杂的遗传修饰，小鼠仍是一种极具吸引力的模式动物。目前常用于建立小鼠胃食管反流病、巴雷特食管及腺癌模型的方法主要有两种：反流手术和遗传修饰。反流手术是诱导反流的最佳方式，而遗传修饰则可模拟分子水平的改变5,7。将反流手术与遗传修饰相结合，有助于进一步深入理解疾病的发生机制8。
我们及其他研究者已报道了许多外科手术方法6,9：（1）胃反流：幽门结扎、幽门缩窄联合前胃结扎、Wendel胃底成形术、食管-胃吻合术；（2）混合性反流：食管-胃-十二指肠吻合术、食管-十二指肠吻合术（或食管-空肠吻合术）；（3）十二指肠反流：食管-胃-十二指肠吻合术联合胃切除术；（4）化学成分反流：胆汁反流、胰液反流、食管灌注；（5）食管移植5最近，有研究报道了一种利用磁铁进行食管-空肠吻合的显微外科小鼠模型，以诱导产生空肠反流。10这些手术模型具有以下优势 体外 细胞培养或类器官培养模型。 体外食管细胞无法耐受高酸性或高浓度胆汁酸的培养环境。常用于诱导食管上皮细胞改变的非结合型胆汁酸 体外 通常不存在于十二指肠反流物中 体内因此，从此类研究中得出的结论 体外 应谨慎对待这些研究结果。
由于小鼠食管体积较小，对其进行手术操作仍是一项技术挑战。术后存活率较低，导致需要一定样本量才能得出统计学上可靠结论的实验难以开展。过去，我们已成功建立并表征了胃反流、混合反流和十二指肠反流的小鼠手术模型，并应用于长期实验研究9,11,12。我们还曾为其他多个研究团队的小鼠手术提供过技术咨询。本文中，我们详细描述了三种小鼠手术操作步骤，以帮助科研人员在各自实验室中成功建立这些模型。

<table><tbody><tr><td>Dumont #1 镊子 Dumostar 尖端&amp;nbsp;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型夹子施加镊子 5.5&quot;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bonn 剪刀 3.5&quot; 直型 15 mm 锐/锐碳化钨刀片</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀 5.5&quot; 直型锐/锐 SureCut</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 黑色编织丝线 100 码卷轴</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科缝合针 1/2 圆形切边 尺寸 12（25 mm 弦长）每包 12 枚</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halsey 持针器 5&quot; 光滑型</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型持针器 5.125&quot; 弯型锁扣 0.6 mm</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm 伤口夹施加器</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm 伤口夹 100 个/盒</td><td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRONOVA 聚（六氟丙烯-VDF）缝线 8-0</td><td>Ethicon US, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>林格氏液</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胃食管反流手术模型

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

已有多种外科手术方法被报道可诱导动物产生胃食管反流。本文报道了三种旨在诱导小鼠发生胃内容物、十二指肠内容物或混合内容物反流的手术模型。文中详细描述了手术操作步骤及基本原理。具备外科经验的研究人员经过短期练习后即可掌握该技术。术后大多数小鼠可存活，并发展出类似于人类的反流性食管炎。然而需要注意的是，小鼠与人类食管在组织学上的差异是这些手术模型固有的局限性。若将这些模型用于巴雷特食管和腺癌的研究，可能需要结合基因修饰手段。

大多数小鼠（&gt;95%）可存活于手术。在围手术期，死亡的主要原因包括麻醉剂过量、出血及未知因素。
术后四周 &gt;90% 患有胃食管反流或混合性反流的小鼠 &gt;80% 经历十二指肠反流的小鼠可存活。在此期间，小鼠主要因食管狭窄和无法进食而死亡。这些小鼠表现出严重应激的迹象（弓背姿势、活动减少、呕吐、眼窝凹陷、发声） 等等。）并需要实施安乐死。使用抗生素和输液等医疗措施通常无法挽救这些小鼠的生命。小鼠术后体重通常会下降数克，尤其是存在十二指肠反流的小鼠。然而，体重随后会逐渐恢复并增加。
术后40周 &gt;80%出现胃和混合性反流的小鼠 &gt;70% 经历十二指肠反流的小鼠可以存活。在此期间，部分小鼠可能因营养不良或未知原因死亡。我们已在手术后维持小鼠存活达80周。总体而言，这些小鼠仍然相当活跃且健康。9.
术后四周，反流或多或少会损伤食管上皮的结构。显微镜下可见上皮增厚，乳头延长。上皮细胞出现过度增殖，并伴有炎性细胞浸润...

本文展示了小鼠胃食管反流的手术操作流程。这些模型是研究胃食管反流病机制及治疗的有用工具，也可能用于巴雷特食管和食管腺癌的相关研究。

已有多种外科手术被报道可诱导动物产生胃食管反流。本文报道了三种以小鼠为目标的外科手术模型，旨在……

本实验的总体目标是在小鼠中建立胃食管反流模型。首先，介绍胃源性反流模型的制备方法，接着展示混合性反流模型的构建过程，随后演示十二指肠反流模型的制备。最终，可通过组织学分析评估不同反流模型所诱导的食管损伤程度。通常，由于小鼠食管较细，初次使用该药物的研究人员可能会遇到困难，从而建立胃食管反流模型。通过脚趾夹捏法确认麻醉深度达到适当水平后，使用毛发修剪器剃除手术区域的毛发，并在动物眼睛上涂抹眼膏。使用聚维酮碘溶液对暴露的皮肤进行消毒。然后从剑突开始，沿中线向下朝肛门方向做一条2厘米长的上腹部正中切口。接着，沿正中线打开腹腔，使用剪刀切除剑突。分离并剪断肝脏与胃之间的结缔组织。然后结扎并切断脾脏与胃底之间的血管束。当胃底完全游离后，将组织稍向左侧翻转，以暴露食管胃结合部的左侧。接着使用锐利的剪刀，在远端食管的肌肉层上做一道5毫米长的纵行切口，以暴露上皮层。沿相同方向做三个切口，打开上皮组织，切除大部分四胃。接着，使用锥形针头，以8-0 Prolene缝线先穿过食管，再穿过四胃，确保黏膜与黏膜准确对合。本演示中采用6-0 Proline缝线以提高操作能力，继续以3至4毫米的间距，从食管到四胃均匀地放置缝线，直至整个区域按图示逐点完全结扎。缝合完成后，使用生理盐水冲洗腹腔，清除所有血液及残留的胃内容物。然后用丝线缝合腹壁，用金属夹闭合皮肤，建立混合反流模型。暴露食管胃连接部后，如前所述，轻柔分离食管背侧与食管后方血管之间的组织，在食管与血管之间插入一小棉签。然后在胃食管交界处做两个5 mm的纵向切口，并在十二指肠近端靠近幽门的对系膜缘处做两个5 mm的纵向切口。接着使用间断的ATO聚丙烯缝线，在背侧放置3至4针，在腹侧放置2至3针，将切口进行吻合，确保黏膜与黏膜准确对合。随后剪除切口尖端，用生理盐水冲洗腹腔，并按照前述方法关闭腹壁和皮肤，以建立十二指肠反流模型。在制备好如上所述的混合反流模型后，小心抬起胃部以暴露组织背面，随后暴露食管背侧的血管，结扎并切断这些血管，在幽门处结扎并切断十二指肠，同时结扎并切断肠系膜。然后完整切除整个胃，用生理盐水冲洗腹腔，并缝合腹壁和皮肤。每次手术完成后，将动物置于加热垫上并进行监测，直至其完全苏醒。术后四周，食管上皮的组织结构将表现出由反流引起的损伤，如上消化道的这些图像所示。在胃混合性或十二指肠反流的小鼠中，与对照组动物相比，上皮增厚，乳头延长，上皮细胞出现过度增殖，并伴有炎性细胞浸润上消化道。在反流模型中可观察到食管炎的常见体征。一旦掌握该技术，操作得当的情况下，可在20至30分钟内完成。

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