分子探针的优化，以确定细胞死亡的光合生物（铜绿微囊藻）使用流式细胞仪
2016年1月29日
微生物群含有大量细胞的异质性，它可以决定整体行为。通过流式细胞分子探针分析可以决定细胞的生理状态，然而它的应用物种之间变化。本研究提供了一个协议，以精确地确定一个蓝藻群体内的细胞死亡，而不低估或记录假阳性结果。
该程序的总体目标是演示如何使用流式细胞术和分子探针创建可以有效分析蓝藻生理状态的方案。该协议可以帮助回答有关微生物群落细胞生理学的关键问题。该程序的主要优点是优化的荧光探针方案可以在单个细胞水平上实时区分蓝藻的生理状态。
演示该程序的是伯恩茅斯大学细胞术实验室的博士生 David Hartnell。在开始实验之前，将空溶血管放在样品注射探针上。单击 unlog。
然后反冲洗以开始流式细胞术清洁过程。在反冲洗结束时，将含有 2 毫升超纯过滤水的新溶血管装到样品进样探针 （SIP） 上，并将时间限制为 10 至 15 分钟，并将流液速度设置为快速。接下来，选择一个新的数据单元，并设置相关的荧光和光散射阈值以减少背景噪声。
然后单击 run。如果每秒事件总数不少于制造商的建议，则快速运行 2 毫升去污溶液 2 分钟。并重复反冲洗和超纯水冲洗步骤。
为了制备原代铜绿分枝杆菌单一培养物，将 98 毫升超纯过滤水与 2 毫升藻类培养基混合，在 250 毫升烧杯中在 120 摄氏度下高压灭菌 20 分钟。当培养物处于高稳态密度时，通过涡旋解聚 2 mL 细胞。然后将细胞转移到样品注射探针下。
通过光学显微镜确认细胞均匀分散。然后在流式细胞仪软件上选择一个直方图来记录前向光散射数据。然后单击 log 以在 x 轴上以对数刻度查看数据。
在单独的输出中，设置另一个对数轴直方图以记录铜绿分枝杆菌细胞的自然荧光。接下来，选择可以激发藻蓝蛋白的光源，以及可以过滤所得荧光的发射光的检测器。要以最高分辨率记录，请选择最接近目标生物体核心大小的设置。
并设置一个相对较慢的流速。在采集数据之前，设置一个阈值以屏蔽由电子背景噪声或细胞样品碎片引起的任何光散射和荧光信号。然后选择一个新的数据单元格。
在对数刻度上创建具有前向和侧向散射参数的密度图，然后单击 Run。现在将前向光散射和自然荧光门应用于前向并排散射数据，以排除任何低水平散射信号，并仅包括较高的相对荧光藻蓝蛋白信号。然后收集事件直到样本完成，并使用数据确定初始单元计数。
为了优化分子探针细胞摄取，将先前制备的单一培养物的一半暴露在适当的条件下以产生死对照。检查样品微环境中的变化以确认培养物的死亡。然后像刚才演示的那样分解菌落形成。
接下来，选择一个 488 纳米激光器和一个可以记录绿色和橙色核酸探针荧光的检测器。以及 640 纳米激光器，用于通过各自的检测器记录藻蓝蛋白信号。在新数据表中，设置具有前向和侧向散射参数的密度图。
然后使用相应的 Molecular Probe 光学检测器通道创建一个直方图。一个用于检测藻蓝蛋白发射的直方图和一个用于前向散射事件的直方图，均在对数刻度上。使用不同的浓度和孵育时间运行蓝藻样品。
在前向散射直方图中创建一个门，以仅包含目标生物体细胞大小的事件。并将其应用于相应的荧光探针通道。接下来，在荧光探针通道中，针对直方图中的最高峰创建另一个包含软件门。
随后将相应的阳性探针荧光设门到密度图上。将荧光信号的数量与死亡对照细胞的数量进行比较，其中不产生非特异性染色的细胞核酸探针摄取百分比最高。为了测试来自内源性或非特异性细胞染色的荧光干扰重叠，请选择 50% 活细胞和 50% 死细胞混合培养数据。
并移除荧光门。应用门以仅包括藻蓝蛋白通道直方图上目标生物体细胞大小的前向散射直方图。设门最高和最低藻蓝蛋白峰，并分别标记它们 live 和 dead。
然后分别将门应用于活和死藻蓝蛋白信号。并记录两个平均波长。为了确定方案的灵敏度，将阳性死分子探针荧光的平均波长与内在非特异性实时信号的比率进行比较。
最后，选择优化的方案，其中染色的死细胞量最高，未发生非特异性染色。在这些图表中，显示了指数期铜绿分枝杆菌批次培养物的细胞大小和内部复杂性的代表性前向和侧向光散射输出。可以通过优化前向光散射输出的某些点之间的数据来执行门控。
藻蓝蛋白在被红光源询问时会产生强信号，可用于进一步对感兴趣的群体进行门控。然后，可以从前向光散射和荧光信号中，将数据从原始输出选通到铜绿分枝杆菌样品上的特定数据，以进行最终细胞计数。当活的、色素含量较高的对照和死的色素含量较低的对照混合时，自发荧光的递减变化变得明显。
在膜受损的细胞中，核酸探针产生额外的信号，该信号可以通过流式细胞术观察到，并通过落射荧光显微镜进一步确认。活细胞和死细胞之间的荧光鉴别在 0.05 和 0.5 微摩尔浓度之间随着时间的推移而增加，但在 1 到 100 微摩尔浓度之间降低。事实上，绿色核酸探针的最佳浓度似乎是 0.5 微摩尔，孵育时间为 30 分钟。
对于橙色核酸探针，最佳浓度为 1 微摩尔，孵育 10 分钟。一旦掌握，对于每个分子探针，如果执行得当，优化可以在一天内完成。在尝试此过程时，请务必记住将探针保存在稳定的环境中，并处于适当的温度、pH 值和光照条件下。
经过开发，这项技术为微生物学领域的研究人员探索浮游植物群落异质性铺平了道路。观看视频后，您现在应该对如何使用流式细胞术和分子探针开发评估细胞生理学的最佳方案有了很好的了解。不要忘记，使用分子探针和有毒生物可能非常危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的 P.P.E，并充分了解 COSHH 材料。
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概述
本研究提出了一种使用流式细胞术和分子探针分析蓝藻生理状态的协议。该方法旨在准确确定微生物种群中的细胞死亡率，解决细胞异质性的挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 流式细胞术
背景
- 微生物种群表现出显著的细胞异质性。
- 流式细胞术可以评估生理状态，但因物种而异。
- 准确测量细胞死亡率对于理解微生物群落至关重要。
- 优化的荧光探针可以增强单个细胞水平的分析。
研究目的
- 开发一种可靠的协议来评估蓝藻生理。
- 提高细胞死亡率确定的准确性。
- 促进蓝藻生理状态的实时分析。
使用的方法
- 用于细胞分析的流式细胞术。
- 区分生理状态的分子探针。
- 协议优化以获得准确结果。
- 由流式细胞实验室的博士生进行演示。
主要结果
- 该协议有效地区分蓝藻的生理状态。
- 实现了细胞死亡率的准确确定。
- 实时分析提供了对微生物行为的洞察。
- 结果支持对蓝藻种群的理解。
结论
- 开发的协议增强了蓝藻生理分析。
- 它解决了之前测量细胞死亡率的局限性。
- 这种方法可以应用于各种微生物研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of cellular viability in microbial systems supports early-stage target validation by enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking. Flow cytometry with optimized molecular probes provides quantitative, single-cell resolution data that improves predictive confidence in lead identification campaigns. This approach addresses heterogeneity challenges in discovery biology, facilitating data-driven go/no-go decisions and reducing late-stage biological risk in antimicrobial or anti-infective pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing viable from non-viable cells in microbial populations.
- Operational Value: Supports functional target validation through membrane integrity assessment using SYTOX Green and SYTOX Orange probes.
- Predictive Value: Optimized probe concentrations (0.5 µM green, 1.0 µM orange) minimize false negatives and non-specific staining, enhancing assay reliability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence readouts for high-throughput compound screening in antimicrobial discovery.
- Quantitative Output: Enables precise measurement of probe uptake as a dependent variable for dose-response modeling.
- Scalability: Protocol optimization in Microcystis aeruginosa provides a transferable framework for other cyanobacterial or microbial systems.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports preclinical modeling of antimicrobial efficacy by quantifying compound-induced mortality in target pathogens.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viability screening to preclinical validation through consistent, flow cytometry-based endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in lead optimization by providing real-time, single-cell physiological data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by correlating compound treatment with changes in cellular viability.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through optimized probe incubation and concentration parameters.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence measurements enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking membrane integrity readouts to compound mechanism of action.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytometry platform applicable across microbial targets in anti-infective programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false viability readings through probe optimization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories via defined probe concentrations and incubation times.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds lacking target-specific activity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds with genuine antimicrobial effects versus assay artifacts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and fluorescence compensation for multi-parameter detection.
- Dependent on access to flow cytometers with 488 nm laser compatibility and appropriate detection channels for SYTOX dyes.
- Necessitates cross-team protocol standardization to ensure consistent probe handling, storage, and application.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to Gram-positive or Gram-negative bacterial models.
- Includes practical limitations such as probe toxicity and the need for biosafety containment when working with toxic organisms like Microcystis aeruginosa.
