Name: 利用酶生物传感器的量化内源性ATP或H 2 0 2在肾脏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 了解酶生物传感器技术用于实时测量肾脏组织中内源性ATP和过氧化氢浓度的方法。该技术通过离体和在体传感器安装，帮助研究人员深入理解肾脏细胞信号传导机制。

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感谢Sarissa Biomedical在开发本论文所用传感器方面所做的工作。本研究得到了美国国立心肺血液研究所基金HL108880（A. Staruschenko）、&#160;HL116264（A. Cowley）和HL122662（A. Staruschenko和A. Cowley）、&#160;由威斯康星医学院研究事务委员会资助的项目#9306830（O. Palygin）以及&#160;Advancing a Healthier Wisconsin研究与教育项目&#160;#9520217的支持，同时也获得了美国肾脏基金会青年研究者奖（O. Palygin）的资助。

以下动物&#160;实验操作 &#160;遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物的护理和使用指南》。实验前已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。 
注意：在实验设计阶段以及使用传感器之前，应仔细查阅传感器制造商的使用说明&#160;。遵循这些说明可确保传感器使用时获得最佳结果&#160;。
1. 传感器校准
<ol>
	<li>在实验开始前配制新鲜的储备液。</li>
	<li>配制含10 mM NaPi缓冲液、100 mM NaCl和1 mM MgCl的缓冲液A2，以及 2 mM 甘油。使用 NaOH 将 pH 调至 7.4。于 2–8 °C 保存。</li>
	<li>使用储存于 -20 °C 的 100 mM ATP 储存液，取 10 µl 加入 90 µl 缓冲液 A 中，配制新鲜的 10 mM ATP 校准溶液。</li>
	<li>通过将ATP传感器的尖端放入溶液中使其复水图2) 置于含有缓冲液A的复性室中，在2-8 °C下孵育至少10分钟。 
	注意：之后&#160;复水过程中，传感器暴露在空气中的时间不应超过20秒&#160;或传感器灵敏度可能降低。若预计传感器将长时间暴露于空气中，可将其短暂浸入甘油溶液中。传感器可用于多次实验，但必须在传感器重新水化当天完成。传感器可在含有缓冲液A的水化室中储存最多24小时。</li>
	<li>打开双通道恒电位仪（图3并启动记录系统软件。</li>
	<li>用3 ml缓冲液A配制校准室。将参比电极放入校准室中。从复水室中取出每个传感器，将其连接至操纵器，并插入校准室溶液中。 
	注意：使用标准硅胶涂层培养皿作为校准室。所有校准和实验均应在法拉第笼内、高性能实验室气浮台上进行，以减少安培法记录过程中的信号噪声。图4校准最好在数据采集开始前尽快进行。对于 体内 应用方面，校准的最佳时间是在动物术后恢复期间。</li>
	<li>离体 校准
	<ol>
		<li>在标定室中进行循环伏安法，以100 mV/s的扫描速率在-500 mV至+500 mV范围内对传感器进行10次循环扫描。此步骤可显著提高传感器的灵敏度。参见 图5 10个循环中观察到的痕迹。</li>
		<li>在最后一次循环后将传感器极化至 +600 mV。传感器电流将衰减至渐近线。至少等待 5 分钟后获得稳定读数。记录零点读数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在体 传感器校准
	<ol>
		<li>不要对循环伏安法进行&#160;体内 传感器。相反，应在校准室中将传感器在+500 mV下极化30秒。然后将恒电位仪设为0 mV，使传感器电流上升至稳定值。传感器电流至少需要2分钟才能达到稳定。记录零点读数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>依次向反应室中加入定量的ATP溶液，以产生&#160;一条涵盖所需检测范围的校准曲线。ATP 溶液最初会在传感器信号中产生一个明显的峰，随后随着 ATP 在腔室内均匀扩散，信号逐渐衰减。每次加入 ATP 后，待信号水平稳定时记录信号值。 图6A和图7 显示两种情况下的痕迹及建议的ATP浓度 离体 和 体内 研究，分别。 
	注意：使用分析物清除剂验证电极的选择性非常重要。本方案采用apyrase检测ATP传感器的特异性，采用catalase检测H2O2 信号图6B如果需要给药，应在研究开始前测定药物与传感器之间的反应活性。</li>
	<li>加入3 µl浓度为2 mg/ml（89 UN/mg）的apyrase，以检测ATP传感器的特异性（ATP作用产生的电流应降至零水平）图7).</li>
	<li>向体系中加入 3 µl 过氧化氢酶（浓度为 2 mg/ml，100 UN/mg 的储备液），以检测零传感器的特异性（由 H 产生的电流）2O2 应用应归零读数。</li>
</ol>
2. 用于传感器研究的动物手术
<ol>
	<li>外科手术 离体
	<ol>
		<li>使用异氟烷（5%诱导，1.5%至2.5%维持）与医用级氧气对实验动物进行麻醉2 或另一种经批准的方法。 15’ 12 需持续监测动物以确保麻醉水平适当。通过呼吸频率稳定和脚趾夹捏反应来确认麻醉效果是否合适。 
		注意：根据批准的IACUC规程对动物实施安乐死。在完成所有非存活性操作后，通过对深度麻醉的动物进行开胸术以诱发气胸，确保动物人道死亡。12.</li>
		<li>将大鼠仰卧位置于温控手术台上。在维持适当麻醉深度的同时，沿左肾位置做一条长约5 cm的正中切口，暴露腹主动脉远端。</li>
		<li>在腹腔干动脉和肠系膜上动脉以及这些动脉上方的腹主动脉周围环绕结扎线，但不进行结扎。在肾动脉下方的腹主动脉周围环绕两根结扎线。</li>
		<li>夹闭腹主动脉位于结扎线以上的部分。结扎下方的结扎线。使用聚乙烯导管（PE50）插管腹主动脉。用第二条主动脉结扎线固定导管。</li>
		<li>移除夹子，结扎肠系膜动脉和腹腔动脉。以室温的Hanks平衡盐溶液以6 ml/min的速度灌注肾脏2-3分钟，直至肾脏完全变白。</li>
		<li>切除肾脏及带有导管的主动脉连接部分，将肾脏置于盛有3 ml灌流液的培养皿中。 
		注意：实验方案可在室温下进行。灌流液（浴液）包含（单位：mM）：145 NaCl，4.5 KCl，2 MgCl₂2，1 CaCl2，10 HEPES，用 NaOH 调节 pH 至 7.35。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外科手术 体内
	<ol>
		<li>使用经IACUC批准的方案对大鼠进行麻醉。对于 体内 分析 使用氯胺酮（20 mg/kg）麻醉大鼠 i.m.）和放线菌素（50 mg/kg） i.p.). 必须持续监测动物以确保麻醉水平适当。通过稳定的呼吸频率和脚趾夹捏反应来确认麻醉效果。</li>
		<li>在达到适当的麻醉深度后，将大鼠仰卧置于气浮台上的温控接地表面。该表面应预先加热并维持在36 °C。</li>
		<li>在维持适当麻醉深度的同时，沿肾脏位置做一条长约5 cm的正中切口。</li>
		<li>使用缝线牵拉并固定皮肤和皮下组织，以充分暴露整个肾脏。将肾脏置于肾杯中，以尽量减少任何运动伪影。</li>
		<li>通过颈静脉以每100克体重每小时1毫升的速度输注2% BSA: 0.9% NaCl溶液，以维持血容量。插管双侧输尿管以收集尿液。在肠系膜上动脉、腹腔动脉及远端主动脉周围放置结扎线，用于调节肾灌注压。图10A).</li>
		<li>如果在实验过程中需要使用药理学试剂 体内 实验建议插入间质导管（图10B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据采集设置
<ol>
	<li>打开数据采集程序，并将两个通道的极性设置为 离体 和 体内&#160;将实验设置为阳极正极。将程序设为以ASCII码格式保存数据。</li>
	<li>将显微操作仪定位，以便快速将传感器插入肾脏。 
	注意：也可使用连接至显微操作仪的假探针，以帮助将传感器放置到理想位置。</li>
	<li>离体 数据采集
	<ol>
		<li>通过插管的主动脉以650 µl/min的恒定流速用灌流液（来自2.1.6）灌注肾脏。使用手术剪小心去除肾包膜，这是插入传感器所必需的步骤。</li>
		<li>用橡皮筋将肾脏固定，橡皮筋需跨过肾脏并用图钉固定在硅胶包被的培养皿上。</li>
		<li>将参考电极置于培养皿中靠近肾脏的位置，电极尖端浸入缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体内 数据采集
	<ol>
		<li>将肾脏放入肾杯中。根据动物的品系和年龄，选择大小合适、能使肾脏松散放置的肾杯。 图8 显示两种不同尺寸的肾杯。类似的肾杯用于多种生理学研究方法，旨在分析肾功能，例如微穿刺等。16. 
		注意：肾杯的位置对于消除动物呼吸产生的机械噪音至关重要，但不应干扰或&#160;阻断肾脏灌注或尿液流动。</li>
		<li>静置45分钟&#160;恢复时间后，再进行数据采集。</li>
		<li>使用26-30G针头在肾脏中传感器所需的位置和深度处刺出一个穿刺孔。用吸水纸擦拭表面穿刺孔以去除&#160;渗出的血液。将甘油溶液滴加至肾脏表面，以防止实验过程中肾脏表面干燥。</li>
		<li>从复水室中取出第一个传感器，并将其连接到显微操作器上。迅速地（20秒内）将电极插入肾脏中新制备的孔洞中。对无效传感器重复步骤3.5–3.9。</li>
		<li>将参考电极插入肾脏，距离传感器约1 cm处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开恒电位仪，并启动计算机上的记录程序。 图9 显示最终的装置设置 离体 肾脏数据采集 图10 显示最终的设置情况 体内 插入导管后的肾脏数据采集。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>将 ASCII 数据文件导入 Origin 或其他类似软件中。</li>
	<li>浓度-电流关系
	<ol>
		<li>使用线性拟合/外推功能，建立 ATP 或 H2O2 校准点的浓度（x轴）与电流（y轴）之间的线性关系（图6和图7）。 
		线性拟合直线：y = mx + b</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将&#160;电流值换算为浓度</li>
	<li>将空白传感器测得的信号轨迹从 ATP 传感器的信号轨迹中扣除，以获得由细胞内 ATP 产生的实际电流。</li>
	<li>利用 4.2.1 节所述的校准方程，将安培法测得的 ATP 电流值（pA）转换为 nM。通过将每个校正后的电流值代入方程中的“x”值，并求解 y（待测物浓度），确定 ATP 传感器扣除后数据轨迹的浓度。</li>
	<li>如有需要，可类似地根据 H2O2 的校准方程计算其浓度。</li>
</ol>

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</ol>

本手稿视频录制所用传感器由英国考文垂Sarissa Biomedical Limited公司提供。

本方案旨在提高对ATP和H的时空分辨率2O2 信号传导用于 离体 分离、灌注并 体内 灌注血液的肾脏。本研究所采用的不同实验方案与传感器之间的差异，可为药理学或生理学研究提供最佳的数据采集效果。这些方案包括：1）传感器校准，2）手术操作，3）数据采集设置，以及4）数据分析。它们能够实现对多种实验条件下分析物的实时测量，从而有助于深入理解肾脏疾病，并推动更有效的药理治疗策略的开发。本文中，我们使用传感器分析了ATP和H2O2。然而，也可使用针对其他物质的传感器。本文所述方案已用于研究ATP和H2O2 在大鼠肾脏中，但该方法可轻松调整后应用于小鼠。鉴于存在大量遗传学啮齿类动物模型，该方法具有广阔的应用前景。
酶促微电极生物传感器的基本设计由 Clark 和 Lyons 于 20 世纪 60 年代提出2。在生物传感器初步发展之后，其设计17-19和应用20均...

酶促微电极生物传感器（本文中也简称为传感器）已成为研究活细胞和组织中动态信号过程的有力工具。这些传感器能够以生物学相关的浓度水平，提高对细胞信号分子在时间和空间上的分辨率。与在较长时间内分时段采集并分析细胞外液样本的传统方法不同，这些传感器的响应速度与其酶对分析物的反应速度相当，从而实现对目标物质的实时检测1,2。快速检测自分泌和旁分泌因子（如嘌呤或过氧化氢）在组织间隙中的浓度及其释放动力学，可用于建立药物在正常和病理条件下作用效应的特征谱型3。目前，传感器的应用主要集中在脑组织切片和细胞培养体系中4-10。本文详述的实验方案旨在建立在完整肾脏中准确测定分析物实时浓度的方法。
以下方案旨在研究间质ATP和H2O2 肾脏中的信号传导。在肾脏的天然环境中，细胞外ATP会通过内源性外核苷酸酶迅速降解为其衍生产物（ADP、AMP和腺苷）。此处使用的传感器对ATP具有高度选择性，可区分其他嘌呤类物质或ATP的降解产物。11这具有显著优势，因为它能够准确监测ATP释放的恒定和动态浓度及其信号功能。通过结合使用两种微电极——ATP传感器和零位传感器（Null sensor）——来测定间质ATP浓度。其中，零位传感器用于&#160;与……联用&#160;过氧化氢酶应用能够检测间质H2O2 浓度12以下方案使用两种不同设计的传感器，其特性分别对以下方面达到最优 离体 或 体内 应用。
两种设计均基于传感器酶层中甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶的顺序催化反应，且&#160;由ATP的存在驱动。在所使用的传感器组中&#160;离体 研究，H2O2，通过检测最终的酶促反应产物&#160;铂/铱（Pt-Ir）丝电极上的氧化反应。用于 体内 研究则基于 H2O2 在专为血液灌注组织设计的介体涂层金电极上的还原反应。如图所示 图1 是本手稿中所述两种方案的示意图。Null传感器与其对应的ATP传感器完全相同，唯独缺少结合的酶。因此，除了可检测H2O2 通过过氧化氢酶，Null传感器可检测非特异性干扰。ATP浓度通过减去Null传感器检测到的非特异性干扰和背景H2O2 来自ATP传感器信号。目前市面上还可提供多种商用传感器，用于检测其他分析物，包括腺苷、肌苷、次黄嘌呤、乙酰胆碱、胆碱、谷氨酸、葡萄糖、乳酸和D-丝氨酸。 离体 腺苷、肌苷和次黄嘌呤的应用 体内&#160;与相应的Null传感器配对时。
传感器准确检测分析物的能力&#160;取决于正确的使用前和使用后校准13。这可确保分析过程中考虑到传感器在生物组织中使用时灵敏度发生的漂移。传感器内部含有甘油储存库，该储存库作为传感器酶促反应中的试剂使用。如果传感器未在含有甘油的浴液中使用，甘油会随时间逐渐流失，因此需要缩短记录时间以尽量减少传感器的漂移。此外，内源性蛋白酶和蛋白质片段对传感器的污染会显著降低其灵敏度14。
本论文建立了使用酶促微电极生物传感器的方法 离体 和 体内 肾脏样本制备。实时分析物定量可提供前所未有的细胞信号传导细节，有助于揭示肾脏疾病机制及药理学药物作用的新见解。

<table><tbody><tr><td>传感器套件</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>该套件包含储存瓶、再水合室、电极导线和参比电极。&amp;nbsp; 套件还包含用户自选的传感器。</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP 生物传感器 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>使用前于 2–8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP 生物传感器 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>使用前于 2–8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存</td></tr><tr><td>Sarissaprobe 空白传感器 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>使用前于 2–8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存</td></tr><tr><td>Sarissagold 空白传感器 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>使用前于 2–8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP 使用手册</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>法拉第屏蔽笼&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双通道恒电位仪</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>II 型法拉第屏蔽笼</td></tr><tr><td>数据采集程序</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>灌流泵</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Model R99E</td><td></td></tr><tr><td>光纤照明器</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器磁性支架</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>防震台</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷呼吸机</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26–30 G</td></tr><tr><td>固定针</td><td></td><td></td><td>标准解剖固定针</td></tr><tr><td>导管</td><td></td><td></td><td>聚乙烯管（PE50）</td></tr><tr><td>导管组织胶</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>橡胶圈</td><td></td><td></td><td>任意宽度为 2–4 mm 的橡胶圈</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>夹具</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>标准解剖工具包</td><td></td><td></td><td>套件应包含手术刀和解剖剪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>肾杯</td><td></td><td></td><td>自行设计</td></tr><tr><td>标准化学试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP 溶液</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>腺苷三磷酸酶（Apyrase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶（Catalase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥（inactin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（ketamine）</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks 平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

使用酶生物传感器定量肾脏内源性atp或h2o2

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

酶促微电极生物传感器已被广泛用于实时测量细胞外信号。其应用大多局限于脑切片和神经元细胞培养。最近，该技术已拓展至完整器官。传感器设计方面的进步使得 &#160;尽可能地进行测量&#160;血液灌流中的细胞信号传导 体内 肾脏。本方案列出了测量ATP和H2O2 大鼠肾间质中的信号传导。采用两种不同的传感器设计用于 离体 和 体内 方案。两种类型的传感器&#160;涂覆有&#160;在选择性渗透层上方构建一层薄薄的酶促生物层，以实现快速响应、高灵敏度和高选择性的生物传感器。选择性渗透游戏副本层可保护信号免受生物组织中干扰物质的影响，而酶促层则利用&#160;在ATP存在下，甘油激酶与甘油-3-磷酸氧化酶依次催化的反应生成H2O2. 用于该实验的一组传感器 离体 研究进一步通过氧化 H 检测分析物2O2 在铂/铱（Pt-Ir）丝电极上。用于&#160;体内 研究则基于H的还原反应2O2 在专为血液灌注组织设计的介质包被金电极上。终浓度 变化&#160;通过实时安培法检测，并通过已知分析物浓度进行校准。此外，可通过添加分解H₂O₂的酶（如过氧化氢酶）和分解ATP的酶（如apyrase）来验证安培信号的特异性。2O2 以及相应的ATP。这些传感器在每次实验前后都高度依赖精确的校准。以下两个方案建立了实时检测ATP和H2O2 在肾脏组织中，并可进一步改进以将所述方法扩展应用于其他生物样本或完整器官。

酶促微电极生物传感器的设计可实现对完整肾脏中分析物的实时检测. 任一实验的总体设计 离体 或 体内 研究中的应用如图所示 图1所使用的传感器和手术步骤取决于研究的具体情况 离体 或 体内.
为获得可重复的结果，准确的实验前和实验后校准至关重要。 图6A 显示了从信号中观察到的代表性轨迹 离体 ATP传感器在校准过程中的表现。注意，apyrase迅速消除了ATP信号。过氧化氢酶对ATP信号无影响，表明其对H2O2 它产生（图6B）。校准程序产生一个线性拟合，用于计算ATP的动态变化（图6A，右侧面板). 在体 传感器校准产生的轨迹与……的轨迹相似 离体 传感器。然而，该传感器检测的是还原电流而非氧化电流，因此产生的电流为负值。这些传感器的校准在0.3至 80 µM ...

酶法微电极生物传感器能够实时检测生物相关浓度下的细胞外信号分子。以下方案将生物传感器的应用扩展到肾脏中三磷酸腺苷（ATP）和过氧化氢（H2O2）的离体（ex vivo）和在体（in vivo）检测。

使用酶生物传感器定量肾脏内源性ATP或H2O2

酶促微电极生物传感器已广泛用于实时测量细胞外信号。其应用大多局限于脑组织……

这些操作的总体目标是测量完整肾脏中内源性间质中TP和过氧化氢的实时浓度。首先，将传感器用已知浓度的TP和过氧化氢进行再水化和校准，以用于离体和在体应用。对于离体传感器安装，需对手术器械化的肾脏进行血液清除处理。该操作通过主动脉灌注冲洗肾脏来完成。随后将大鼠肾脏手术分离，置于记录室中并用生理盐水灌流。在活体实验过程中，使用离体传感器检测三磷酸腺苷（ATP）和过氧化氢。 进行切口以暴露血流灌注的肾脏。将肾脏置于恒温固定器中，并可插入间质导管用于给药。进一步使用活体传感器测量肾间质内的ATP和过氧化氢浓度。最终，这些方案有助于利用酶促微电极生物传感器对肾脏间质中的ATP和过氧化氢进行实时测量。酶促生物传感器的主要优势在于能够直接测定生物组织中内源性间质物质的浓度。本文中，该技术被用于检测离体灌注肾脏或在体状态下肾脏间质中的ATP和过氧化氢浓度。酶生物传感器的高精度可实现对细胞外ATP或过氧化氢浓度的基础水平及动态调节进行实时测量。这些测量可用于建立不同功能区域肾脏的药物应用或疾病特征谱。将ATP传感器和空白传感器的探头分别置于含有缓冲液A的再水化室中，在2至8摄氏度下孵育至少10分钟，以完成再水化。打开双通道电位计并启动记录系统软件。将程序设置为以 ASCII 码格式保存数据，并将传感器极性设为阳极正极。准备一个含有三毫升缓冲液的校准室，将参比电极插入该室中。将每个传感器从再水化液中取出，固定到显微操作器上，并插入校准室溶液中。所有校准和实验均需在法拉第屏蔽笼内的高性能实验室气浮台上进行，以减少信号噪声。在进行高温测量记录期间，对校准室中的离体传感器执行循环伏安遥测。以每秒100毫伏的速率，将传感器从负500毫伏循环至正500毫伏，共进行10个循环，这将显著提高传感器的灵敏度，随后将传感器极化至正600毫伏。最后一个循环结束后，传感器电流将衰减至一个渐近值。至少等待五分钟以获得稳定的读数。连续记录零点读数，然后依次向检测室中加入一定量的三磷酸盐（TP）溶液，以绘制涵盖ATP传感器所需检测范围的校准曲线。加入ATP溶液后，传感器信号最初会出现一个明显的峰值，随后随着ATP在腔室内均匀扩散而逐渐衰减。应在信号水平稳定后记录信号值。每次添加ATP时，向样品中加入3 µL浓度为2 mg/mL的ATP原液，以检测ATP传感器的特异性。在向检测室连续加入设定量的过氧化氢溶液以生成涵盖检测范围的校准曲线时，应记录电化学信号归零后的电流值，每次信号稳定后均需记录一次。每次加入过氧化氢时，需添加3微升浓度为2毫克/毫升的牛血清白蛋白溶液，以测试零传感器的特异性。在离体研究中，加入过氧化氢后所产生的电流应降低至零读数水平。在腹腔干动脉、肠系膜上动脉以及这些动脉上方的腹主动脉周围结扎雷帕（Rapa）线。但在肾动脉下方的腹主动脉处不要结扎两道结扎线。在肾动脉远端下方结扎腹主动脉。在结扎线以上至少一厘米处及肾动脉以下夹闭主动脉。在最低位结扎线与夹子之间的腹主动脉段插入聚乙烯导管。用第二道主动脉结扎线固定导管。移除夹子，结扎肠系膜动脉和腹腔动脉以及这些动脉上方的主动脉。以室温的Hank's平衡盐溶液以每分钟6毫升的速度灌注肾脏2至3分钟，直至肾脏完全变白。此外，可插管肾静脉以收集流出液体。使用手术镊子小心去除肾包膜，这是传感器插入所必需的步骤。切除肾脏，包括与主动脉相连的导管部分。将肾脏放入盛有灌流液的三毫升培养皿中。通过插管的主动脉以每分钟650微升的恒定速率用灌流液灌注肾脏。用橡皮筋固定肾脏，橡皮筋跨过肾脏并用针固定在硅胶包被的培养皿上。将参考电极置于培养皿中靠近肾脏的位置，其尖端浸入灌流液中。调整显微操作器，以便快速将传感器插入肾脏。或者，可在每个显微操作器上安装假探针，以帮助确定各传感器的理想放置位置，每次操作持续时间不超过20秒。从复水室中取出传感器，将其连接至显微操作器，并将传感器插入培养皿的灌流液中。若预计暴露于空气中的时间较长，每次暴露时应将传感器短暂浸入甘油溶液中。使用恒电位仪将传感器极化至正600毫伏，并使电流达到稳定。将每个传感器推进至肾脏相同深度。根据文本方案进行数据分析。酶微电极生物传感器的设计可实现对分析物和完整肾脏的实时检测，以获得可重复的结果。准确的实验前后校准至关重要。该图展示了 X pvo、TP 传感器和零传感器在 TP 传感器校准过程中产生的信号的代表性轨迹。校准程序通过线性拟合来计算 TP 的动态变化。零传感器通过向浴液中添加已知浓度的过氧化氢进行校准，并记录 asim 至 am 的参数值。向浴液中添加催化剂会导致电流迅速衰减。体内传感器产生类似的信号曲线，但检测的是还原性电流而非氧化性电流，因此电流为负值。校准结果在0.3至80微摩尔范围内呈现线性拟合。此处展示了该体内传感器对三磷酸盐（TP）相对于其他嘌呤类产物的特异性。本图显示了血管紧张素II诱导的、在来自盐抵抗性和盐敏感性大鼠的离体肾脏间质中内源性过氧化氢浓度的变化。血管紧张素II可诱导双侧肾脏急性释放过氧化氢。然而，盐敏感型大鼠肾脏中的最大释放幅度显著升高，尤其是在摄入高盐饮食的情况下更为明显。在进行该操作时，需注意传感器尖端和肾皮质表面较为脆弱，任何一方受损均会影响记录的准确性。观看本视频后，您应能够充分理解如何测量内源性物质以及肾脏等完整器官。您还将能够准确执行校准操作以及成功记录所必需的手术步骤。我们已应用此方法研究了肾脏中 TP 和过氧化氢的基础水平及其释放情况。然而，当使用相应的传感器时，该方法也可用于测定腺苷、谷氨酸、葡萄糖及某些其他物质的浓度。

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利用酶生物传感器的量化内源性ATP或H<sub&gt; 2</sub&gt; 0<sub&gt; 2</sub&gt;在肾脏

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