修改一个Colliculo - 丘脑鼠脑切片，收纳室部件的3-D打印和多尺度光学成像
September 18th, 2015
利用多角度切割鼠标小狗大脑，我们在提高先前描述的急性脑切片捕捉之间最重要的听觉脑和前脑结构的连接。
该程序的总体目标是准备具有四个主要听觉结构的 Calot Thal 皮质切片，即下结肠、听丘脑、丘脑网状核的听觉部分和听觉皮层。这是通过首先从鼠标中取出大脑来实现的。第二步是阻断大脑，为切片做准备。
接下来，切开大脑以获得包含 Calot thal 皮质连接的切片。最后一步是使用黄素蛋白成像来评估连通性。最终，包含颈椎皮层连接的脑切片可用于各种实验，以更好地了解中脑和四脑听觉区域的信息处理这种方法的视觉演示至关重要，因为在切片前阻断大脑的步骤很难学习，因为它需要复杂的双角度切割， 这是获得完整投影的关键。
演示该技术的是我实验室的研究生 BJ Slater，为了准备切片的切割阶段，切下一小块大约 1 立方厘米的 3% 螺旋钻用作大脑的后挡块，另一块 1.5 厘米 x 1.5 毫米 x 3 毫米用作凸起以支撑下丘。接下来，用氰基丙烯酸酯胶粘剂将逆止器粘在舞台上，然后将逆止器右侧的凸起粘上，使它们在载玻片上形成 80 度角，从左上到右下有两条 90 度线和一条 17 度对角线，将大脑背侧向上放在两条线的交点处。使用剃须刀片，去除大脑喙端的 2 到 4 毫米，以形成一个平坦的表面。
接下来，将 brain coddle 的一面朝上放在新创建的平面上。将大脑的背表面与水平线对齐，将大脑的中线与幻灯片上标记的垂直线对齐。然后将剃须刀片与 17 度线对齐。
将剃须刀倾斜 30 度角，以双对角线切割方式去除大约 3 毫米的右皮层，以将大脑安装在颤音舞台上。在大脑的腹侧放置一小块滤纸，使长尺寸垂直于中线。小心地将少量氰基丙烯酸酯胶粘剂涂抹在逆止器前面和凸块左侧的区域。
随后，将双对角线切割的大脑侧放在胶水上，使大脑的 coddle 部分和后脑支撑在凸起上，而大脑的右侧靠在后挡板上。在此过程中，将切割台快速放置在颤音中，用切割解决方案构建一个舞台。接下来，将刀片与大脑的顶部对齐。
从大脑顶部移除 1 到 1.5 毫米。然后切片并去除更多 300 至 500 微米的切片，同时向更深处移动。当下丘、内侧体和外侧 ICT 核都可见时，齿状回应呈 C 形，结构应对齐。
获得约两片 600 微米的切片。这些是颈动脉皮层切片。之后，将它们转移到 32 摄氏度的保温室中。
要获取黄素蛋白自发荧光图像，请在 4 赫兹处收集图像 105 秒。用 470 至 490 纳米的蓝光照射组织，并捕获 515 纳米以上的蓝光，确保图像既不会太暗也不会过曝。然后使用电刺激激活组织以获取钙图像。
以 10 赫兹的频率收集图像 25 秒。用 365 纳米光照射组织并捕获 510 纳米以上的荧光。同样，确保图像既不会太暗也不会过曝。
然后使用电刺激来激活细胞。该图像显示了通过黄素蛋白自发荧光确认脑切片中的颈皮层连接。以 0.05 赫兹的频率对下结肠进行电刺激，以 4 赫兹和 4 a 进行成像，以显示该刺激的功率。
频率，听丘脑、丘脑、网状、核和听觉皮层被突触激活。这是一个未连接的切片。下结肠的电刺激激活仅在听丘脑中可见。
整个路径没有被捕获，可能是由于其中一个切口略微超出平面。与 Alam 皮质投影。这张图片显示了听觉皮层的非典型激活。
下结肠的电刺激激活了听觉皮层，但没有可见信号。在听觉丘脑中，丘脑很可能仍然被激活，但它不在图像表面。观看此视频后，您应该对如何获取 AAL 丘脑皮层切片以及评估其连通性有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种准备Calot Thal皮层切片的方法，重点关注小鼠大脑中的主要听觉结构。该技术增强了对听觉区域连通性的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 听觉处理
- 脑切片技术
背景
- 研究旨在探究小鼠大脑中的听觉处理。
- 重点关注四个主要听觉结构：下丘脑、听觉丘脑、丘脑网状核和听觉皮层。
- 理解这些连接对于探索听觉区域的信息处理至关重要。
- 该方法涉及复杂的切片技术以保持大脑结构。
研究目的
- 准备能够维持听觉连接完整性的脑切片。
- 促进实验，以增强对听觉信息处理的理解。
- 展示精确切割技术在脑切片制备中的重要性。
使用的方法
- 取出小鼠大脑进行切片。
- 对大脑进行阻断以准备切片。
- 进行双角度切割以获得切片。
- 使用黄素蛋白成像评估切片中的连通性。
主要结果
- 该方法成功捕捉了主要听觉结构之间的连接。
- 黄素蛋白成像显示了听觉通路的完整性。
- 证明了双角度切割在保持投射中的有效性。
- 为未来的听觉处理实验提供了一种可靠的技术。
结论
- 该研究提出了一种精细的听觉脑切片制备方法。
- 它强调了精确切割技术在神经科学研究中的重要性。
- 研究结果有助于更好地理解听觉信息处理。
常见问题
Executive Industry Relevance
Preserving colliculo-thalamocortical connectivity in mouse brain slices enables rigorous interrogation of auditory information processing across multiple brain regions. This approach supports predictive confidence in mechanistic studies by maintaining both ascending and descending pathways, critical for target validation and pathway de-risking in early discovery. The integration of 3-D printed chamber components and multi-scale optical imaging enhances reproducibility and cross-study comparability, strengthening portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional mapping of auditory circuits for mechanistic de-risking.
- Supports validation of synaptic connectivity across midbrain and forebrain structures.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of sensory information flow.
- Provides a platform for assessing the impact of cortical modulation on subcortical processing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized brain slice preparations for reproducible functional assays.
- Allows rapid assessment of connectivity using flavoprotein autofluorescence imaging.
- Supports quantitative evaluation of network activation in response to electrical stimulation.
- Enables scalable preparation of slices for compound screening or perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo auditory processing for translational continuity.
- Permits investigation of disease-relevant disruptions in auditory pathways.
- Supports biomarker discovery by linking functional activation patterns to molecular readouts.
- Facilitates risk-adjusted advancement of targets with validated circuit-level effects.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling multi-scale analysis of auditory circuits from single-slice preparations. It supports workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Provides a robust platform for testing circuit-level hypotheses and clarifying pathway function.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts of network activation for assay development.
- Analytics: Delivers optical and electrophysiological measurements to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro circuit function to in vivo sensory processing models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable preparation for diverse mechanistic and screening studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes slice preparation and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets with validated circuit engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in complex brain slicing and alignment techniques.
- Needs access to 3-D printing for custom chamber components and advanced optical imaging systems.
- Demands rigorous cross-team standardization of slicing and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or species.
- Connectivity assessment is limited by slice quality and imaging depth.
