小鼠上丘-丘脑-皮层脑片的改良制备，结合 chamber 部件的 3D 打印与多尺度光学成像

本实验的总体目标是制备包含四个主要听觉结构的丘脑皮层切片，即下丘、听觉丘脑、丘脑网状核的听觉部分以及听觉皮层。首先从实验小鼠体内取出脑组织，随后对脑组织进行修块，为后续切片做准备。

接下来，对脑组织进行切割，以获取包含丘脑皮层连接的脑片。最后一步是利用黄素蛋白成像技术来评估连接性。最终获得的包含丘脑皮层连接的脑片可用于多种实验，以更深入地理解中脑和前脑听觉区域的信息处理过程。该方法的可视化演示至关重要，因为在切片前对脑组织进行切块的步骤较难掌握，该步骤需要进行复杂的双角度切割，而这一操作是获得完整投射纤维的关键。

演示该技术的是我实验室的研究生 BJ Slater。为准备切片用的切片阶段，切取一小块约一立方厘米的3%琼脂糖作为脑组织的挡块，另取一块1.5厘米×1.5毫米×3毫米的琼脂糖作为隆起支撑结构，用于支撑下丘。接下来，使用氰基丙烯酸酯胶水将挡块粘附在切片台上，然后将隆起结构粘在挡块右侧，使两者形成一个80度夹角。在载玻片上标记两条相互垂直的直线以及一条从左上角到右下角、与水平方向成17度角的斜线，将脑组织背侧朝上放置于两条垂直线的交点处。使用剃刀刀片切除脑组织前端2至4毫米，以形成一个平坦的切面。

接下来将脑组织凸面朝上放置在新制备的平坦表面上。使脑的背侧表面与载玻片上标记的水平线对齐，脑的中线与垂直线对齐。然后将剃刀刀片与17度线对齐。

将刀片倾斜至30度角，以双斜切方式去除右侧皮层约三毫米，以便将脑组织固定在振动切片机的载物台上。在脑组织腹侧放置一小块滤纸，使其长边与中线垂直。小心地在挡块前方及凸起左侧区域涂抹少量氰基丙烯酸酯粘合剂。

随后，将双对角切割的脑组织一侧放置在胶水上，使脑的尾端部分和后脑支在凸起上托起，脑的右侧紧贴止挡。在此步骤中，迅速将切片台放入振动切片机中，并用切割液填充切片槽。接下来，将刀片与脑组织的顶部对齐。

从脑组织顶部去除1至1.5毫米的组织，然后以300至500微米的厚度继续向深部进行切片并移除多余切片。当下丘、内侧膝状体和外侧下丘核均清晰可见时，齿状回应呈现为C形，且结构应排列整齐。

获取约两片600微米的切片。这些是脑动脉皮层切片。随后，将它们转移至32°C的孵育室中。

为获取黄素蛋白自体荧光图像，以每秒四帧的速率采集持续105秒的图像。使用470至490纳米的蓝光照射组织，并采集波长超过515纳米的信号，确保图像既不过暗也不过曝。随后通过电刺激激活组织，以获取钙成像图像。

以每秒10帧的速率采集25秒的图像。使用365纳米的光照射组织，并采集510纳米以上的荧光信号。同样，需确保图像既不过暗，也不过亮。

然后使用电刺激激活细胞。该图像通过黄素蛋白自体荧光显示了脑切片中颈动脉皮层连接的确认结果。以 0.05 赫兹的频率对下丘施加电刺激，并以 4 赫兹进行成像，再经过四次处理以显示该刺激频率下的信号强度。

频率、听觉丘脑、丘脑、网状核以及听觉皮层均发生突触激活。此为一个未连接的脑片。对下丘进行电刺激时，仅在听觉丘脑中观察到激活反应。

整个通路未能被完整捕获，可能是由于其中一个切面略微偏离了平面。结合Alam皮层投射。该图像显示听觉皮层的非典型激活。

对下丘进行电刺激可在无可见信号的情况下激活听觉皮层。在听觉丘脑中，丘脑很可能仍被激活，但其位置不在成像平面上。观看本视频后，您应能够充分理解如何获取AAL丘脑皮层切片，并评估其连接性。