Name: 一个器官高通量系统原发性多发性骨髓瘤细胞的药物敏感性的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习高通量药物敏感性检测方法，通过重建骨髓微环境对原发性多发性骨髓瘤细胞进行长期无创活性定量分析。该技术可测试多种化疗药物并生成细胞存活曲线，为个性化治疗提供依据。

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本研究由佛罗里达州Bankhead-Coley团队科学基金（2BT03）、美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（1R21CA164322-01）以及莫菲特癌症中心团队科学基金资助。部分工作得到了转化研究的支持&#160;美国H.李·莫菲特癌症中心核心设施 &amp;#38; 研究所，一个经美国国家癌症研究所（NCI）指定的综合性癌症中心（P30-CA076292）。通过莫菲特癌症中心的“全面癌症治疗计划”（Total Cancer Care Protocol），得以获取原代细胞。

以下所述使用来自活检的人类细胞的研究已获得莫菲特癌症中心机构审查委员会的批准，并在位于H. Lee Moffitt癌症中心和研究机构进行的临床试验MCC# 14745下开展。
1. 从骨髓穿刺液中分选多发性骨髓瘤细胞
<ol>
	<li>用含钠肝素的注射器采集患者骨髓穿刺液（20 ml）。</li>
	<li>将骨髓液用无菌 PBS 等体积稀释后，置于无菌水相密度梯度介质上，以 400 × g 离心 30 分钟，室温下分离单个核细胞。</li>
	<li>收集界面层细胞，其中含有单个核细胞。用预冷的 PBS 洗涤细胞，并使用台盼蓝染色法通过血细胞计数板或自动细胞计数仪计数并评估细胞活力。</li>
	<li>制备薄层细胞涂片10，采用 Wright-Giemsa 染色法评估浆细胞比例11。</li>
	<li>根据细胞数量和浆细胞比例计算所需 CD138 磁珠的用量。若起始样本中浆细胞比例低于 20%，则每 5 × 106 个细胞使用 90 µl 分离缓冲液和 10 µl CD138 磁珠重悬细胞；若起始样本中浆细胞比例高于 20%，则每 1 × 107 个细胞使用 80 µl 分离缓冲液和 20 µl CD138 磁珠重悬细胞。</li>
	<li>将细胞与磁珠在 4 °C 条件下孵育 15 分钟。</li>
	<li>将细胞通过置于磁性分离器中的预润湿分离柱（LS 柱）并使用 35 µm 滤网过滤（参见材料清单）。</li>
	<li>从磁铁上取下分离柱，用 1 ml 分离缓冲液冲洗柱子 3 次，收集 CD138 阳性选择的细胞。</li>
	<li>通过另一张染色的薄层细胞涂片10评估 CD138 富集效果。</li>
	<li>使用 0.22 µm 注射器滤器过滤每位患者骨髓活检所得的血浆。实验中使用与 CD138+ 细胞来源相同的患者新鲜血浆。</li>
	<li>通过在 RPMI-1640 培养基中添加 10% 灭活胎牛血清、10% 患者血浆和 1% 青霉素-链霉素，配制实验用培养基。</li>
	<li>收集分选过程中的流穿部分（CD138-），并采用经典贴壁法12进一步分离骨髓间充质细胞（BMSCs）。由于该过程需要数周时间才能获得可用的 BMSCs，因此有必要提前准备好来自先前患者或健康供体的 BMSCs。</li>
</ol>
2. 在培养板中接种细胞（使用手动多通道移液器）
<ol>
	<li>使用具有黑色侧壁和透明平底的多孔板（384 或 1,536 孔），优先选择适用于光学检测和细胞培养的型号。</li>
	<li>将骨髓间充质干细胞（BMSCs）与多发性骨髓瘤（MM）细胞在 I 型胶原或基底膜基质中共培养，而人脐静脉内皮细胞（HUVECs）则需使用基底膜基质。</li>
	<li>保持每种细胞类型的终末密度在以下范围内：3 x 105 细胞/ml，用于MM细胞系，2 × 105 细胞/ml，用于 HUVECs 或 BMSCs，以及 2 x 106 细胞/毫升，用于患者来源的多发性骨髓瘤细胞。 
	注意：这些细胞密度是经过实验优化的结果，旨在保证检测的生物学相关性的同时，获得尽可能高的图像质量和尽可能长的成像时间。由于MM细胞系的增殖速度较快且细胞体积较大，其接种密度低于原代MM细胞。</li>
	<li>原代多发性骨髓瘤细胞与骨髓间充质干细胞的共培养
	<ol>
		<li>制备含有20 µl 10x MEM、20 µl去离子H₂O的预混培养基，分装为每份100 µl2O、10 µl 7.5% 碳酸氢钠溶液和 50 µl 1x RPMI 1,640，于 4 °C 保存。</li>
		<li>在将骨髓瘤细胞接种到培养板的同时，取预混好的培养基，加入150 µl浓度为3.1 mg/ml的牛I型胶原蛋白，混匀，最终体积为250 µl。</li>
		<li>将50 µl细胞用RPMI 1,640培养基重悬，浓度为最终所需浓度的六倍。</li>
		<li>使用 P200 移液器将细胞悬液与胶原混合液混合，终体积为 300 µl。</li>
		<li>使用手动或重复器移液器，将8 µl终末细胞/基质混合液滴加至384孔板每个孔的中央，或将2 µl加至1,536孔板每个孔中（空间排列示例见步骤2.6）。</li>
		<li>以 500 × g 离心 2 分钟，使所有细胞沉降到成像时的同一焦平面。</li>
		<li>将培养板置于培养箱中（5% CO₂）2，37 °C）孵育1小时，以使凝胶聚合。</li>
		<li>向384孔板的每孔中加入80 µl补充完全的生长培养基（RPMI-1640，10% 灭活FBS，10% 患者来源血浆，1% 青霉素-链霉素），或向1,536孔板的每孔中加入8 µl。</li>
		<li>将培养板置于培养箱中过夜（5% CO₂）2，37 °C）以促进基质黏附至培养板底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原代多发性骨髓瘤细胞与HUVECs的共培养：
	<ol>
		<li>将基底膜基质从 -80 °C 转移至装有冰的容器中解冻。</li>
		<li>将原代细胞和 HUVECs 分别计数，并在 RPMI-1640 培养基中重悬，浓度为最终浓度的 4 倍，每种细胞置于单独的离心管中。</li>
		<li>将患者细胞与HUVECs按1:1体积比混合。</li>
		<li>基底膜基质解冻后，在尚未聚合前，与上一步骤的细胞混合物按1:1比例混合。</li>
		<li>在每个孔的中心接种适量体积的细胞-基质混合液（384孔板每孔8 µl，1536孔板每孔2 µl，空间排布示例参见步骤2.6）。</li>
		<li>将培养板在500 × g下离心10分钟。</li>
		<li>将培养板放入培养箱（5% CO₂）2, 37 oC）孵育1小时以促进基质聚合。</li>
		<li>加入培养基（RPMI-1640，添加10% FBS、10% 患者血浆和1% P/S），每孔加入量为：384孔板80 µl，1,536孔板8 µl。</li>
		<li>在孵育箱中（5% CO₂）过夜孵育培养板2，37 °C）以促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）贴附于培养板底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种384孔板。 图3 展示了典型的种子空间分布。
	<ol>
		<li>从B2孔开始，接种与待测药物数量相同的列。在以下示例中 图3，使用七种药物。</li>
		<li>根据所用浓度重复接种相应次数。在下述示例中 图3，使用五个浓度。</li>
		<li>为对照条件再接种四个孔。</li>
		<li>对第二个重复样本重复步骤 2.6.1 和 2.6.2。</li>
		<li>对板中的每份患者样本重复步骤 2.6.1 至 2.6.4。</li>
		<li>将一种多发性骨髓瘤（MM）细胞系接种于两排孔中，每排孔数与待测药物数量相同（设两个复孔）。每个孔将用每种药物的最高浓度处理，以确保所用药物原液具有足够的活性（参见 图3 例如）。</li>
		<li>用骨髓瘤细胞系接种两个孔，作为实验条件的对照，例如台式培养箱的功能是否正常、培养基是否合适， 等等.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在培养板中接种细胞（使用机器人移液器）
注意：本系列步骤使用机器人移液器在384孔板中接种细胞。补充图1展示了该板的设计，其中将原代多发性骨髓瘤（MM）细胞与31种不同药物在五个不同浓度下进行测试，每种条件设两个重复，并包含阴性对照。同时接种一个细胞系作为药物疗效评估的阳性对照，并在最高浓度下对全部31种药物进行测试，每种设两个重复。所提供的文件适用于特定品牌和型号（见材料表），但该操作程序可适配于任何类型的机器人移液器。
<ol>
	<li>原代多发性骨髓瘤细胞与骨髓间充质干细胞的共培养：
	<ol>
		<li>准备一个15 ml离心管，其中加入240 µl 10x MEM、240 µl去离子H2O、120 µl 7.5%碳酸氢钠溶液、600 µl 1x RPMI 1,640和1.8 ml 3.1 mg/ml I型牛胶原蛋白。将该管标记为“pre-mix for CD138+”。置于冰上备用。</li>
		<li>准备一个1.5 ml离心管，其中加入50 µl 10x MEM、50 µl去离子H2O、25 µl 7.5%碳酸氢钠溶液、125 µl 1x RPMI 1,640和375 µl 3.1 mg/ml I型牛胶原蛋白。将该管标记为“pre-mix for Cell Line”。置于冰上备用。</li>
		<li>将300 µl CD138+细胞用RPMI 1,640重悬至最终所需密度的六倍浓度。将300 µl BMSC细胞用RPMI 1640重悬至最终所需密度的六倍浓度。将两种悬液混合于一个1.5 ml离心管中，并标记为“CD138+”。放入培养箱中备用。</li>
		<li>将60 µl细胞系用RPMI 1640重悬至最终所需密度的六倍浓度。将60 µl BMSC细胞用RPMI 1640重悬至最终所需密度的六倍浓度。将两种悬液混合于一个1.5 ml离心管中，并标记为“Cell Line”。放入培养箱中备用。</li>
		<li>使用随自动移液机器人提供的软件，加载第一个脚本文件“cell_seedingPt47.PGM”。将200 µl吸头盒、微孔板和无菌384孔板分别放置在机器人的A、B和E位点。</li>
		<li>混合标记为“pre-mix for CD138+”和“CD138+”的两管内容物。将其1.5 ml转移至微孔板的第1号孔中。将剩余液体的离心管放回冰上。启动程序。机器人将接种384孔板的前176个孔（最左侧11列），然后暂停。将冰上剩余的液体转移至微孔板的第2号孔。继续运行程序。机器人将完成剩余144个孔的接种并再次暂停。</li>
		<li>混合标记为“pre-mix for Cell Line”和“Cell Line”的两管内容物，并将混合液转移至微孔板的第3号孔。继续运行程序。机器人将完成384孔板剩余的64个孔的接种。</li>
		<li>将384孔板置于离心机中，在500 × g、4 °C条件下离心10分钟。随后将板转移至培养箱（5% CO2，37 °C）中孵育1小时&#160;，以促进胶原蛋白聚合。</li>
		<li>加载第二个脚本文件“media_layer.PGM”。将120 µl吸头盒、装有31 ml添加了10% FBS、10%患者血浆和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基的试剂储液槽，以及含有细胞的384孔板，分别放入A、B和E位点。运行程序。机器人将向每个孔转移81 µl培养基。程序结束后，将384孔板转移至培养箱中，过夜培养以使基质细胞贴附于基底。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 药物制备与加药（使用手动多通道移液器）
<ol>
	<li>准备一个类似于图3的模板，以方便向孔中添加药物，并减少混淆的可能性。</li>
	<li>在96孔板中，对每种待测药物进行系列稀释，例如使用3倍稀释法配制五个浓度：
	<ol>
		<li>在最高浓度孔中加入120 µl浓度为所需浓度10倍的药物。例如，若细胞在板中暴露的最高浓度为50 µM，则使用500 µM的美法仑（melphalan）。</li>
		<li>在接下来的四个孔中各加入80 µl培养基（RPMI，添加10% FBS、10%患者来源血浆和1%青霉素/链霉素（P/S））。</li>
		<li>从第一孔转移40 µl至第二孔并混匀，最终体积为120 µl，药物浓度为第一孔的1/3，即167 µM。</li>
		<li>重复步骤4.2.3至其余各孔（例如，从第二孔转移40 µl至第三孔，混匀，再从第三孔转移40 µl至第四孔，依此类推）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从每个含药孔中转移8 µl至细胞板中对应的孔。每个含药孔应有足够的体积用于细胞板中的10个孔。以图3为例，每种药物浓度添加至6个不同的孔，最高浓度除外，其添加至8个孔。</li>
	<li>在对照孔中加入8 µl培养基（RPMI，添加10% FBS、10%患者来源血浆和1% P/S）。</li>
	<li>细胞准备好后立即放入显微镜，并开启台式培养箱。</li>
</ol>
5. 药物配制与加药（使用机器人移液器）
<ol>
	<li>从 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip 下载移液机器人脚本文件</li>
	<li>在移液机器人用户界面中加载脚本“media_layer_DRUGPLATE.PGM”。在 A、B 和 E 位置分别放置一个 120 µl 吸头盒、一个盛有 21 ml 添加了 10% FBS、10% 患者血浆和 1% P/S 的 RPMI-1,640 培养基的储液槽，以及一个空的 384 孔板。运行程序，移液机器人将向 384 孔板的所有孔中各加入 30 µl 培养基。</li>
	<li>根据补充图 2的模板，向微孔板的每个孔中加入 200 µl 浓度为最高浓度 20 倍的药物溶液。此设置最多可容纳 31 种药物。向对照孔（CTRL）中加入添加了 10% FBS、10% 患者血浆和 1% P/S 的 RPMI-1640 培养基。</li>
	<li>在 A、B 和 C 位置分别放置一个 120 µl 吸头盒、含有 20 倍浓度药物的微孔板，以及步骤 5.1 中准备好的含培养基的 384 孔板。加载程序“drug_plate.PGM”。移液机器人将按照补充图 1中的空间分布进行 1:3 的系列稀释。</li>
	<li>在 A、B 和 C 位置分别放置一个 120 µl 吸头盒、步骤 5.3 中准备好的含药物稀释液的 384 孔板，以及步骤 3.1.9 中准备好的含细胞的 384 孔板。加载并运行程序“drug_add.PGM”。移液机器人将从药物板的每个孔中转移 8 µl 药物至细胞板中对应的孔。完成后，尽快将细胞板转移至数字显微镜的培养箱中。</li>
</ol>
6. 培养板中细胞的成像
注意：以下步骤适用于 Evos Auto FL 显微镜，但也可轻松适配于其他带有台式培养箱或内置培养箱的电动载物台显微镜。
<ol>
	<li>使用乙醇浸湿的擦拭纸清洁台式培养箱内部，并在打开培养箱盖时小心取下培养板的盖子。</li>
	<li>按照软件操作步骤添加信标（beacons）。该术语用于指代实验过程中需要依次成像的兴趣区域的定位标记（详见软件用户指南）。</li>
	<li>使用 5X 或 10X 放大倍数的物镜。确保焦距与图 2相似：骨髓瘤（MM）细胞呈现为明亮的圆盘状，周围环绕着暗环，而骨髓基质细胞（BMSCs）或人脐静脉内皮细胞（HUVECs）几乎不可见。部分原代 MM 细胞体积非常小，因此可能需要精细调节以找到最佳焦距。</li>
	<li>将图像采集时间间隔设置为 10–30 分钟，持续时间至少为 96 小时。虽然更长的采集间隔可以接受，但若间隔达到 45 分钟或更长，可能会显著降低活力检测的精确度。</li>
	<li>配置软件，使每个孔的图像分别存储在名为 Beacon-1、Beacon-2、等的独立文件中。如果使用了自动化移液机器人，请按照补充材料图 3所示顺序设置信标。</li>
	<li>确保培养箱加湿器中有足够的水和气体，以维持细胞的最佳培养条件。</li>
	<li>实验完成后，将包含图像的文件夹复制到用于分析的计算机上。</li>
</ol>
7. 药物敏感性的定量分析
注意：由于在个人计算机上分析多孔板极为耗时，以下说明将指导如何使用计算机集群进行图像分析。
<ol>
	<li>从美国国立卫生研究院（NIH）网站下载 ImageJ 软件：http://imagej.nih.gov/ij/</li>
	<li>在 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ 下载脚本和插件</li>
	<li>请按照 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf 中的说明运行数字图像分析软件。结果应为一个名为 Results.csv 的电子表格，其中包含实验期间每个孔在各时间点的规律性活率测量数据。即，&#160;96 小时</li>
	<li>若使用手动多通道移液器，请执行以下步骤。
	<ol>
		<li>下载文件 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt，并修改其内容以匹配步骤 3.1 中定义的孔板布局。例如， 图3).</li>
		<li>下载软件 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar，并使用步骤 5.3 和 5.4 中生成的文件作为输入参数运行程序。结果将生成一个名为 Report 的文件夹，其中包含多个电子表格，每个表格汇总了一种特定药物的结果。</li>
		<li>复制并粘贴内容至电子表格模板 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx 
		注意：结果应为类似图中所示的图表 图4，以药物浓度和作用时间为函数，表征样本对不同药物的化学敏感性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若使用自动移液工作站，请执行以下步骤。
	<ol>
		<li>从 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Template Files.zip 下载用于机器人移液器的脚本文件模板，解压至一个目录中。</li>
		<li>根据药物列表及含细胞培养板中药物的最高浓度，修改文件 DrugList.csv。遵循以下布局： 补充图2.</li>
		<li>运行程序 BuildExperimentalDesign.java，将步骤 7.5.1 中解压得到的文件所在文件夹以及步骤 7.3 中生成的 Results.csv 文件作为参数传入。输出结果应为两个文件夹：MM1_S 和 PtSample。前者包含针对细胞系阳性对照的孔板信息（药物及浓度），后者包含接种患者细胞的孔板部分的相应信息。</li>
		<li>将文件 Results.csv 复制到 7.5.3 步骤中创建的每个目录中。下载软件 http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar，并使用 7.5.3 步骤中为两个文件夹生成的文件运行该程序。结果将在 7.5.3 中创建的每个文件夹内生成一个名为 Report 的文件夹。Report 文件夹包含多个电子表格，每个电子表格汇总了一种特定药物的结果。</li>
		<li>运行程序 BuildGraphPadFile.java，并将步骤 7.5.1 中解压出的文件所在文件夹以及步骤 7.3 生成的 Results.csv 文件作为参数传入。结果将生成一个 GraphPad 文件，其中包含 31 种药物的剂量反应曲线，并以对照组为基准进行归一化。每张图表将包含主效多发性骨髓瘤（MM）细胞的 5 个药物浓度数据点，以及阳性细胞系对照的一个浓度数据点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+i+trialist%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase i trialist.</a> Lancet Oncol. 13, 236(2012).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

总之，这是一种强大且高通量的方法，可用于定量评估原代多发性骨髓瘤细胞的化学敏感性 离体 骨髓重建中药物的药效动力学。本方案中的关键步骤是正确接种孔板和适当的聚焦（参见 图2 为获得预期结果，请确保骨髓瘤细胞和基质细胞均匀分布，基质细胞贴壁于孔底，所有骨髓瘤细胞处于同一焦平面，且骨髓瘤细胞呈现为周围环绕暗环的明亮圆盘状形态。
如果接种不当（参见图5），请勿继续实验，而应重新接种第二块培养板。若发现基质细胞（MM）或间质细胞密度过低或过高，应在接种前检查细胞悬液的浓度，并在接种过程中定期重悬，以确保细胞在培养基中均匀分布。使用带重复功能的多通道移液器或自动化分液仪可显著减少此类问题。本实验所用细胞/基质与培养基的比例（1:10）旨在最大化可接种的孔数，从而增加可研究的实验条件。然而，若需研究癌细胞或间质细胞产生或消耗的可溶性因子，建议将细胞/基质与培养基的比例调整为1:1。
目前，该系统仅能定量非黏附细胞。为了定量间质细胞数量的变化，需要对该软件...

本方法旨在表征多发性骨髓瘤（MM）原代细胞对一系列药物的敏感性 离体尽可能接近生理条件，并具有足够的精确度，以利用这些结果识别肿瘤负荷中具有化疗耐药性的亚群，并最终为旨在预测临床反应的计算模型提供参数。
计算模型是分析复杂系统（如癌症-宿主-治疗相互作用）的有力工具。然而，模型的准确性取决于用于参数化的数据质量。遗憾的是，文献中大多数现有数据由于通常是在互斥的实验条件下获得的，因此无法直接用于此类模型的参数化。因此，通常需要设计新的实验，以获取所需的一组实验参数。然而，大多数细胞活力检测方法具有破坏性，因而只能在少量时间点进行检测，通常仅有一个时间点。这严重限制了化学敏感性检测在计算模型参数化中的应用，因为这类实验无法提供系统时间动态变化的信息。对于原代癌细胞而言，这一问题尤为突出：每份样本通常仅有数百万个细胞，且在活检后存活时间较短，从而限制了可实施的实验条件数量。此外，大多数细胞活力检测在定量时需要将癌细胞与非癌细胞（基质细胞）分离，这不仅增加了实验操作步骤，进一步干扰了细胞状态，也限制了可开展的实验数量。
40年前，Salmon 及其合作者1 提出了他们著名的 体外 用于评估肿瘤细胞化疗敏感性的集落形成实验。遗憾的是，由于在对照条件下能够形成集落的多发性骨髓瘤（MM）患者样本数量较少，该实验的应用效果有限：据估计，仅有极小亚群（0.001%至0.1%）的MM细胞具有复制能力，这类细胞被称为多发性骨髓瘤干细胞2这极大地限制了该检测方法的成功率以及单次可测试的药物数量，即使在较新的模型中也是如此。3如今，多发性骨髓瘤的治疗药物（标准或试验性）比四十年前多得多，这一问题显得尤为重要。
这些早期检测方法的一个主要局限性在于其二分法的输出结果：即患者对某种特定药物被判定为“敏感”或“耐药”。该方法并未提供关于肿瘤细胞群体敏感程度及其异质性的任何信息。因此，对于存在少量快速生长耐药细胞亚群的患者，可能被归类为对治疗“敏感”，但会很快出现复发，因而无法从治疗中获益。鉴于治疗反应持续时间对癌症患者总生存期（OS）的重要性4,5，显然这些检测方法无法持续准确地估计总生存期。
为了克服这些局限性，并能够生成可预测患者对一系列药物个性化临床反应的特异性计算模型，我们开发了一种方法，可在骨髓微环境（包括细胞外基质和基质）的ex vivo重建体系中，非破坏性地检测多发性骨髓瘤（MM）细胞系及原代MM细胞对药物的敏感性6。然而，该检测方法的局限性在于依赖于一种特定的商用微流控载片，其尺寸和成本限制了在特定设备上可同时开展的实验数量或药物种类。
本文所述系统将这一原始检测方法扩展为一种高通量的类器官剂量-反应平台，用于基于数字图像分析算法对药物进行体外筛选，以无损方式定量细胞活力。384孔或1,536孔板中的每个孔均为骨髓微环境的三维重建结构，包含原代多发性骨髓瘤（MM）细胞、细胞外基质以及患者来源的基质和生长因子。通过活细胞显微镜和数字图像分析，检测不同药物浓度下的细胞死亡事件，进而生成剂量-反应曲面。根据体外实验数据，数学模型可识别患者肿瘤负荷中不同亚群的大小及其化学敏感性，并可用于模拟肿瘤在生理条件下对药物治疗方案的反应6（图1）。
该平台的主要创新之处在于：（a）所需癌细胞数量少（每种药物浓度仅需 1,000–10,000 个细胞）；（b）可在生理条件下评估药物疗效（包括细胞外基质、间质、患者来源的生长因子）；（c）活力标记物无毒性7 由于仅使用明场成像，因此无需用荧光标记转染细胞8 或生物发光9；（d）连续成像可提供药物效应随浓度和暴露时间变化的关系（药效学）；以及（e）整合性 体外 以及计算进化模型，用于评估临床结局6 （席尔瓦 等人， （正在准备中）
数字图像分析算法能够区分癌细胞与间质细胞的关键因素在于它们对孔板底部的亲和力不同：多发性骨髓瘤细胞不贴壁，保持悬浮在基质中，而间质细胞则贴附于孔板底部并随后伸展。
尽管多发性骨髓瘤细胞（MM）和基质细胞是同时接种的，但这种分离现象仍会在过夜（O/N）培养过程中发生。接种后通过离心进一步加速了该过程。因此，在图像中，MM细胞呈现为周围带有暗环的圆形亮盘状结构，而基质细胞则保持较低的轮廓和较暗的色调（图2）。因此，当前形式的检测方法最适合用于非黏附性癌细胞；不过，可通过调整算法，根据其他形态学特征（如大小和形状）来实现癌细胞与基质细胞的区分。在本实验方案中，我们描述了两种类型的细胞外基质（胶原蛋白和基底膜基质），以及两种共培养体系：分别使用骨髓来源的间充质干细胞（BMSC）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs），代表骨髓中的间质微环境和血管周围微环境。
使用384孔板，每种药物设置5个浓度，每个浓度2个复孔，可利用单个患者的样本最多测试31种不同的药物。在1,536孔板中，该数量可达127种。图3展示了目前手动接种细胞所采用的布局，而补充图1则表示使用自动化移液器时的最佳分布方式。在图3所示的设计中，每块384孔板可容纳3个患者样本，每个样本测试7种不同药物；或单个患者样本测试21种药物。每种药物包含5个浓度，每种条件设2个复孔。每组7种药物设有4个对照孔（不加药物）（例如，36–39孔、126–129孔和200–203孔）。为确保所用药物的有效性，同时接种一个人类骨髓瘤细胞系（例如 H929 或 MM1.S），并在每种药物的最高浓度下设两个复孔进行处理（76–89孔）。阳性细胞系对照可确保所用药物具备足够的活性，因为其剂量反应曲线在不同实验间具有可比性。另设两个孔接种骨髓瘤细胞系，作为环境条件的对照，即用于检测成像过程中台式培养箱可能出现的问题（75孔和90孔）。孔位编号采用之字形排列，以减少显微镜电动载物台移动的距离，从而缩短采集时间并降低设备磨损。

<table><tbody><tr><td>EVOS FL AUTO</td><td>AMG</td><td>AMAFD1000 + AMC1000</td><td>配备电动载物台和台式培养箱的数字显微镜。</td></tr><tr><td>384孔 CellBind 板</td><td>CORNING</td><td>CLS3683 SIGMA</td><td>Corning CellBIND 384 孔板&lt;br/&gt; 384 孔板，聚苯乙烯材质，CellBIND 表面处理，无菌，透明平底，黑色，带盖</td></tr><tr><td>1,536 孔 CellBind 板</td><td>CORNING</td><td>CLS3832 ALDRICH</td><td>Corning 1,536 孔板，低底，CellBIND 表面处理，无菌</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02 SIGMA</td><td>用于&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;分离人外周血淋巴细胞。</td></tr><tr><td>CD138 磁珠</td><td>Miltenyi&amp;nbsp;</td><td>130-051-301</td><td>用于富集 CD138+ 细胞的抗体偶联磁珠。</td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;130-042-401</td><td>用于细胞分离的层析柱。</td></tr><tr><td>MidiMACS 分离器</td><td>Miltenyi&amp;nbsp;</td><td>130-042-302</td><td>用于分离柱的磁铁装置。</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909 SIGMA</td><td>源自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤的细胞外基质凝胶（ECM Gel）</td></tr><tr><td>Getrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1413201</td><td>无LDEV、低生长因子的基底膜基质</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Life Technologies</td><td>C-003-25P-B</td><td>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td>RPMI 1640 培养基 + L-谷氨酰胺 + 酚红</td></tr><tr><td>经热灭活的 FBS</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td>胎牛血清，经认证，热灭活，源自美国</td></tr><tr><td>3.1 mg/ml 牛 I 型胶原蛋白</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td>牛 I 型胶原蛋白溶液，3 mg/ml，100 ml</td></tr><tr><td>Precision XS</td><td>BIOTEK</td><td>PRC3841</td><td>自动化移液工作站系统</td></tr></tbody></table>

一种用于表征原代多发性骨髓瘤细胞药物敏感性的类器官高通量系统

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

在本研究中，我们描述了一种结合了新型方法的策略 离体 药物敏感性检测与数字图像分析用于评估患者来源的多发性骨髓瘤（MM）细胞的化疗敏感性及异质性。该方法将直接从骨髓穿刺液中分离的原代MM细胞接种于多孔板中集成的微流控腔室，每个腔室均重建了骨髓微环境，包含细胞外基质（胶原或基底膜基质）以及基质成分（患者来源的间充质干细胞）或人源性内皮细胞（HUVECs）。腔室中加入不同药物及浓度处理，并在配备数码相机的电动显微镜下，通过明场显微镜连续成像96小时。数字图像分析软件通过细胞膜运动的有无识别活细胞与死细胞，生成细胞存活率随药物浓度和作用时间变化的曲线。我们采用计算模型确定肿瘤群体对每种药物的化疗敏感性参数，以及亚群数量作为肿瘤异质性的度量。这些针对患者的个体化模型可用于模拟治疗方案并预测临床疗效。

实验流程简要描述如下 图1如果所有步骤均成功完成，显微镜下获得的图像应相当于 图2：活的MM细胞应清晰地显示为明亮的圆盘状，而BMSCs或HUVECs在背景中几乎不可见且分布良好。如图所示 图2A，MM细胞的大小因患者而异，但总体上小于细胞系。由于它们几乎不进行复制 离体 在实验间隔期（96 小时）内，可接种较高浓度的细胞（1–3×10⁶ 个细胞/ml）。基质应几乎不可见，因为骨髓间充质干细胞（BMSC）会贴附于孔板底部并伸展，呈现较低的形态特征。人骨髓瘤细胞系 H929 显著大于患者来源的多发性骨髓瘤（MM）细胞。图2B），并在24小时内进行重复实验。为避免图像过于密集，MM细胞系以较低密度接种，即0.3×10⁶个细胞/ml。 图2C 和 二维 分别代表患者来源的多发性骨髓瘤（MM）细胞和人骨髓瘤细胞系H929，与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养。HUVECs首先贴附于孔板底部，随后开始相互接触并形成网络结构，...

我们描述了一种用于原代多发性骨髓瘤细胞的高通量药物敏感性检测方法。该方法包括在多孔板中重建骨髓微环境（包含细胞外基质和基质细胞），以及一种对细胞活力进行纵向定量的非侵入性方法。

在本研究中，我们描述了一种新颖的方法，该方法结合离体药物敏感性检测与数字图像分析，以评估化学敏感性及……

本实验的总体目标是定量评估多发性骨髓瘤原代细胞对一系列化疗药物的化学敏感性。首先，将从新鲜骨髓穿刺液中分离得到的多发性骨髓瘤细胞与预培养的患者来源间质细胞及胶原混合；随后，在第二步中，将该细胞混合物（CEL mix）接种至多孔板中。随后将细胞用感兴趣的化疗药物处理，并将培养板转移至配备电动载物台的显微镜的培养箱中，对细胞进行长达96小时的连续成像。最终，可利用数字图像分析算法为每种药物及其浓度生成细胞存活曲线。该技术相较于现有的终点法细胞存活检测的主要优势在于，可利用单个患者的标本同时测试多种化疗药物，并且能够在数天内纵向监测患者细胞的存活情况，而无需将细胞从间质或基质中分离出来。该技术的应用前景可拓展至造血系统肿瘤的治疗，因其理论上可用于预测特定化疗方案的临床疗效。当我们意识到用多孔板替代原有的微流控载玻片可显著降低实验成本和时间时，便首次提出了该实验方案。为制备原代多发性骨髓瘤与骨髓来源间充质干细胞的共培养体系，使用多通道移液器开始操作时，需先将细胞悬浮于 RPMI 1640 培养基中，其细胞浓度为最终浓度的六倍。接下来加入培养基，将每种细胞类型各50微升与新配制的I型胶原混合，终体积为300微升。然后使用多通道移液器手动将8微升细胞基质混合物加入384孔板每个孔的中央，离心培养板以使所有细胞集中于同一焦平面。离心后，在细胞培养条件下孵育培养板1小时，使凝胶聚合。然后向每孔加入80 µL完全培养基，并过夜孵育，使基质细胞贴附于培养板底部。使用自动化移液机器人制备多发性骨髓瘤与基质细胞共培养体系时，首先将300 µL CD138阳性多发性骨髓瘤细胞与300 µL基质细胞悬浮于RPMI 1640培养基中，细胞密度为最终所需浓度的六倍，操作方法如前所述。然后将两种细胞类型混合至一个标记为CD138阳性的1.5毫升离心管中，并将该管放入细胞培养孵育箱。接着，用RPMI 1640培养基将适量的多发性骨髓瘤细胞系和60微升基质细胞悬浮，浓度为最终所需密度的六倍，再将两种细胞类型混合至第二个标记为细胞系的1.5毫升离心管中，同样在37摄氏度下孵育。在 robotic pipetter 上加载细胞接种程序文件。然后将一个200微升移液器吸头盒放入机器人A站，将一个微量滴定板放入B站，将一个无菌的384孔板放入E站。接着，将CD138阳性细胞混合物与新配制的CD138预混培养基试管混匀，并将所得细胞悬液1.5毫升转移至微量滴定板的第一孔中。将剩余的细胞置于冰上，并启动程序。机器人将向384孔板的前176个孔接种细胞，随后暂停。利用此间隙，将剩余的CD138阳性细胞转移至微量培养板的第2号孔，然后继续运行程序。机器人将观察剩余的144个孔并再次暂停。现在，将细胞系管中的细胞与一管新配制的细胞系预混液混合，并将混合物转移至微孔板的第3号孔。然后再次恢复程序，使机器人能够接种3个96孔板中剩余的64个孔。当最后一个孔接种完成后，离心沉淀细胞，并将共培养板转移至细胞培养箱中，使胶原蛋白聚合。一小时后，在机器人上加载培养基加样程序，并在A站放置一个120微升吸头盒，B站放置一个盛有31毫升添加了胎牛血清、患者血浆和抗生素的RPMI 1640培养基的试剂储液槽，E站放置CED 3 84孔板。然后运行程序，机器人将向每个孔转移81微升添加了补充物的培养基。机器人操作完成后，将细胞放回培养箱中，使基质在过夜时间内黏附于基底。若需用目标药物处理已接种的细胞，首先在机器人移液器用户界面中加载培养基层药物板程序。然后在 A 站位放置一个含 120 微升移液枪头的盒，在 B 站位放置一个装有 21 毫升 RPMI 1640 培养基（添加 FPS 患者血浆和抗生素）的储液槽，并在 E 站位放置一个空的 384 孔板，运行程序后，机器人移液器将向所有孔中加入 30 微升培养基。3 块 84 孔板。然后按照模板，向微滴定板的每个孔中加入 200 µL 药物，使其终浓度为最大浓度的 20 倍，作为对照。在孔中加入添加了 FPS 患者血浆和抗生素的培养基。然后将一个120微升移液器吸头盒放入A站，将药物微孔板放入B站，将含培养基的3个84孔板放入C站，并加载药物板程序。机器人移液器将按照本图所示进行1:3的系列稀释。现在，将一个新的120微升移液器吸头盒放入A站，将已稀释药物的3个84孔板放入B站，将接种细胞的3个84孔板放入C站，然后运行加药程序。移液机器人将从药物板的每个孔中转移八微升药物至细胞板中对应的孔。完成最后一个孔的处理后，立即将细胞板转移至数字显微镜的培养箱中。为成像细胞，先用乙醇湿巾清洁台式培养箱内部，然后小心地将培养板的盖子与培养箱的盖子进行交换。接下来，按照软件操作步骤，依次添加实验过程中需要成像的兴趣区域的标记点。最后，使用5倍或10倍物镜，调节焦距使细胞清晰可见，直至多发性骨髓瘤细胞呈现为被暗环包围的明亮圆盘状，而基质细胞几乎不可见。在本实验中，活的多发性骨髓瘤细胞被伪染为绿色；在实验结束时，当所有多发性骨髓瘤细胞均已死亡，且药物浓度达到最高时，基质细胞和人脐静脉内皮细胞中几乎未观察到绿色信号。然后使用机器人软件启动程序，以检测细胞在不同药物浓度作用下随时间推移而逐渐丧失活力的情况。在开始成像过程之前，必须仔细观察所有接种的孔，因为人为假象可能会误导图像分析软件，导致错误的结果。例如，此处显示的是间质细胞密度过高，或胰蛋白酶消化与接种之间间隔时间过长所导致的结果，从而引起细胞聚集成团，如本图像所示。如果细胞系接种密度过高，细胞在增殖过程中会形成集落，导致数字图像分析算法的准确性下降，因为此时难以区分单个细胞。当骨髓穿刺液中获得的多发性骨髓瘤细胞数量少于500,000个时，接种的多发性骨髓瘤细胞数量过少。在接种细胞前，必须确定所用试管的死体积，并将该体积纳入稀释计算中。一旦掌握，该技术可在两到三小时内完成。进行此操作时，重要的是要记住将含有胶原蛋白的预混培养基置于冰上，以防止在细胞准备好之前发生聚合。这也有助于探索肿瘤负荷的化疗敏感性异质性如何决定患者反应的深度和持续时间。

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医学

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一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

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我们介绍一种用于测量类器官肿瘤组织切片中实时药物反应的方案。此处概述的实验策略提供了一个平台，可在体外条件下对来自临床或小鼠肿瘤的组织切片进行中高通量药物筛选。...

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