一种用于表征原代多发性骨髓瘤细胞药物敏感性的类器官高通量系统

本实验的总体目标是定量评估多发性骨髓瘤原代细胞对一系列化疗药物的化学敏感性。首先，将从新鲜骨髓穿刺液中分离得到的多发性骨髓瘤细胞与预培养的患者来源间质细胞及胶原混合；随后，在第二步中，将该细胞混合物（CEL mix）接种至多孔板中。

随后将细胞用感兴趣的化疗药物处理，并将培养板转移至配备电动载物台的显微镜的培养箱中，对细胞进行长达96小时的连续成像。最终，可利用数字图像分析算法为每种药物及其浓度生成细胞存活曲线。该技术相较于现有的终点法细胞存活检测的主要优势在于，可利用单个患者的标本同时测试多种化疗药物，并且能够在数天内纵向监测患者细胞的存活情况，而无需将细胞从间质或基质中分离出来。

该技术的应用前景可拓展至造血系统肿瘤的治疗，因其理论上可用于预测特定化疗方案的临床疗效。当我们意识到用多孔板替代原有的微流控载玻片可显著降低实验成本和时间时，便首次提出了该实验方案。为制备原代多发性骨髓瘤与骨髓来源间充质干细胞的共培养体系，使用多通道移液器开始操作时，需先将细胞悬浮于 RPMI 1640 培养基中，其细胞浓度为最终浓度的六倍。

接下来加入培养基，将每种细胞类型各50微升与新配制的I型胶原混合，终体积为300微升。然后使用多通道移液器手动将8微升细胞基质混合物加入384孔板每个孔的中央，离心培养板以使所有细胞集中于同一焦平面。

离心后，在细胞培养条件下孵育培养板1小时，使凝胶聚合。然后向每孔加入80 µL完全培养基，并过夜孵育，使基质细胞贴附于培养板底部。使用自动化移液机器人制备多发性骨髓瘤与基质细胞共培养体系时，首先将300 µL CD138阳性多发性骨髓瘤细胞与300 µL基质细胞悬浮于RPMI 1640培养基中，细胞密度为最终所需浓度的六倍，操作方法如前所述。

然后将两种细胞类型混合至一个标记为CD138阳性的1.5毫升离心管中，并将该管放入细胞培养孵育箱。接着，用RPMI 1640培养基将适量的多发性骨髓瘤细胞系和60微升基质细胞悬浮，浓度为最终所需密度的六倍，再将两种细胞类型混合至第二个标记为细胞系的1.5毫升离心管中，同样在37摄氏度下孵育。在 robotic pipetter 上加载细胞接种程序文件。

然后将一个200微升移液器吸头盒放入机器人A站，将一个微量滴定板放入B站，将一个无菌的384孔板放入E站。接着，将CD138阳性细胞混合物与新配制的CD138预混培养基试管混匀，并将所得细胞悬液1.5毫升转移至微量滴定板的第一孔中。

将剩余的细胞置于冰上，并启动程序。机器人将向384孔板的前176个孔接种细胞，随后暂停。利用此间隙，将剩余的CD138阳性细胞转移至微量培养板的第2号孔，然后继续运行程序。

机器人将观察剩余的144个孔并再次暂停。现在，将细胞系管中的细胞与一管新配制的细胞系预混液混合，并将混合物转移至微孔板的第3号孔。然后再次恢复程序，使机器人能够接种3个96孔板中剩余的64个孔。

当最后一个孔接种完成后，离心沉淀细胞，并将共培养板转移至细胞培养箱中，使胶原蛋白聚合。一小时后，在机器人上加载培养基加样程序，并在A站放置一个120微升吸头盒，B站放置一个盛有31毫升添加了胎牛血清、患者血浆和抗生素的RPMI 1640培养基的试剂储液槽，E站放置CED 3 84孔板。然后运行程序，机器人将向每个孔转移81微升添加了补充物的培养基。

机器人操作完成后，将细胞放回培养箱中，使基质在过夜时间内黏附于基底。若需用目标药物处理已接种的细胞，首先在机器人移液器用户界面中加载培养基层药物板程序。然后在 A 站位放置一个含 120 微升移液枪头的盒，在 B 站位放置一个装有 21 毫升 RPMI 1640 培养基（添加 FPS 患者血浆和抗生素）的储液槽，并在 E 站位放置一个空的 384 孔板，运行程序后，机器人移液器将向所有孔中加入 30 微升培养基。

3 块 84 孔板。然后按照模板，向微滴定板的每个孔中加入 200 µL 药物，使其终浓度为最大浓度的 20 倍，作为对照。在孔中加入添加了 FPS 患者血浆和抗生素的培养基。

然后将一个120微升移液器吸头盒放入A站，将药物微孔板放入B站，将含培养基的3个84孔板放入C站，并加载药物板程序。机器人移液器将按照本图所示进行1:3的系列稀释。现在，将一个新的120微升移液器吸头盒放入A站，将已稀释药物的3个84孔板放入B站，将接种细胞的3个84孔板放入C站，然后运行加药程序。

移液机器人将从药物板的每个孔中转移八微升药物至细胞板中对应的孔。完成最后一个孔的处理后，立即将细胞板转移至数字显微镜的培养箱中。为成像细胞，先用乙醇湿巾清洁台式培养箱内部，然后小心地将培养板的盖子与培养箱的盖子进行交换。

接下来，按照软件操作步骤，依次添加实验过程中需要成像的兴趣区域的标记点。最后，使用5倍或10倍物镜，调节焦距使细胞清晰可见，直至多发性骨髓瘤细胞呈现为被暗环包围的明亮圆盘状，而基质细胞几乎不可见。在本实验中，活的多发性骨髓瘤细胞被伪染为绿色；在实验结束时，当所有多发性骨髓瘤细胞均已死亡，且药物浓度达到最高时，基质细胞和人脐静脉内皮细胞中几乎未观察到绿色信号。

然后使用机器人软件启动程序，以检测细胞在不同药物浓度作用下随时间推移而逐渐丧失活力的情况。在开始成像过程之前，必须仔细观察所有接种的孔，因为人为假象可能会误导图像分析软件，导致错误的结果。例如，此处显示的是间质细胞密度过高，或胰蛋白酶消化与接种之间间隔时间过长所导致的结果，从而引起细胞聚集成团，如本图像所示。

如果细胞系接种密度过高，细胞在增殖过程中会形成集落，导致数字图像分析算法的准确性下降，因为此时难以区分单个细胞。当骨髓穿刺液中获得的多发性骨髓瘤细胞数量少于500,000个时，接种的多发性骨髓瘤细胞数量过少。在接种细胞前，必须确定所用试管的死体积，并将该体积纳入稀释计算中。一旦掌握，该技术可在两到三小时内完成。

进行此操作时，重要的是要记住将含有胶原蛋白的预混培养基置于冰上，以防止在细胞准备好之前发生聚合。这也有助于探索肿瘤负荷的化疗敏感性异质性如何决定患者反应的深度和持续时间。