一种用于功能研究的3D人体肺组织模型 结核分枝杆菌 感染

本实验的总体目标是构建一种用于研究结核分枝杆菌（M. tuberculosis）感染的体外肺组织模型。首先，将成纤维细胞胶原基质层铺在细胞培养板小室的滤膜上；随后，在成纤维细胞胶原层上接种感染的免疫细胞和肺上皮细胞。

随后将形成的三维组织模型暴露于空气中，以促进黏液分泌和上皮分层。最后一步是收获并固定该组织。最终，通过免疫荧光显微镜分析结核分枝杆菌诱导的早期肉芽肿形成情况。

该技术相较于现有方法（如体外单层细胞培养）的主要优势在于，该系统中的细胞处于三维微环境中，可在感染致病性分枝杆菌后形成类似于人类结核病的肉芽肿。制备胶原包埋的成纤维细胞时，首先将肺成纤维细胞在37摄氏度下用胰蛋白酶处理10分钟；当细胞脱落后，加入8毫升完全DMEM培养基终止反应，随后离心收集细胞。用新鲜DMEM将细胞沉淀重悬至230,000个细胞/毫升的浓度，并将细胞置于冰上。接下来，将一个细胞培养插件放入6孔板的每个孔中。

将细胞层混合物新鲜配制后，取1毫升加入每个插入式培养小室中，确保混合物完全覆盖小室表面且无气泡。随后将培养板置于37°C培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，在冰上将2毫升胶原蛋白溶液与615微升预混液在无菌锥形管中混合，以中和每插入式培养小室所需胶原蛋白的pH值。

然后向胶原混合物中每孔加入 58 µL 完全 DMEM 和 327 µL 肺成纤维细胞。通过上下吹打使细胞在混合物中均匀分布。现在迅速将 3 mL 细胞层沿每孔插入物的侧壁加至无细胞胶原层上。

注意避免产生气泡，并将培养板放回细胞培养箱中再孵育 2 小时。胶原蛋白聚合后，在每个孔底部加入 2 毫升完全 DMEM 培养基，然后将培养板放回培养箱中继续孵育 24 小时。次日，使用一对洁净的镊子依次小心提起插入物，并从每个插入物底部吸除培养基。

然后向每个孔的底部加入两毫升完全DMM培养基，同时向每个插入物中加入两毫升完全DMM培养基。每两天更换一次培养基，更换周期持续五至七天。为制备感染的巨噬细胞，首先将巨噬细胞培养物与毒力较强的M. tuberculosis在感染复数为10的条件下共同孵育四小时。

孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞三次，以去除细胞外细菌，并在 37 摄氏度下用 2 毫摩尔的 A DTA 处理巨噬细胞 10 分钟。待细胞脱落之后，将其重悬于不含抗生素的完全 DMM 培养基中。然后吸除成纤维细胞胶原基质板中的全部培养基，并向外室加入 1.5 毫升新鲜的不含抗生素的完全 DMM 培养基。

接下来，将荧光标记的单核细胞与感染的巨噬细胞按5:1的比例在每孔插件中加入50 µL无抗生素的完全DMEM培养基中混合。然后将50 µL单核细胞-巨噬细胞混合液加入每个插件内侧，并将培养板放回培养箱中。一小时后，沿插件管壁缓慢加入2 mL培养基，以避免细胞脱落，并继续培养24小时。

为了用肺上皮细胞接种培养物，在免疫细胞-成纤维细胞-胶原基质上层加入含有每毫升400万个上皮细胞的50微升完全DMM培养基。室温孵育2分钟，随后在37摄氏度孵育1小时。然后，像刚刚演示的那样，向插入物中轻柔加入2毫升不含抗生素的完全DMM培养基，并继续培养细胞3天。

接种后第五天，从培养板中吸除所有感染的巨噬细胞培养基，向外围腔室加入1.8毫升不含抗生素的完全DMM。随后在第七天接种后，将3D组织模型在培养箱中暴露于空气中培养两天，在此期间不向插入物中添加培养基。

完全移除培养板中的培养基，在避光条件下，室温下用 4% 多聚甲醛混合组织模型，固定 30 分钟。然后使用手术刀将膜从培养插件中分离。接着，使用洁净的手术刀小心切除组织模型的边缘部分，并将每块组织切成大小相近的四个方形小片。

将组织片转移至超冻玻璃载玻片上，室温干燥5分钟。随后使用含抗荧光淬灭剂和dpi的荧光封片液封片，并盖上盖玻片。将载玻片置于室温避光处直至干燥，然后用指甲油密封盖玻片边缘。

当漆膜干燥后，将载玻片浸入70%乙醇中，以便将样本移出生物安全三级实验室。为观察组织，使用荧光共聚焦显微镜对整个组织样本的5至10个不同视野进行三维成像，成像分辨率为512×512，Z轴覆盖厚度至少为20微米，层间间隔为1至1.5微米，用于细胞簇的三维定量分析。打开三维图像处理软件，加载待分析的图像。

接下来，使用显示调节工具，针对图像的每个通道调节对比度、亮度和融合不透明度，以优化体积渲染效果，并最大限度地减少噪声干扰。然后，为观察组织表面，选择红色单核细胞通道，并利用滤镜设置适当的阈值，以限定红色单核细胞的选取范围，或根据需要排除背景信号。最后，将数据导出至合适的电子表格程序，以进行后续分析。

在接种结核分枝杆菌感染细胞后的第七天，共聚焦显微镜显示感染部位出现红色单核细胞的聚集，表现为绿色细菌的存在，模拟了人类结核病中称为肉芽肿的三维病灶。该可视化技术提供了灵活交互、观察和定量分析多个特征的能力。例如，这些图像中展示的单核细胞在结核分枝杆菌感染部位聚集的三维图像。

可以从顶端、旋转和侧面视图观察到绿色细菌与红色单核细胞簇的空间分布情况。正如预期，这些细胞簇在未感染的组织中未被观察到。对单核细胞、细胞簇以及结核分枝杆菌感染组织的大小和数量进行定量分析表明，与未感染组织模型相比，感染后细胞簇的尺寸增大，而单个单核细胞的数量减少。

该肺组织模型的潜在应用包括研究不同免疫细胞及组织免疫在结核病中的作用、分枝杆菌表型的研究，以及针对杀灭肉芽肿内分枝杆菌的候选药物的测试。