Name: 在前列腺癌的临床组织中miRNA的表达分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学习使用定量实时PCR和原位杂交技术分析前列腺癌临床组织中的miRNA表达。该方法结合激光捕获显微切割和锁定核酸探针，帮助研究人员准确评估miRNA作为诊断和预后生物标志物的潜力。

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感谢 Roger Erickson 博士在手稿准备过程中提供的支持与帮助。
本工作由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助
（资助编号 RO1CA177984；RO1CA138642），退伍军人事务部前列腺癌项目计划（BX001604）。

前列腺癌样本（包括福尔马林固定石蜡包埋样本或新鲜冷冻样本）来自旧金山退伍军人医疗中心（SFVAMC），样本取自曾在该中心接受根治性前列腺切除术的前列腺癌患者。所有患者均签署书面知情同意书，研究经加州大学旧金山分校（UCSF）人类研究委员会批准。此外，前列腺癌组织微阵列购自商业来源，并用于通过原位杂交（ISH）进行miRNA分析。同时收集了所分析前列腺癌患者的临床病理学资料及随访信息。
1. 组织样本
<ol>
	<li>使用切片机将前列腺癌组织样本切成10 µm的切片，并按照制造商的说明书进行H&amp;#38;E染色。</li>
	<li>观察染色后的切片，以识别前列腺癌病灶以及邻近的正常腺上皮组织。 
	注意：应由经委员会认证的病理学家审查H&amp;#38;E染色切片，并标记肿瘤区域和正常区域。在后续用于miRNA分析的切片中，以这些已标记的切片作为肿瘤区域与正常区域取材的参考指南。</li>
</ol>
2. 通过定量实时 PCR 进行 miRNA 表达分析
注意：该实验流程包括以下步骤：激光捕获显微切割、总RNA（包括miRNA和mRNA）的提取，以及使用TaqMan MicroRNA表达检测试剂盒对成熟miRNA进行检测，具体方法详见下文各节。
<ol>
	<li>RNA 提取
	<ol>
		<li>从前列腺癌 FFPE 组织中分离 miRNA
		<ol>
			<li>激光捕获显微切割（LCM） 
			注意：步骤 2.1.1.1.1–2.1.1.1.4 需在化学通风橱中进行。
			<ol>
				<li>准备用于 LCM 的组织切片（10 µm 厚度）。将组织切片浸入二甲苯中脱蜡（两次），每次 10 分钟，然后依次在梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）中各孵育 5 分钟，最后用蒸馏水处理 5 分钟以完成再水化。</li>
				<li>再水化后，用苏木精染色 30 秒，随后用水冲洗。</li>
				<li>将组织依次置于梯度乙醇（70%、95%、90%、80%、70%）中（每步 5 分钟）及二甲苯中（5 分钟）。</li>
				<li>在通风橱中干燥切片，随后将其放入 LCM 仪器中进行显微切割。</li>
				<li>按照制造商说明书24操作 LCM 系统进行显微切割。以经病理学家标记的切片为参考，识别前列腺癌病灶及相邻正常组织。使用直径为 10–20 µm 的激光脉冲，功率设置为 70–90 mW。</li>
				<li>利用红外激光脉冲将目标区域捕获至 LCM 收集帽上。每个样本合并 2–5 个收集帽中的细胞用于 miRNA 提取。为确保所提取 RNA 的完整性，应立即对捕获的细胞进行 miRNA 提取处理。</li>
				<li>或者，可将细胞直接裂解于 miRNA 提取缓冲液中（按照制造商方案），并将裂解液储存于 -80 ºC。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>LCM 显微切割组织中 miRNA 的提取与分析
			<ol>
				<li>使用商业试剂盒，按照制造商说明书从显微切割的 FFPE 组织中提取总 RNA。 
				注意：激光捕获显微切割所得 RNA 产量通常较低。因此，建议将 RNA 洗脱至较小体积（20–30 µl），并用于后续 TaqMan microRNA 表达检测（按制造商说明书操作，详见第 2.2 节）。为优化成熟 miRNA 实时 PCR 检测的 RNA 输入量，建议每个 miRNA 特异性逆转录反应使用 5 µl 洗脱 RNA。以内源性对照 RNU48/RNU24 进行标准化。对照反应中，每个逆转录反应使用 2 µl 洗脱 RNA。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从前列腺癌冷冻组织中分离 miRNA
		<ol>
			<li>使用研钵和研杵在液氮中研磨冷冻的前列腺切除组织，使其匀浆化。用预冷的刮勺将匀浆组织转移至微量离心管中。通过将研钵/研杵和刮勺反复浸入液氮中以维持低温，确保组织匀浆可顺利转移。</li>
			<li>向匀浆组织中加入商用异硫氰酸胍-苯酚试剂（每 0.1 g 组织加 1 ml），室温孵育 5 分钟。 
			注意：匀浆组织在商用异硫氰酸胍-苯酚试剂中可在 -80 ºC 下保存数月。</li>
			<li>向匀浆液中加入氯仿（每毫升匀浆液加 0.2 ml），剧烈振荡 30 秒。室温孵育 3–5 分钟后，在 4 ºC 下以 10,000 × g 离心 20 分钟。</li>
			<li>将上层水相转移至新的无菌无 RNase 的 1.5 ml 离心管中。</li>
			<li>加入等体积异丙醇，混匀后室温孵育 10 分钟，随后在 4 ºC 下以 12,000 × g 离心 20 分钟以沉淀 RNA。</li>
			<li>吸除上清液，用 1 mL 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。在 4 ºC 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。</li>
			<li>小心吸除上清液，在室温下干燥 RNA 沉淀 5–10 分钟。将 RNA 溶解于 50–100 µl 无核酸酶水中。</li>
			<li>使用 Nanodrop 分光光度计测定 RNA 浓度，并通过生物分析仪评估 RNA 完整性。将 RNA 浓度调整至 10 ng/µl。每个 miRNA 特异性 cDNA 反应使用 10–50 ng RNA，随后进行实时 PCR 分析（见第 2.2 节）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>miRNA 表达分析的定量实时 PCR 
	注意：采用以下所述的两步 RT-PCR 方案检测成熟 miRNA。
	<ol>
		<li>逆转录（RT）
		<ol>
			<li>使用 miRNA 逆转录试剂盒，按照制造商说明书将 RNA 逆转录为 cDNA。每个反应使用 10–50 ng 总 RNA 及 MicroRNA Assays 和 RT 试剂盒中的 miRNA 特异性引物。以 RNU48/RNU24/RNU6B 作为对照。将 cDNA 稀释 5–10 倍（根据待测 miRNA 的丰度而定），用于下一步所述的实时 PCR 检测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>成熟 miRNA 检测的实时 PCR
		<ol>
			<li>使用 MicroRNA 检测试剂和 Fast Universal 预混液，按照制造商说明书对 cDNA 样本进行 PCR 扩增。以 RNU48/RNU24/RNU6B 作为内参对照进行样本标准化。在 Fast Real-Time PCR 系统上采用相对 Ct（阈值循环）法计算基因表达的相对变化。每个样本设三个重复。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过miRNA表达分析 原位 杂交（原位杂交，ISH）
<ol>
	<li>组织预处理
	<ol>
		<li>使用切片机从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的前列腺癌组织块中切下5 µm厚的切片。</li>
		<li>将载玻片在56 °C下孵育1小时以固定组织切片。 
		注意：用于miRNA分析的载玻片可在室温下保存数周。</li>
		<li>用二甲苯浸泡载玻片（2次），每次15分钟，以脱去石蜡。</li>
		<li>依次将载玻片在梯度乙醇（100%（2次）、95%、90%、80%、70%）中各孵育5分钟进行再水化，最后在蒸馏水中孵育5分钟。</li>
		<li>在室温下用含4%多聚甲醛的PBS固定载玻片20分钟。</li>
		<li>在室温下用PBS洗涤载玻片（2次），每次5分钟。</li>
		<li>在预热的蛋白酶K缓冲液（5 mM Tris-HCl pH 7.4，1 mM EDTA，1 mM NaCl）中，于37 ºC下用10 µg/ml蛋白酶K处理载玻片10分钟。</li>
		<li>蛋白酶K处理后，用含0.2%甘氨酸的PBS冲洗载玻片30秒。</li>
		<li>在室温下用PBS（1次）洗涤载玻片5分钟。</li>
		<li>用含4%多聚甲醛的PBS在室温下固定载玻片15分钟。</li>
		<li>用PBS冲洗载玻片5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交
	<ol>
		<li>在湿化 chamber 中，于55 ºC下用预杂交液对载玻片进行预杂交3–4小时。使用浸有50%甲酰胺/50% 5x SSC的组织实验擦拭纸保持 chamber 内湿度。</li>
		<li>在杂交缓冲液中使用5’端地高辛标记的探针，浓度为20–50 nM。将特异性miRNA探针（20–50 nM）和小核RNA U6对照探针（20 nM）稀释后，在90 ºC加热4分钟，立即置于冰上冷却，然后加入冰冻的杂交缓冲液（2–4 ng/µl）中。</li>
		<li>去除预杂交液，加入杂交液（探针+杂交缓冲液，每张载玻片100 µl），在探针特异性的杂交温度下孵育12–16小时（杂交温度 = 探针Tm值 - 21 ºC）。在湿化 chamber（含50%甲酰胺/50% 5x SSC）中进行杂交反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤步骤
	<ol>
		<li>在45 ºC下用2x SSC洗涤载玻片10分钟。</li>
		<li>在45 ºC下用1.5x SSC洗涤载玻片10分钟。</li>
		<li>在37 ºC下用0.2x SSC（2次）洗涤载玻片，每次20分钟。</li>
		<li>在室温下用1x封闭液孵育载玻片1–2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测
	<ol>
		<li>在室温下用PBS按1:100稀释的碱性磷酸酶（AP）偶联抗地高辛抗体孵育载玻片1–4小时，或在4 ºC下孵育过夜。</li>
		<li>在室温下用PBS（3次）洗涤载玻片，每次10分钟。</li>
		<li>在室温下用碱性磷酸酶缓冲液（100 mM Tris pH 9.5，50 mM MgCl2，100 mM NaCl，0.1% Tween-20）洗涤载玻片（2次），每次5分钟。</li>
		<li>在避光条件下，于室温下用BM Purple AP底物孵育载玻片1–20小时。</li>
		<li>用含0.1% Tween-20的PBS冲洗载玻片，并在水中洗涤（2次）。</li>
		<li>使用水溶性封片介质封片，并在显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者没有财务披露。

本文介绍了一种简化的微小RNA（miRNA）表达谱分析工作流程，适用于存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌临床组织样本。在前列腺癌研究中，多项研究表明微小RNA在前列腺癌的发生、发展及转移过程中发挥重要作用。然而，由于不同研究中miRNA的提取与分析方法差异较大，针对特定miRNA所得结果常存在矛盾22。鉴于越来越多的证据支持将miRNA作为前列腺癌预后、诊断和治疗的潜在替代性生物标志物，迫切需要对临床组织中的miRNA表达谱进行准确的定量分析。
我们采用定量实时 PCR 与 原位 用于前列腺癌临床样本中miRNA分析的杂交技术。在此实验流程中，我们优化了现有的miRNA提取方法、基于TaqMan引物的RT-PCR表达分析以及利用LNA探针的原位杂交（ISH）分析方法。在整个操作过程中，保持无RNase的环境至关重要。所有使用的试剂/溶液均应为无RNase的，且在处理RNA及其他试剂时需格外小心。所有实时反应均应在冰上进行配制，以最大限度减少RNA降解。
前列腺癌组...

前列腺癌是一种常见的男性恶性肿瘤，也是导致男性癌症相关死亡的主要原因之一。在美国，预计2015年将报告约220,800例新发病例和27,540例死亡病例1。
前列腺癌是一种异质性疾病，其病程差异极大——肿瘤可能表现为惰性，也可能极具侵袭性。在前列腺癌的临床管理中，一个关键挑战在于目前用于疾病筛查、诊断、预后和治疗的方法或生物标志物尚不充分2。当前的筛查方法包括前列腺特异性抗原（PSA）检测和直肠指检（DRE），随后进行前列腺活检3。前列腺特异性抗原（PSA）是目前应用最广泛的前列腺癌生物标志物，已显著革新了临床管理并提高了患者的生存率4。然而，由于PSA本身存在特异性不足等固有局限性，基于PSA的筛查已导致疾病的过度诊断和过度治疗。鉴于此，目前正大力开展研究，以寻找可替代的前列腺癌生物标志物，特别是那些能够预测疾病侵袭性并有助于优化治疗决策的标志物4,5。近年来，微小RNA（miRNA）已成为极具前景的替代性前列腺癌生物标志物。
microRNA（miRNA）是一类在进化上保守的小分子非编码RNA，可通过与靶mRNA的3’-非翻译区（UTR）进行序列特异性相互作用，在转录后水平抑制基因表达。据估计，超过&#62;60%的mRNA是miRNA的保守靶标6。miRNA基因位于基因间区域，或存在于蛋白质/非蛋白质编码基因的内含子或外显子中7。这些基因主要由RNA聚合酶II转录生成初级miRNA（pri-miRNA，长度达数千碱基），其可形成发夹状的茎环二级结构。pri-miRNA随后被加工为前体miRNA（pre-miRNA，长约60–75个核苷酸），转运至细胞质后进一步加工生成成熟miRNA（长约18–25个核苷酸）8-10。miRNA调控多种关键细胞过程，包括增殖、发育、分化和凋亡11。研究表明，在包括前列腺癌在内的多种人类恶性肿瘤中，miRNA的表达谱存在广泛失调12-15。已有报道显示，原发性和转移性前列腺癌中的miRNA表达谱均显著失调。miRNA表达的异常与前列腺癌的进展、侵袭性及复发密切相关，凸显了miRNA在预后评估中的潜力12,14,16-19。越来越多的证据表明，miRNA在前列腺癌的发生、发展、进展及转移过程中发挥重要的机制性作用。总体而言，miRNA正成为极具前景的前列腺癌诊断与预后替代生物标志物，能够区分正常组织与癌组织，并有助于前列腺肿瘤的分层12。此外，miRNA也是开发针对前列腺癌有效治疗手段的重要靶点20。
由于其分子量小且对内源性RNase活性具有抗性，miRNA是稳定的生物标志物，可在福尔马林固定组织中被 readily 检测到21 以及前列腺活检中22此外，已对冷冻组织和福尔马林固定组织中的miRNA表达谱进行了比较，发现两者之间具有高度相关性21然而，由于肿瘤异质性、取样误差、间质污染等因素，前列腺癌临床组织中的miRNA表达谱分析常常面临挑战。miRNA能否成为前列腺癌有效的生物标志物，在很大程度上依赖于其在临床组织中被准确检测的能力。本文介绍了我们实验室用于存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌临床样本中miRNA表达谱分析的简化工作流程。我们采用定量实时PCR与 原位 用于临床样本miRNA分析的杂交技术，前者可提供更定量的信息，后者则用于可视化多种组织中潜在miRNA生物标志物的差异表达。在此工作流程中，我们优化了从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和冷冻前列腺组织中提取miRNA的现有方法，并采用基于TaqMan探针的miRNA逆转录PCR及miRNA表达分析 原位 使用锁核酸（LNA）探针的杂交技术23LNA探针相比DNA或RNA探针具有更高的灵敏度和特异性，能够稳定检测所有miRNA序列，不受其GC含量影响，同时可实现miRNA家族成员的区分。我们优化的miRNA原位杂交（ISH）方案适用于前列腺癌组织切片或前列腺癌组织微阵列（TMA），后者有助于加快miRNA生物标志物的发现进程。

<table><tbody><tr><td>切片机</td><td>Leica Biosystems&amp;nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix 激光显微切割系统</td><td>Arcturus/Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>也可使用 Life Technologies 的 Arcturus Xt 系统。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM 切割帽</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 快速实时荧光定量 PCR 系统&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 反转录试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 快速通用 PCR 预混液&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>地高辛标记的 LNA U6 探针</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP 显色底物</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>预杂交溶液&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>杂交溶液&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>封闭溶液&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶偶联抗地高辛抗体</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>水溶性封片剂&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>H-5501&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol（异硫氰酸胍-苯酚试剂）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>哈里斯苏木精</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>伊红&amp;nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

前列腺癌临床组织中的mirna表达分析

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

前列腺癌（PCa）临床管理中的一个关键挑战在于目前所用生物标志物在疾病筛查、诊断、预后及治疗方面的不足。近年来，微小RNA（miRNAs）作为前列腺癌诊断与预后潜在替代性生物标志物展现出良好前景。然而，miRNA能否成为有效的前列腺癌生物标志物，在很大程度上依赖于其在临床组织样本中被准确检测的能力。由于肿瘤异质性、取样误差以及间质污染等因素，前列腺癌临床标本中的miRNA分析常常面临困难。 等。 本文旨在介绍一种简化的工作流程，用于对存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌临床样本进行miRNA分析，该流程结合了定量实时PCR（RT-PCR）与 原位 杂交（ISH）。在该工作流程中，我们优化了从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）及冷冻前列腺组织中提取miRNA的现有方法，并采用基于TaqMan探针的miRNA逆转录PCR进行表达分析。此外，我们描述了一种利用锁核酸（LNA）探针检测前列腺组织中miRNA的优化ISH方法。我们优化后的miRNA ISH方案可应用于前列腺癌组织切片或前列腺癌组织微阵列（TMA）。

通过RT-PCR分析LCM分离的前列腺癌临床标本中miR-203的表达谱（图1）
采用Saini所述方法对LCM分离的前列腺癌原发组织及其配对的相邻正常区域中miR-203的相对表达水平进行RT-PCR分析 等15 RNU48 用作对照。下表总结了前列腺癌肿瘤组织相对于邻近正常组织中 miR-203 的相对表达水平。
通过RT-PCR分析比较显微切割与激光捕获显微切割的PCa组织中miR-383的表达水平（图2）
前列腺癌组织在显微镜下进行显微切割，或经激光捕获显微切割（LCM）后，通过RT-PCR分析肿瘤组织中miR-383的表达水平，并与配对的相邻正常组织进行比较。图中显示了肿瘤样本中miR-383的相对表达水平。以RNU48作为对照。如图2所示，在分析这些组织中的miRNA表达时观察到了差异。...

本文介绍一种简化的微小RNA（miRNA）表达分析方案，适用于存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌（PCa）临床组织样本，采用定量实时聚合酶链式反应（RT-PCR）进行检测。 原位 杂交（ISH）

前列腺癌临床组织中的miRNA表达分析

前列腺癌（PCa）临床管理中的一个关键挑战是现有生物标志物在疾病筛查中的不足，……

本视频的总体目标是介绍一种简化的工作流程，用于利用定量实时 PCR 结合基于锁核酸探针的 C2 杂交技术，对存档的前列腺癌临床标本进行 microRNA 分析。该流程首先通过激光显微切割技术从前列腺癌 FFPE 切片中分离组织，随后进行 microRNA 提取。接着采用两步法 RT-PCR 对组织中的 microRNA 进行定量，并通过使用地高辛标记的 LNA 探针进行 C2 杂交分析以定位 microRNA，信号由 AP 偶联的抗地高辛抗体结合 BM purple 显色检测。上述结果展示了微小RNA在前列腺癌临床组织中的表达。近年来，微小RNA已成为前列腺癌潜在的替代性疾病生物标志物。然而，由于前列腺肿瘤的异质性以及间质污染等因素的干扰，微小RNA表达分析与前列腺癌临床标本的研究常常具有挑战性。我们在 microRNA 和非编码 RNA 领域已研究十年。我们优化了在前列腺癌不同阶段中 microRNA 表达的条件。我们认为，microRNA 表达可作为诊断和预后生物标志物，因为它与前列腺癌的临床结局相关。我们还认为，可以利用纳米颗粒技术将微小RNA（microRNA）用于前列腺癌的治疗。由于病变组织具有异质性，前列腺癌中准确的表达谱分析常常受到阻碍。通过使用激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）技术获取纯的良性或恶性上皮细胞，可部分克服这一问题，从而减少其与基质细胞的混合。对存档的FFP组织进行激光显微切割（LCM），随后进行microRNA表达谱分析，已被证明是一种敏感、可靠且经济有效的补充技术，该技术在C二杂交中得到了优化，可显示microRNA的表达位置。一旦收集到组织并切成10微米切片，需在通风橱中去除石蜡，将载玻片浸入二甲苯中两次，每次10分钟，然后通过将组织转移至一系列逐渐变为水相的酒精溶液中进行再水化。接着，使用苏木精染色30秒，并用水冲洗载玻片。将已复水的组织依次通过另一梯度酒精系列处理，起始浓度为70%。随后将切片浸入二甲苯中5分钟，并使其自然晾干。将干燥的载玻片转移至激光显微切割仪器。利用经病理学家标记的切片确定前列腺癌病灶以及良性或正常区域。按照制造商的说明进行激光显微切割操作。将光束宽度设置为 10 至 20 微米，并以 70 至 90 毫瓦的功率进行脉冲。使用红外脉冲将感兴趣区域捕获到激光显微切割帽上。每个样本中，将管盖内的内容物加入收集管，并立即对细胞进行微小RNA提取。按照生产商说明书，使用 commercial kit 提取总 RNA。用 20 至 30 µL 无核酸酶水洗脱 RNA，并迅速进行后续操作。接下来，使用逆转录反应试剂盒，以 microRNA 特异性引物合成 cDNA。每个反应使用 10 至 100 纳克总 RNA 进行设置。收集后，将 cDNA 稀释 5 至 10 倍，使其浓度约为 1 至 20 纳克。现在使用 microRNA 检测试剂盒和快速通用预混液，以 CD NA 为模板设置 PCR 反应并进行三复孔。以 RNU 48 为模板，计算基因表达的相对变化。采用比较 CT 法，开始对 5 微米厚的组织切片进行预处理。将切片在 56 摄氏度下固定一小时。随后在室温下用两份二甲苯分别浸泡 15 分钟进行脱蜡。脱蜡后，通过梯度乙醇系列对组织进行水化。然后将组织在水中浸泡五分钟。接下来，在室温下用 PBS 中的 4% PFA 固定组织 20 分钟。用 PBS 进行两次、每次五分钟的洗涤，洗去固定剂。然后将蛋白酶 K 按 10 微克/毫升的浓度加入预热的蛋白酶 K 缓冲液中，并在 37 摄氏度下孵育组织 10 分钟。处理后，用含0.2%甘氨酸的PBS缓冲液冲洗载玻片30秒，并在室温下用PBS洗涤5分钟。然后将载玻片再次浸入4%多聚甲醛中固定15分钟。随后，用两次各5分钟的PBS浸泡洗涤，彻底去除固定液。组织现在可以进行杂交。首先，使用记号笔在组织周围画一个疏水圈，以确保后续步骤中的溶液保留在组织切片上。将组织在预杂交缓冲液中于55摄氏度孵育三至四小时。在由浸有50%甲酰胺和50%XSSC溶液的湿毛巾维持湿度的孵育 chamber 中进行此操作。现在配制 diggen 标记的微小 RNA 特异性探针及对照探针，计划将其稀释至20至50纳摩尔浓度；但首先，用比最终稀释所需量略少25微升的杂交缓冲液对探针进行初步稀释。随后，将探针在90摄氏度加热约四分钟。然后将探针置于冰上。最后，用预冷的杂交缓冲液进一步稀释探针，使其最终浓度为 20 至 50 纳摩尔。现在向每张载玻片上加入 100 至 400 微升的探针溶液。然后在适当的杂交温度下孵育12至16小时。次日，按照洗涤步骤使用SSC溶液进行多步洗涤。阻断后，在室温下将切片置于阻断溶液中孵育1至2小时。将组织浸泡在含1:100碱性磷酸酶偶联抗生物素蛋白的PBS中。室温下孵育1至4小时，或在4摄氏度下孵育过夜。随后用PBS洗涤3次，每次10分钟，以去除多余的抗体。在室温下用pee缓冲液洗涤两次，每次五分钟。然后将切片在避光条件下，于室温下用BM purple AP底物孵育1至20小时。次日，用含0.1% PBS溶液冲洗20次以去除BM purple。然后用清水洗涤两次，并按照微小RNA提取和逆转录PCR所述方案，使用水性封片剂进行封片。在前列腺癌及癌旁正常组织中检测了微小RNA 203的表达。在相当一部分组织中，其相对表达量存在差异。RNU 48 用作对照。前列腺癌组织在显微镜下进行显微切割，或经激光捕获显微切割（LCM）处理后，分析其相对 microRNA 3 和 83 在肿瘤组织中的表达水平，并与配对的正常对照组织进行比较。激光捕获显微切割制备的组织可更可靠地检测微小RNA表达。在C中，对正常前列腺癌组织和骨转移性前列腺癌组织进行了微小RNA-203的杂交实验。U six's。采用染色强度作为对照进行RNA检测。每种组织的细胞中，microRNA 203的表达水平按1至4分进行评分。因此发现，骨转移组织中的表达水平在统计学上显著降低。观看本视频后，您应能充分理解如何在前列腺癌临床样本中评估 microRNA 的表达水平。在整个实验流程中，保持无 RNA 环境至关重要。此外，使用多聚甲醛和生理盐水可能具有极高危险性，因此在进行该操作时，必须采取预防措施，例如在通风橱中操作并佩戴个人防护装备。按照该操作流程，我们进行统计学分析，以评估微表达模式是否与疾病的临床病理学变量相关，这有助于回答一些关键问题，例如特定微小 RNA 的表达是否具有相关的预后或诊断价值。我们优化的微小 RNA 原位杂交检测方案可应用于前列腺癌组织切片或前列腺癌组织微阵列。该方案经优化后也可适用于其他类型的组织。

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在前列腺癌的临床组织中miRNA的表达分析

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利用miRNA对乳腺癌组织进行临床病理学分析 原位 杂交

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利用乳腺癌存档样本优化基于RNA的多重表达检测方法

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晚期前列腺癌患者常出现治疗耐药，部分病例中癌症会进展为一种称为神经内分泌型前列腺癌的致死性亚型。研究介导这一转变过程的小分子非编码RNA相关的分子改变，有助于更精确地进行疾病分型，并识别导致神经内分泌型前列腺癌发生的因果机制。...

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通过锁核酸进行微小RNA的扩增与识别 原位 杂交作为一种新型检测与定量方法

学习使用定量实时PCR和原位杂交技术分析前列腺癌临床组织中的miRNA表达。该方法结合激光捕获显微切割和锁定核酸探针，帮助研究人员准确评估miRNA作为诊断和预后生物标志物的潜力。

前列腺癌临床组织中的miRNA表达分析

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