在前列腺癌的临床组织中miRNA的表达分析
2015年9月8日
这里我们描述了一种简化的方案，用于使用定量实时PCR （RT-PCR） 和原位杂交 （ISH） 在存档的福尔马林固定、石蜡包埋 （FFPE） 或新鲜冰冻前列腺癌 （PCa） 临床组织中进行 microRNA （miRNA） 表达分析。
本视频的总体目标是描述一种简化的工作流程，用于对存档的前列腺癌临床标本进行 micro RNA 分析，将定量实时 PCR 和 NC 2 杂交相结合，并实施基于锁定核酸的探针。这是通过首先使用激光捕获显微切割从前列腺癌 FFPE 切片中分离组织，然后进行微 RNA 提取来实现的。接下来的两步 R-T-P-C-R 用于定量组织中的微 RNA，并在 C 中定位微 RNA，使用 digo oxygen 和标记的 LNA 探针以及 AP 偶联抗原和抗体进行两次杂交分析BM 紫检测。
所呈现的结果表明 micro RNA 在前列腺癌临床组织中的表达。使用这些技术最近，microRNA 已成为有前途的前列腺癌替代疾病生物标志物。然而，由于前列腺肿瘤异质性等混杂因素和基质污染等因素，microRNA 表达分析和前列腺癌临床标本通常具有挑战性。
在过去的 10 年里，我们一直在 microRNA 和非编码 RNA 领域工作。我们优化了较严重前列腺癌不同阶段 micro RNA 表达的条件。我们认为 microRNA 表达可以用作诊断和预后生物标志物，因为它与前列腺癌的临床结果相关。
我们还相信 microRNA 可用于使用纳米颗粒技术治疗前列腺癌。前列腺癌中的准确表达谱通常受到病变异质性的阻碍。通过使用激光捕获显微解剖或 LCM 收集纯良性或恶性上皮细胞并减少它们与 str 细胞的混合物，可以部分克服这一点。
已发现存档的 FFP 组织的 LCM，然后进行 microRNA 表达谱分析，是敏感、可靠且具有成本效益的，因为在 C 2 杂交中优化的补充技术提供了 microRNA 表达位置的视图一旦组织被收集并制成 10 微米切片。在通风橱中取出石蜡，将载玻片浸泡在二甲苯中 10 分钟两次，然后将组织移动到一系列逐渐渗入的酒精水浴中，使组织再水化。接下来，涂上火麻色染色剂 30 秒，然后用水冲洗载玻片。
现在再水化，将组织通过另一个从 70% 开始的分级酒精系列，然后将切片浸泡在二甲苯中五分钟，让它们风干。将干燥的载玻片带到激光捕获显微解剖仪器中。使用病理学家标记的载玻片来识别前列腺癌病灶和良性斜线正常区域。
遵循制造商的指南进行激光捕获显微解剖。将光束宽度设置为 10 到 20 微米，并以 70 到 90 毫瓦的功率脉冲。使用红外脉冲将感兴趣区域捕获到激光捕获微量解剖帽上。
对于每个样品，将盖子的内容物添加到收集管中，并立即处理细胞以进行 micro RNA 提取。根据制造商的说明，使用商业试剂盒提取总 RNA。将 RNA 洗脱到 20 至 30 μL 无核酸酶的水中，然后快速进行。
接下来，使用逆转录酶反应试剂盒使用 micro RNA 特异性引物制备 CDNA。使用 10 至 100 ng 总 RNA 构建每个反应。收集后，将 CD NA 稀释 5 至 10 倍，浓度约为 1 至 20 ng。
现在，使用 micro RNA 检测装置和 Fast Universal Master mix 作为对照，从 CD NA 构建 PCR 反应并一式三份。使用 RNU 48 作为模板计算基因表达的相对变化。使用比较 CT 方法开始预处理 5 微米厚的组织切片。
将载玻片在 56 摄氏度下固定一小时。然后用两个 15 分钟的二甲苯浴在设定室温之后对载玻片进行脱水，通过分级乙醇系列对组织进行再水化。然后将纸巾浸泡在水中 5 分钟。
接下来，在室温下用 4% PFA 的 PBS 溶液固定组织 20 分钟。用 PBS 洗涤两次 5 分钟，洗掉固定剂。现在将 10 μg/mL 的强效 aase K 加载到预热的蛋白酶 K 缓冲液上层，并在 37 摄氏度下孵育组织 10 分钟。
处理后，用 0.2% 甘氨酸的 PBS 溶液冲洗玻片 30 秒，然后在室温下用 PBS 洗涤玻片 5 分钟。然后再次将它们浸泡在 4% PFA 中 15 分钟。同样，用两个 5 分钟的 PBS 浴洗掉固定剂。
组织现在可以进行杂交了。首先，使用路径笔在组织周围画一个疏水圆圈，以便后续步骤中的溶液留在组织切片上。将组织在 55 °C 的预杂交缓冲液中孵育 3 到 4 小时。
在用毛巾加湿的腔室中进行此作，用 50% 甲酰胺、50% 五 XSSC 溶液浸泡。现在准备 diggen 和标记的 micro RNA 特异性探针和对照探针 计划进行 20 至 50 纳摩尔的稀释，但首先用少于最终稀释所需的 25 微升杂交缓冲液稀释探针。接下来，将探针加热至 90 摄氏度约 4 分钟。
然后将探针放在冰上。最后，用冰冷的杂交缓冲液进一步稀释探针至其最终浓度为 20 至 50 纳摩尔。现在将 100 至 400 微升探针溶液涂抹到每张载玻片上。
然后在适当的杂交温度下孵育 12 至 16 小时。第二天，在洗涤后分几个步骤进行 SSC 溶液洗涤。封闭后，将玻片在室温下在封闭溶液中孵育 1 至 2 小时。
将组织浸泡在 PBS 中的 1 至 100 AP 偶联的 antio genin 中。在室温下放置 1 到 4 小时，或在 4 摄氏度下过夜。之后，在 PBS 中洗涤 3 次，每次洗涤 10 分钟，去除多余的抗体。
然后在室温下在小便缓冲液中洗涤两次 5 分钟。然后将玻片在 BM 紫色 AP 底物中避光孵育，在室温下孵育 1 小时至 20 小时。第二天，用 0.1% 的 PBS 溶液冲洗 20 次，去除 BM 紫色。
然后在水中洗涤两次，并使用所描述的 micro RNA 提取和 R-T-P-C-R 方案用水性封固剂封固它们。在前列腺癌和正常邻近组织中检查 microRNA 2 0 3。在相当一部分组织中，相对表达存在差异。
使用 RNU 48 作为对照。前列腺癌组织要么在显微镜下显微解剖，要么进行 LCM，然后分析相对 microRNA。3 将肿瘤组织中 83 个表达与匹配对照进行比较。
LCM 制备的组织更可靠地检测 micro RNA 表达。在 C 中，在正常和骨转移性前列腺癌组织中进行 microRNA 2 0 3 的两次杂交。U 6 的。
根据染色强度使用 RNA 检测作为对照。在每个组织的细胞中，microRNA 2 0 3 表达从 1 到 4 评分。因此发现骨转移组织中的表达在统计学上较低。
看完这段视频，你应该对如何评估前列腺癌临床标本中 microRNA 的表达有一个很好的了解。保持无 RNA 环境至关重要。此外，使用 Paraform Hyde 和盐水可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在通风橱中工作和佩戴人员防护设备。
按照此程序，我们进行统计分析以评估微表达模式是否与疾病的临床病理变量相关，这有助于我们回答关键问题，例如特定微 RNA 的表达是否具有任何相关的预后或诊断潜力，我们优化的 microRNA in C 二杂交方案可应用于前列腺癌组织载玻片或前列腺癌组织微阵列。该协议也可以通过优化应用于其他组织类型。
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概述
本文介绍了一种简化的工作流程，用于分析存档的前列腺癌临床标本中的microRNA（miRNA）。所采用的方法包括定量实时PCR和原位杂交，这些方法对于理解前列腺癌组织中miRNA的表达至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 肿瘤学
背景
- MicroRNAs正在成为前列腺癌的潜在生物标志物。
- 分析临床标本中的miRNA表达常常具有挑战性。
- 肿瘤异质性和基质污染等因素使这些分析变得复杂。
- 存档的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织常用于研究。
研究目的
- 提供miRNA表达分析的简化协议。
- 展示定量实时PCR和原位杂交的使用。
- 强调miRNA在前列腺癌研究中的重要性。
所用方法
- 激光捕获显微切割以从FFPE切片中分离组织。
- 从分离的组织样本中提取microRNA。
- 定量实时PCR用于miRNA定量。
- 使用锁定核酸基质探针的原位杂交。
主要结果
- 成功量化了前列腺癌组织中的miRNA。
- 使用原位杂交技术定位miRNA表达。
- 展示miRNA作为前列腺癌的有前景的生物标志物。
- 结果表明所提议的方法对临床标本具有可行性。
结论
- 简化的协议增强了临床组织中miRNA的分析。
- 这些方法可以帮助理解miRNA在前列腺癌中的作用。
- 未来的研究可能集中在克服miRNA分析中的挑战。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate miRNA expression analysis in prostate cancer clinical tissues addresses a critical gap in biomarker-driven discovery and translational research. This workflow enables robust detection and localization of miRNAs, supporting predictive confidence in target validation and disease stratification. The approach directly impacts early discovery inflection points and portfolio prioritization for biomarker development in oncology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of miRNA-driven disease mechanisms in prostate cancer tissues.
- Supports biological de-risking by isolating pure malignant and benign cell populations via laser capture microdissection.
- Facilitates functional target validation through quantitative RT-PCR and spatial ISH analysis.
- Improves predictive confidence for biomarker selection and triage in early pipeline stages.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue samples for downstream quantitative and localization assays.
- Standardizes miRNA extraction and detection protocols for reproducibility across clinical specimens.
- Enables scalable screening of miRNA expression in tissue microarrays and slides.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis and assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA expression profiles with clinical-pathological variables for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis in archived and fresh tissues.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust expression and localization data.
- Provides mechanistic de-risking for candidate miRNA biomarkers in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates from early discovery through translational research, enabling hypothesis testing, target validation, and biomarker qualification in prostate cancer.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of miRNA function and disease association.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative miRNA expression data for assay development and screening readiness.
- Analytics: Provides comparative CT and ISH scoring outputs for robust statistical analysis and condition comparison.
- Translational Research: Aligns miRNA expression with clinical outcomes, supporting biomarker continuity across research stages.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for miRNA analysis in diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biomarker discovery.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of miRNA analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biomarker validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of miRNA-based diagnostic and prognostic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, laser capture microdissection, and molecular analysis.
- Needs access to RT-PCR, ISH instrumentation, and analytical infrastructure for quantitative and spatial readouts.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility across clinical specimens.
- Adaptable to various tissue types with protocol optimization for different disease models.
- Practical limitations include tumor heterogeneity, stromal contamination, and the need for RNA-free environments.
