小鼠圆窗给药法用于耳毒性药物递送：一种诱导耳蜗细胞退变的快速可靠技术

本实验的总体目标是通过将耳毒性物质精准递送至小鼠耳蜗的圆窗隐窝，建立内耳损伤模型。首先，解剖皮下脂肪层并轻柔地分离肌肉组织，以暴露鼓泡骨膜；第二步是通过逐步去除骨碎片打开鼓泡，直至暴露圆窗隐窝。

接下来，彻底干燥中耳和圆窗隐窝的可见液体，以充分暴露圆窗隐窝。最后一步是在不损伤STA足动脉的前提下，将选定的耳毒性药物填充至圆窗隐窝，并根据药物说明书进行相应的重复操作。最终通过功能学检测（包括听觉脑干反应）和形态学评估，以显示耳蜗微结构的选择性保留或退变。

该技术的主要优势，即我们现有的测量方法，在于该操作能够充分暴露错误的窗龛结构，并使药物易于到达耳蜗，从而可直接施加选择性耳毒性老化处理。该技术的优点包括：保留内耳微细结构、避免全身毒性、起效迅速、特定耳蜗细胞类型的可选择性退变，以及结果具有良好的可重复性。该技术可在不同啮齿类动物之间稍作调整后应用，包括大鼠、豚鼠和沙鼠。

现在我将演示我在实验室中的操作流程。所有动物实验均按照相应机构动物护理与使用委员会的指南进行。本文所述的所有脊椎动物实验程序均已获得南卡罗来纳医科大学机构动物护理与使用委员会指南的批准。

根据批准的操作程序对动物实施麻醉后，给予术前镇痛剂，剂量为每千克体重0.1毫克。此处使用的是丁丙诺啡。检查动物是否已达到外科麻醉水平。

小鼠对脚趾夹捏应无反应，且此处所示的书写反射应消失。用1毫升结核菌素注射器吸取0.2毫升含有选定耳毒性试剂的水溶液，注射器需配备钝头的28号半英寸针头，排出注射器内的任何空气，因为气泡可能妨碍试剂的正确施用。使用电推剪去除毛发，去毛区域从耳前皱襞开始，向头部方向延伸至肩带部。

从背部矢状中线向外侧延伸至下颌角进行脱毛。使用一次性剃刀以确保脱毛区域清洁整齐。根据机构规程对准备区域的皮肤进行消毒。

此处以圆周运动方式局部外用碘伏与乙醇交替处理两分钟。在动物身下放置小型加热垫以维持其体温，保持在36至38摄氏度。随后通过头部固定装置固定动物头部。

轻轻夹紧一个小型夹子于动物鼻背处以固定其位置。确认头部固定装置已牢固连接至U形铰接臂的中心。将一根宽1厘米的杆固定在U形臂的左侧，作为左侧头枕，以便暴露右侧操作区域。

将小鼠牢固固定于头部固定装置后，将其旋转至左侧卧位。将身体小心放置于平坦的手术操作面，确保整个操作过程中体位稳定，并避免颈椎受到不必要的扭转应力。在手术区域上方放置一台可提供10倍和20倍放大倍数的手术显微镜。

确认显微镜能够以无需用手扶持的方式保持其位置，以便在显微放大下操作时可同时使用双手进行手术。使用锐利的剪刀或手术刀片，在耳后褶皱前方约六至八毫米处，做一个长约一至1.5厘米的耳后切口。避免过深切割，以保护 underlying 的血管结构。

钝性分离皮下脂肪层。若沿腹侧向内侧方向解剖，需注意避免损伤颈外静脉。若发生出血，可使用可吸收明胶海绵、海绵或棉球压迫止血。

当脂肪层被正确分离后，暴露颈部肌肉组织。一个重要的解剖标志是第11对脑神经的一个小分支，该分支环绕颈乳突（C CTO mastoid）的后缘。为向耳廓方向延伸，使用自持式牵开器将CTO中耳炎相关肌肉本体轻柔地向后牵拉。

轻柔地分离包裹肌体的透明筋膜。同时，将腮腺和颈外静脉轻柔地向对侧牵开。充分暴露CTO乳突肌肌体后，可在鼓泡的内侧窝处观察到鼓泡骨膜闪亮的穹顶，此处为一条深层颈肌的止点。

胸锁乳突肌将进入视野。使用双手技术放置自持牵开器，将CTO乳突分开，轻柔使用双极电凝分离骨膜并暴露其下方的骨组织。然后使用镊子或耳科刮匙轻柔抬起并向周围方向推移骨膜，以充分暴露骨室顶部。

现在使用带传动牙科手机钻头，配以1或2毫米锥形尖端，小心地在鼓泡骨上钻一个2毫米的引导孔。钻孔位置位于鼓泡穹窿的下缘与横跨鼓泡颅侧可见的不透明线之间。接着，在附近小心钻第二个引导孔，以利于使用尖头镊子去除鼓泡骨的骨盖。用尖头镊子朝背侧和下侧方向揭开鼓泡骨。

注意避免刺穿位于骨岬正下方的耳蜗动脉。尽量减少去除的骨质，以防止在施用药物前有过多液体进入中耳。使用纸捻清除中耳及圆窗龛内所有可见液体，直至暴露出干燥的骨面。

此步骤对方案的成功至关重要。在最大放大倍数下观察区域，使用连接1毫升结核菌素注射器的细针头，将一滴耳毒性试剂直接滴加至圆窗龛内，使其完全充满。让试剂在圆窗龛内停留10分钟。

在早期阶段，需密切观察干燥小室底部微弱的光反射是否被暗淡且模糊的液体弯月面所取代。这表明小室正在正常充液。当10分钟完全过去后，彻底吸去原有试剂，并更换为相同试剂的新鲜应用。

应用次数取决于所用试剂。暴露时间通常在30至60分钟之间。最后一次应用后，保持公牛去帽状态，并使用镊子将软组织覆盖于手术部位。

使用4-0非吸收性单股缝线缝合手术部位的皮肤。将动物置于清洁的饲养笼中恢复麻醉，笼内应配备垫料和软质食物。在处死及收获成年C-B-A-C-A-J小鼠耳蜗组织前，每日对动物进行监测。

两种性别的小鼠均暴露于耳毒性试剂庚醇（Hept ethanol），通过圆窗膜扩散给药。与接受假手术并给予生理盐水而非庚醇的对照组动物相比，庚醇处理小鼠在术后第1天至第14天均表现出ABR阈值显著升高。

乙醇在任何测试频率下均未表现出显著的阈值偏移。针对内向整流钾通道的免疫染色（绿色显示）被用作可视化耳蜗结构损伤与恢复的间接方法。在 theria vais 中，染色强度明显降低。

术后第1天，在红色核复染中可见核完整性破坏和染色体浓缩的迹象，这是细胞凋亡的典型特征。当对分层区域的钾通道染色强度进行量化时，经处理耳部显示出在七氟烷暴露后初期出现低谷，随后第7天染色强度显著恢复至接近对照水平，并在此后持续恢复。一旦掌握熟练，若操作得当，该操作可在30至60分钟内完成。

需要牢记的是，额外的暴露或补充可能有助于避免因血液浓缩或组织间液导致耳毒性药物被意外稀释。然而，采用这种方法时应谨慎，因为它容易增加意外损伤耳蜗动脉或向圆窗隐窝引入组织间液的风险。这种微创技术可实现对精细生化过程的深入研究，在推进我们对耳蜗体内再生潜力相关研究方面具有重要意义。