Name: 老鼠圆窗途径耳毒性剂递送:一个快速和可靠的技术诱导耳蜗细胞变性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 了解通过圆窗途径向小鼠耳蜗递送耳毒性剂的外科技术，用于建立内耳损伤模型并研究耳蜗细胞变性。该方法可保留耳蜗微结构，适用于听觉神经科学和耳毒性研究。

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本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号：NIH P50DC00422（H.L.）；NIH R01DC12058（H.L.）。本研究还受益于南卡罗来纳临床与转化研究研究所（SCTR）的临床与转化科学奖（NIH/NCRR UL1RR029882）。资助方在研究设计、数据收集和/或分析中未发挥任何作用。作者谨此感谢Lonnie E. Brown Jr.在艺术设计和图形制作方面的贡献。

所有动物研究均按照相应机构动物护理和使用委员会的指南进行。本文所述的所有脊椎动物实验程序均经南卡罗来纳医科大学（MUSC）机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南批准。
1. 模型选择
<ol>
	<li>在动物准备使用之前，按照机构规定的操作规程，在低噪声动物饲养室中进行常规护理和维持。在动物实验设施（ARFs）中，应维持符合美国国立卫生研究院（NIH）标准的振动稳定性、噪声阻尼、昼夜照明、准备区域、表面材质、密封处理以及通风条件。 
	注意：有关动物实验设施（ARFs）及低噪声动物饲养室维护的美国国立卫生研究院（NIH）指南，可查阅：http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/</li>
	<li>所有实验均以右耳作为实验耳。左耳作为动物个体内的对照耳，不进行任何手术干预。</li>
	<li>术前检查模型动物是否存在中耳或外耳感染的迹象。可能的表现包括耳部分泌液体或脓液、耳廓组织发炎和/或动物精神萎靡。此类情况较为罕见，但若发现，应避免实施进一步手术，并对动物进行适当治疗。</li>
</ol>
2. 术前准备
<ol>
	<li>30分钟后麻醉动物&#160;手术前及任何围手术期操作前，通过腹腔注射（IP）给予氯胺酮（100 mg/kg IP）和赛拉嗪（20 mg/kg IP）进行麻醉。根据脚趾夹捏反射阳性判断是否需要追加麻醉，必要时追加较低剂量的氯胺酮（25 mg/kg IP）和赛拉嗪（5 mg/kg IP）。给药剂量应符合机构批准的小鼠麻醉方案，并根据小鼠年龄进行相应调整。</li>
	<li>检查模型动物是否完全麻醉。在整个所述实验过程中，应确保动物处于麻醉第3阶段，其标志为呼吸频率规律、无翻正反射（在小鼠中）以及无足底和眼睑（夹趾）反射。维持动物在此麻醉水平。这对于最大限度减少手术期间的疼痛、术中移动、出血及间质液渗漏至关重要。</li>
	<li>使用闭环加热垫将动物体温维持在 37.5 °C。</li>
	<li>通过皮下注射布托啡诺给予镇痛。手术前30分钟皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg，单次给药）以减轻手术相关不适。根据机构批准的方案确定给药剂量及适用于所选动物模型的替代镇痛方案。若严格遵循无菌操作技术，则无需使用抗生素。&#160;若动物出现疼痛和痛苦的迹象，则给予术后镇痛治疗。</li>
	<li>术前进行生理学检测。在术前以及动物处死前立即进行听觉脑干反应（ABR）测试和/或畸变产物耳声发射（DPOAE ）测试，可作为评估所选耳毒性药物对小鼠听力影响的客观指标。</li>
</ol>
3. 手术准备与体位摆放
<ol>
	<li>根据机构标准在术前对所有器械进行灭菌。以一致、无菌且有序的方式准备手术器械和手术区域，以避免手术过程中不必要的操作和移动。通常所需的器械包括锐利的解剖剪、数对尖端为珠宝匠用的金属镊子、耳科钩、耳科刮匙以及双极电凝装置（图1）。</li>
	<li>提前准备并灭菌由实验室擦拭纸制成的纸捻：取一小块三角形擦拭纸（约 0.7 英寸 × 1.25 英寸 × 1.75 英寸），用一只手的拇指和食指将其紧密捻成约 1.25 英寸长的细条。制作出紧密捻紧、极细的纸捻是手术成功的关键。术前共准备 15–20 根纸捻（图2）。</li>
	<li>使用牙科钻以可控方式快速穿透鼓室骨壁。建议使用带皮带传动的牙科手柄钻，配备 1 或 2 mm 锥形钻头。完成本操作步骤需要使用手术显微镜。（参见步骤 4.7）</li>
	<li>预先用 1 ml 结核菌素注射器（配 28 G、1/2 英寸针头）抽取 0.2 ml 含选定耳毒性药物的水溶液。通常 1 滴（约 10 µl）药物即可完全填充小鼠圆窗龛（RWN）。使用金属制钝头注射针可便于给药，同时避免锋利斜面针头损伤下方结构。务必排出注射器内的所有空气，因为气泡可能意外填充圆窗龛和/或阻碍药物直接作用于圆窗膜。</li>
	<li>使用电动剃毛剪去除耳后皮肤的毛发。剃毛区域应从耳头皱褶向前延伸至肩带向后，从背侧正中矢状线向外侧延伸至下颌角。彻底去除毛发对于维持清洁清晰的手术视野至关重要。轻柔刷除手术区域内的毛发碎屑。</li>
	<li>按照机构规程对已准备区域的皮肤进行消毒。以圆周方式交替外用聚维酮碘（碘伏）和乙醇，持续 2 分钟。可根据机构指南替换为其他消毒剂。</li>
	<li>将动物置于平坦表面上，以在手术过程中保持体位恒定。在动物身下平台处放置小型加热垫，以控制体温并维持在 36–38 °C。避免过热，否则可能导致轻度至重度皮肤损伤和/或提前实施安乐死。
	<ol>
		<li>通过咬合固定器/头架装置固定动物头部。使用由黄铜加工制成的 0.5 cm × 2 cm 咬合块，沿其长轴方向以 5 mm 间隔钻出直径为 2–4 mm 的孔。将动物口腔张开套入该装置，并根据动物大小将其上颌中切牙嵌入其中一个孔内。轻轻收紧一个小夹具于动物鼻背以固定其位置（图3）。</li>
		<li>确认咬合块/头架牢固连接至 U 形可调节臂的中心位置（图3）。将一根宽 1 cm 的金属杆固定在“U”形臂的左侧，并用作左侧头部支撑（右侧始终作为手术侧）。</li>
		<li>动物在头架中牢固固定后，将其旋转至左侧卧位。仔细调整身体在平坦手术台上的位置，确保整个手术过程中体位稳定，并避免颈椎受到过度扭转应力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将具备 4×、10× 和 20× 放大功能的手术显微镜置于手术区域上方。确认显微镜可在无需手动扶持的情况下保持稳定位置，这对于下文所述的双手操作手术方案极为理想。</li>
	<li>将配有精细尖端珠宝匠手柄的双极电凝装置放置在便于随时取用的位置，用于小血管电凝及组织分离。若出现较大量出血时，此设备亦可能必需。</li>
</ol>
4. 手术入路
<ol>
	<li>在显微放大条件下，使用锋利的剪刀或手术刀片于耳后作一长约1-1.5 cm的切口，切口位置大约位于耳头褶皱后方6-8 mm处。在成年小鼠中，从背侧中线向外侧延伸至下颌角附近的切口已足够。操作时应小心避免过深切割，以保护下方的血管结构。</li>
	<li>仔细进行钝性分离，穿过厚度可变的皮下脂肪层。如有需要，可安全地去除部分脂肪以改善术野暴露。当向腹内侧方向分离时需格外谨慎，因外颈静脉横穿该区域，损伤此结构可能导致大量出血并淹没手术视野。使用可吸收明胶海绵和/或棉球控制任何过度出血；对于较严重的出血，应使用双极电凝止血。</li>
	<li>当脂肪层被充分分离后，暴露出颈部肌群。注意识别重要结构：在暴露的手术视野中央可见较大的肩胛舌骨肌肌体，腹侧为外颈静脉，头侧则有覆盖于下颌角上方的腮腺组织。一个重要的解剖标志是来自第XI对脑神经的一小分支，该神经绕过肩胛舌骨肌的后/背侧边缘，并向前延伸至耳廓（图4）。</li>
	<li>轻柔地将肩胛舌骨肌肌体向后/背侧方向牵拉（图4、图5）。随后轻柔切开包裹该肌体的透明筋膜。以类似方式，将腮腺和外颈静脉向相反方向（即前/腹侧）轻柔牵开（图5）。</li>
	<li>在肩胛舌骨肌肌体得到良好牵拉后，鼓泡骨膜的光亮穹顶将显露出来（图6）。在鼓泡的尾侧部分，可观察到另一深层颈肌——胸锁乳突肌的止点（图6）。注意保护面神经，该神经在鼓泡穹顶的背侧和头侧区域变得可见。在开始钻骨前，放置自持式牵开器（无菌钛合金杆——嵌入一次性硅胶膏中）。</li>
	<li>采用双手操作技术，使用双极电凝轻柔切开鼓泡骨膜，以暴露其下方的骨面。使用镊子或耳科刮匙，将骨膜向周围方向轻轻抬起并推离，以充分暴露鼓泡穹顶。 
	注意：步骤4.6对于最大限度地暴露中耳腔至关重要。应精细且轻柔地处理软组织，避免出血或钻孔后间质液渗入鼓泡腔。</li>
	<li>在充分暴露鼓泡穹顶后，使用牙科手术钻头在穹顶尾侧边缘与横跨鼓泡头侧区域的明显不透明线（代表鼓膜位置）之间，钻出一个直径约2 mm的引导孔（图7）。注意仅穿透骨质，避免损伤其下方结构（如镫骨动脉）。在附近再钻第二个引导孔，以便去除鼓泡骨顶（图7）。</li>
	<li>使用精细镊（珠宝匠型尖头镊），将鼓泡骨盖向背侧和尾侧方向揭开（图8）。在高倍放大下逐块移除骨组织。切勿穿破位于鼓泡盖正下方的镫骨动脉，因其出血可能影响手术进程。应尽量减少骨质去除量，以防止过多液体进入中耳，同时仍需确保对圆窗隐窝的良好视野和操作通路（图8）。</li>
</ol>
5. 耳蜗圆窗给药耳毒性物质
<ol>
	<li>轻微旋转调整头部固定装置，使圆窗龛（RWN）正对视野。RWN通常位于中耳腔的背侧和尾侧，表现为耳囊骨上的杯状凹陷。大多数情况下，镫骨动脉位于其腹侧/头侧约1-2 mm处。有时RWN可能因鼓室穹顶的锐角转折而偏于外周。此时，动物头部的精确摆放至关重要。
	<ol>
		<li>使用术前准备好的纸捻，清除中耳和RWN内所有可见液体，直至暴露出干燥的骨面。 
		注意：这是整个实验方案中最关键的一步，因为滴加至RWN的约10 µl（1滴）耳毒性试剂可能被残留液体稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在最大放大倍数下，使用连接1 ml结核菌素注射器的细针头，将一滴（约10 µl）耳毒性试剂直接滴加至RWN内，使其完全充满。操作时注意避免损伤镫骨动脉，并密切观察：当干燥的RWN底部原有的微弱反光被暗淡、模糊的液面弯月面取代时，提示RWN已正确充填。
	<ol>
		<li>让试剂在RWN内停留约10 min&#160;暴露时间。此后，彻底吸除试剂，并重新滴加相同试剂。重复滴加次数应根据试剂说明书确定。本操作的总暴露时间通常在30至60 min之间。</li>
		<li>操作结束后，最后一次彻底吸除试剂，并向RWN内滴加新鲜试剂。保持鼓室开放，用镊子将软组织覆盖于手术部位上方。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用4-0不可吸收单股缝线缝合皮肤层切口。将动物置于恢复笼/恢复站中。术后定期监测动物的临床状况。维持适宜的环境条件，包括使用柔软垫料饲养并补充软质食物，以尽量减少应激。后续操作及术后管理应依据机构IACUC规程执行。</li>
	<li>按照机构IACUC规程，在用于下一只动物前对器械进行灭菌处理。器械使用之间应留出足够的冷却时间。</li>
</ol>
6. 术后操作与耳蜗组织采集
<ol>
	<li>如步骤2.5所述，在术后不同时间点进行听觉生理学检测，并在处死动物前完成检测。根据实验目的执行术后操作。可在任意选定的术后时间点处死动物。</li>
	<li>按照机构IACUC规程要求，通过腹腔注射实施完全麻醉后处死动物。使用锐利的剪刀在枕骨后方稍远处将动物断头。沿背侧和腹侧中线用剪刀切开颅腔并充分展开。轻柔地挖除脑组织以暴露颞骨。 
	注意：从本步骤起，可开展多种用于研究耳蜗暴露后变化的实验流程，相关内容将在讨论部分提及。应根据实验目的选择最合适的检测方法。若计划在耳蜗切片后进行电子显微镜观察，需通过心脏插管对组织进行预先固定。此操作超出本文讨论范围，已有其他文献对此进行详细阐述。13 </li>
	<li>用剪刀将颞骨从颅底完整剪下，并立即放入固定液中。将骨组织直接浸入4%多聚甲醛溶液，在室温下固定1.5小时。需密切监控固定时间，因过度固定可能影响后续组织学分析的结果。将分离的骨组织浸入1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，进行可变时长的脱钙处理。</li>
</ol>

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</ol>

不存在利益冲突。作者无任何需要披露的内容。

上述方案及代表性结果是在包含两种性别的 CBA/CaJ 小鼠模型中获得的。该近交品系在听力研究中被广泛确立为“良好听力”标准和“正常衰老”模型16-23。本文未涉及该方案在其他哺乳动物模型中的应用描述。然而，读者应注意，RWN 应用技术在研究哺乳动物内耳方面具有多项优势。其中最显著的是，该技术避免了对耳囊壁内存在的精细解剖结构和生化梯度的直接破坏。诸如耳蜗造口术和输注泵植入等操作容易直接损伤内耳结构，导致永久性听阈偏移；在分析实验结果时必须考虑这一因素。侵入性方法对耳蜗侧壁结构的破坏还可能限制耳毒性药物（如呋塞米或庚醇）的使用，因为这些药物的特定作用区域正局限于该部位15,24。其他非侵入性方法，如经鼓膜注射和肠外注射，常因结果不可靠和/或对动物模型产生全身毒性而受到困扰。该给药方法已被证实可避免上述两种缺陷，达到与前述侵入性方法相当的一致性水平。
该技术的其他优势还包括其对多种动物模型具有广泛的适用性，并且易于整合到现有的实验室基础设施中。就后者而言，除了所选用的耳毒性药物、麻醉剂和镇痛剂外，无需特殊的试剂或化学品。耳毒性药物通常以固定浓度使用，并溶于足够大的溶液体积（5 ml）中，考虑到每次应用仅使用约10 µl（在小鼠中），该溶液可长期保存使用。因此，在完成初始的耗材和仪器采购后，研究人员基本上无需再花费大量时间配制溶液或频繁更换材料。该技术还可缩短手术时间，与需要植入耳蜗周围输液泵或进行耳蜗开窗术的操作相比，这一优势尤为显著。当操作技术达到一定熟练程度后，从开始切口到缝合关闭的平均完成时间通常为20分钟&#160;至1.5小时，具体时长取决于耳毒性药物所需的作用时间。每天可轻松完成三到四台手术，从而提高实验效率并增加获得成功结果的可能性。如上所述，该技术还可方便地应用于多种啮齿类动物模型，包括小鼠、大鼠、豚鼠和沙鼠。
该方法的局限性主要在于掌握该技术需要相对较陡的学习曲线，在达到技术熟练之前预期效果较差。正如下文将详细讨论的，手术入路过程中的微小失误或手术视野可视化不足几乎 invariably 会导致不良结果。一些细微的发现，初学者可能难以识别，例如厚度小于1毫米的气泡阻碍药物接触圆窗膜，或间质液稀释药物等，需要一定时间才能认识并发展出纠正这些问题所需的运动技能。然而，通过反复操作该程序，这些障碍很容易克服，对研究者而言，其技术挑战性远低于前述某些侵入性方法。最后，该技术存在一个相对局限，即耳蜗损伤只能在手术暴露期间的单一时间点诱导。这一局限在一定程度上可通过将含药的可吸收明胶海绵填入圆窗龛（RWN）来克服，如 Heydt 等人.10 所述。可吸收明胶海绵会随时间逐渐吸收，但相比单纯使用水溶液，可能实现更长的药物暴露时间。
为了使研究人员充分获得该技术的全部优势并避免潜在问题，必须认识到该技术的两个关键要素：1）持续稳定地观察中耳腔和圆窗龛（RWN）；2）保持手术区域无间质液和/或血液。在实现前者时，合适的头固定装置的重要性再怎么强调也不为过。牢固固定动物头部可确保在显微镜下获得稳定的视野；当精细的操作器械在放大条件下导致结构位置发生微小变化时，这一点的重要性便显而易见。一个能够围绕动物头部长轴（前后轴）旋转的良好头固定装置，也有助于研究者调整视线角度，实现重要的动态观察。通常，围绕该轴旋转几毫米，就可能决定能否观察到圆窗龛，还是只能看到耳囊骨。持续调整视角的能力对于彻底清除隐窝深处的间质液，以及在每次给药间隔完全清除耳毒性药物（如第5部分所述）也至关重要。根据我们的经验，进入中耳腔的血液、冷凝水或间质液可能干扰整个实验过程。这一点并不意外，因为施加到圆窗上的耳毒性药物量极少（约10 µl），即使接触到少量外来液体，也容易被稀释。因此，精细的外科解剖、逐步去除鼓室骨壁以及小心保护镫骨动脉，对于获得成功的实验结果至关重要。
如果遵循了上述关键步骤但仍未能达到预期结果，则应开始排查问题。根据我们的经验，通常有助于尝试对两个操作要素进行试验性调整。第一个要素是修改耳毒性药物在圆窗处的更换频率。根据所用药物的不同，总暴露时间在30 min&#160;至1小时之间，每10分钟完全吸除并重新添加药物一次。如果暴露时间较短，延长总体暴露时间可能有助于药物更充分地透过圆窗膜扩散。额外的暴露和补充更换也有助于避免如上所述的血液、冷凝液或组织间液对耳毒性药物的稀释作用。然而，采用此方法时应谨慎，因为这往往会增加意外损伤镫骨动脉和/或向圆窗龛引入组织间液的风险。
该技术在耳蜗生理学和病理生理学研究中具有重要意义。这种微创技术能够对精细的生化过程进行详细研究，并在推进我们评估耳蜗再生潜力的研究中发挥了关键作用12,24。该手术入路和暴露方法也被广泛应用于多种衍生技术中，已有研究报道采用该方法在耳蜗干细胞移植研究中取得了成功14。然而，目前关于耳蜗仍有许多未知之处，但此技术结合研究者可采用的其他多种研究手段，将有助于缩小这一知识空白。

研究人员已采用多种动物模型来研究听觉系统的正常功能以及听力损失的病理生理学机制。这些模型对于开展针对各种病理过程的干预研究也极为有用，并为在人体中进行转化应用奠定了基础。在大多数涉及耳蜗及其相关听觉通路的研究中，必须对系统引入一定程度的损伤或干扰。通常，这种损伤是有意造成的，以形成特定的病灶，从而使研究人员能够研究该病灶对正常功能的影响，以及耳蜗从中恢复的能力。在选择特定动物模型和/或引入损伤的技术时，必须考虑多种因素，以获得最佳研究结果。不同动物模型对干预措施的反应可能不同，而某种技术的直接和间接效应可能完全不利于预期结果。在大多数情况下，理想的内耳损伤方案应避免全身毒性，能够快速且可靠地产生损伤，形成精确且一致的病灶，并允许动物存活，以便进一步研究功能、细胞和分子层面的变化。理想情况下，这些方法还应尽可能保护耳蜗精细的微细结构和电化学梯度。
迄今为止，研究人员已成功建立了多种诱导内耳损伤的技术。这些技术大多通过全身给药或手术途径将耳毒性物质暴露于耳蜗。具体方法包括肠外注射、腹腔内注射、经鼓膜注射、内淋巴囊注射，以及耳蜗造口术联合迷路周围灌注。上述技术已被用于引入多种耳毒性物质，例如呋塞米、庆大霉素、哇巴因和庚醇。1-5 尽管这些方法在产生特定耳蜗病变方面取得了成功，但也存在公认的局限性。全身注射可能对动物产生高度毒性，并可能引起非预期的耳蜗损伤以及实验结果不一致。后一缺陷同样见于经鼓膜注射。耳蜗造口术和迷路周围灌注等技术虽然能够快速且可靠地诱导病变，但会直接侵入内耳结构并影响其功能。许多手术方法还具有较高的技术难度，且可能需要在动物体内留置异物，例如微型泵输注装置。2-4,6-8 目前尚无任何单一技术完全无缺陷，研究人员必须根据实验需求谨慎选择方法。本文中，我们将详细描述一种用于成年小鼠耳毒性物质局部给药的圆窗龛（RWN）应用技术。
1998年，Husmann 等人在研究庆大霉素对鸟类模型中感觉毛细胞变性的影响时首次描述了该技术，发现其相较于全身应用庆大霉素，能够产生更可靠的损伤效果，同时避免相关毒性作用。9 自此以后，包括本实验室在内的多位研究者已成功应用该技术。2004年，Heydt 等人将其改进并应用于小鼠模型，通过在圆窗龛（RWN）中填入经不同浓度庆大霉素浸泡的可吸收明胶海绵，实现了对损伤范围更精确的控制。10 Palmgren 等人于2010年通过将β-布unganotoxin（台湾环蛇毒液中的一种强效成分）的水溶液施加于成年大鼠的圆窗龛，研究了其耳毒性作用。11 此外，本实验室先前的多项研究也采用圆窗途径，探讨了呋塞米、哇巴因和庚醇的耳毒性效应。5,6,12-15 这些研究结果揭示了耳蜗液体及离子稳态对正常听力的重要性，发现了螺旋神经节和耳蜗侧壁细胞的增殖能力，并进一步加深了我们对年龄相关性听力损失的理解。
以下方法包括通过耳后切口并部分去除骨性鼓泡的顶壁，以外科方式进入中耳。该入路可充分暴露圆窗神经（RWN）及其膜结构，便于直接施加选定的耳毒性药物。液态药物随后积聚于RWN的杯状凹陷内（或从填塞于RWN内的饱和可吸收明胶海绵载体中缓慢释放），并通过圆窗膜扩散至耳蜗前庭的外淋巴腔。本方法不进行直接的耳蜗造口。该技术的优点包括保留内耳微细结构、避免全身毒性、可在同一动物体内设置对照耳、效应起始迅速，以及对特定耳蜗细胞类型的选择性退变例如，经哇巴因处理后获得的I型螺旋神经节神经元，以及通过庚醇处理诱导的耳蜗II型成纤维细胞），且结果可重复、可靠。该技术在其他啮齿类动物物种（包括大鼠、豚鼠和沙鼠）之间稍作调整即可应用。其局限性包括技术学习曲线较陡，以及耳毒性损伤仅限于单一时间点，具有相对局限性。

<table><tbody><tr><td>1-庚醇 98%</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>H2805&amp;nbsp;</td><td>&lt;a&gt;PubChem 物质 ID 24895536&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ketaset 注射液&amp;nbsp;</td><td>帕特森兽医公司</td><td>07-803-6637&amp;nbsp;</td><td>浓缩液 100 mg/ml</td></tr><tr><td>（盐酸氯胺酮）</td><td>10 ml</td><td>CIII 类管制物质</td><td></td></tr><tr><td>Anased 注射液</td><td>劳埃德实验室</td><td>NADA# 139-236</td><td>浓缩液 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Buprenex 注射液&amp;nbsp;</td><td>帕特森兽医公司</td><td>07-850-2280&amp;nbsp;</td><td>浓缩液 0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>（盐酸丁丙诺啡）</td><td>每盒 5 支安瓿</td><td>CIII 类管制物质</td><td></td></tr><tr><td>贝塔碘皮肤准备液</td><td>美迪科</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.medline.com/sku/item/MDPMDS093941;ecomsessionid=1UZWKxhkYkuy9vK2NXBaBA__">MDS093941&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td>1 夸脱螺旋盖瓶</td></tr><tr><td>0.9% 无菌生理盐水</td><td>可变</td><td></td><td>用于配制溶液和注射</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>32192</td><td></td></tr><tr><td>受控声学环境隔音室</td><td>工业声学公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科头架</td><td>定制 &amp;ndash;&amp;nbsp;</td><td>请参见图 3</td><td></td></tr><tr><td>南卡罗来纳医科大学</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>颈部软组织牵开器（金属窥器，钛制）1.75 英寸</td><td>世界精密仪器公司</td><td>555801L</td><td>最大张开距离 20 mm</td></tr><tr><td>嵌入一次性腻子中以动态固定于头架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90N 牙科皮带驱动手钻&amp;nbsp;</td><td>Emesco</td><td>复古产品</td><td></td></tr><tr><td>6 号手术刀柄</td><td>Bard-Parker</td><td>MEDC-011990</td><td></td></tr><tr><td>#15c 不锈钢外科手术刀片&amp;nbsp;</td><td>Bard-Parker</td><td>SKU: 097-7215</td><td>每盒 50 片</td></tr><tr><td>通过 ACE 外科用品编码</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>直头珠宝镊&amp;nbsp;</td><td>Bernell</td><td>MIL17304</td><td></td></tr><tr><td>弯头虹膜剪</td><td>美迪科</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04026;ecomsessionid=ozXzkfIx-tj0MIi8FkGQ0A__">DYND04026&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>直头虹膜剪</td><td>美迪科</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04025;ecomsessionid=+43JREOby+Mfz6IIgoSg5A__">DYND04025&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Stevens 肌腱切断剪（直头）</td><td>美迪科</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.medline.com/sku/item/MDPMDG3222111">MDG3222111&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Rosen 耳针（直杆，轻度弯曲尖端）</td><td>MytaMed</td><td>货号 6.56.00</td><td>图 1 展示了带角度杆的取样工具，后被 Rosen 取样工具替代</td></tr><tr><td>Rosen 耳针（直杆，强弯曲尖端）</td><td>MytaMed</td><td>货号 6.56.01</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 精细任务擦拭纸&amp;nbsp;</td><td>Kimtech 科学</td><td>编号 34155&amp;nbsp;</td><td>白色，尺寸 4.4×8.4 英寸。裁成三角形并卷成细尖灯芯状。</td></tr><tr><td>House 耳刮匙，6&amp;rdquo; 杆，轻度角度</td><td>美迪科</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.medline.com/sku/item/MDPMDG0396486">MDG0396486&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam（可吸收明胶海绵）100 号</td><td>美迪科</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.medline.com/sku/item/MDPIIS34201">IIS34201&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td>可进行替代</td></tr><tr><td>棉球 #3，直径 4 mm</td><td>Richmond</td><td>制造商编号 100108</td><td></td></tr><tr><td>电外科工作站 100 E M/M</td><td>Elmed</td><td>目录号 52-5770</td><td>具备双极和单极功能</td></tr><tr><td>1 cc U-100 胰岛素注射器，28G，0.5&amp;rdquo; 长针头</td><td>BD</td><td>产品编号：329410</td><td>可选，用于递送耳毒性试剂</td></tr><tr><td>23G，钝头，1&amp;rdquo; 长针头</td><td>Kendall</td><td>产品编号 8881202397</td><td>用于更安全地递送耳毒性试剂，降低损伤镫骨动脉的风险</td></tr><tr><td>外科口罩</td><td>U-line</td><td>S-10478</td><td></td></tr><tr><td>检查级腈类外科手套</td><td>U-line</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.uline.com/Product/Detail/S-12549/Nitrile-Gloves/Nitrile-Exam-Gloves-Powder-Free">S-12549&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>精密毛发剪刀</td><td>Wahl</td><td></td><td>可使用多种型号替代</td></tr><tr><td>5-0 黑色单丝尼龙缝线，配 PC-1&amp;nbsp;13 mm 3/8 圆弧针</td><td>Ethilon</td><td>1855G</td><td>可进行替代。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>自封式灭菌袋</td><td>费舍尔</td><td>01-812054</td><td></td></tr><tr><td>干式灭菌器</td><td>ROBOZ</td><td>Germinator &lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 500</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠圆窗给药法用于耳毒性药物递送：一种诱导耳蜗细胞退变的快速可靠技术

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

研究人员已采用多种动物模型和研究技术来探索哺乳动物的听觉系统。涉及耳蜗及其相关神经通路的基础研究，通常需要将模型动物的耳蜗暴露于多种耳毒性物质中。这使得研究人员能够研究耳蜗结构在受到靶向损伤后的影响，以及在某些情况下这些结构的自我修复或再生能力。目前存在多种将耳毒性物质递送至耳蜗的技术。在选择特定方法时，研究人员必须综合考虑多个因素，包括是否可能引发意外的全身毒性、手术操作本身对耳蜗造成的损伤程度、所需损伤类型、动物存活率以及实验结果的可重复性和可靠性。目前已建立的技术包括肠外注射、腹腔内注射、经鼓膜注射、内淋巴囊注射以及耳蜗开窗联合外淋巴灌注。这些方法均已在文献中得到成功应用并被详细描述；然而，每种方法均存在一定的局限性。本文介绍一种将耳毒性物质直接局部应用于圆窗龛的技术。该技术对内耳结构无创，可快速产生可靠且靶向明确的病损，避免了全身毒性，并允许在同一动物体内设置对照（对侧耳）。采用该方法所获得的研究结果，有助于深入理解听觉病理生理学、耳蜗细胞退变过程以及在急性损伤后的再生能力。未来的研究可利用此方法开展干预性研究，例如基因治疗和干细胞移植，以对抗听力损失。

在Stevens等人最近的一项研究中，采用上述方案，通过圆窗扩散使雌雄成年CBA/CaJ小鼠暴露于庚醇（heptanol）中15。庚醇是一种缝隙连接解偶联剂，已知可对耳蜗侧壁细胞造成靶向性、可逆性损伤。该研究旨在建立一种可靠的靶向性耳蜗损伤模型，以用于术后受损结构再生能力的评估。术前与术后的听力阈值作为功能性终点指标。通过显微镜观察及免疫组织化学染色技术评估形态学变化。在庚醇处理的小鼠中观察到ABR阈值显著升高（图9）。接受假手术处理的对照组动物，仅给予生理盐水而非庚醇，其在任何测试频率下均未出现显著的阈值偏移。
针对内向整流钾通道（Kir）4.1 的免疫染色被用作可视化耳蜗结构损伤/恢复的间接方法。该方法显示出处理耳与对照耳之间高度可重复的差异。在辛醇暴露后1至3天内，血管纹（StV）和螺旋韧带（SLF）I型至III型纤维细胞区域的整体染色强度显著降低，表明这些区域受到了大量靶向性损伤。SLF II型和IV型区域（图10）以及血管纹区域（图11）的Kir 4.1染色强度尤为减弱。在这些耳蜗区域的细胞核复染中，还观察到细胞凋亡典型的核完整性破坏以及染色体凝聚/出泡现象（图10）。Kir 4.1染色出现的空泡化区域在7天时明显消退，并在14天时完全消失。当对血管纹区域的Kir 4.1染色强度进行定量分析时，处理耳显示出初始的低谷，随后在辛醇暴露7天后显著回升至接近对照组的染色强度（p &lt; 0.05）（图12）。
<img alt="无菌托盘上的手术器械设置；用于医疗操作的剪刀、镊子和探针。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 器械准备。 术前器械准备示意图。所有设备应置于无菌手术区域内并易于取用。典型器械包括2把锐利的解剖剪、2-3把直头和/或弯头珠宝匠镊（配耳刮匙）、弯柄耳科挑针（后替换为Rosen挑针——图中未示出），以及配备精细弯头珠宝匠镊头端的电凝装置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于实验室吸收实验的培养皿，内含滤纸和棉花装置。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 手术用品。用于维持圆窗膜（RWN）环境的额外耗材。左侧为用于制作纸芯的灭菌实验擦拭纸裁剪件，中间为由灭菌实验擦拭纸紧密卷成的纸芯，右侧为4 mm棉球，用于吸除圆窗龛内多余的液体和血液渗出物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织切割手术装置、精确切口技术、实验研究装置示意图" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 动物头部固定装置。图像显示了头部固定装置与咬合块。咬合块上的孔洞可嵌合并固定上颌中切齿。通过夹具轻柔地夹紧动物鼻背以将其稳固在位。使用头部固定装置对确保手术成功至关重要。理想情况下，该装置应可围绕动物头尾轴旋转，以便在操作过程中优化对鼓室的手术视野。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="解剖图，啮齿类动物颈部肌肉，胸锁乳突肌标注。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 胸锁乳突肌。示意图展示啮齿类动物颈部肌肉的基本解剖结构及其与颈外静脉的关系。在手术入路过程中，胸锁乳突肌是最容易辨认的肌肉。松解包绕的筋膜后，将肌体向后/背侧牵拉，可引导手术分离方向指向鼓泡（黑色圆圈）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="标注为 A、B、C 的解剖结构；用于组织形态学教学研究的显微图像。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 手术暴露区域。显示在切开皮肤及皮下脂肪层后的暴露情况。重要的解剖标志包括覆盖在斜方肌-胸锁乳突肌（cleidomastoideus muscle）上方的第XI脑神经分支（A）、外颈静脉（B）以及暴露的腮腺组织（C）。第XI脑神经分支常伴有一小血管，须在继续操作前将其切断。图像中从右至左对应动物的头端-尾端轴。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示标记区域A、B、C的组织样本显微图像，用于解剖结构分析。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 暴露鼓泡。 在牵开胸头乳突肌及周围结构后暴露鼓泡。显著的解剖标志包括向后/背侧翻起的胸头乳突肌肌体（A）、面神经（B）以及鼓泡骨膜光亮的穹顶（C）。另请注意胸乳突肌在鼓泡左后部的附着点（星号）。面神经位于鼓泡的背侧和头侧，是准确识别鼓泡的关键解剖标志。图像中从右至左对应动物的头-尾轴方向。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织中的手术部位感染，显微镜图像，感染诊断，医学研究示意图。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 暴露圆窗隐窝 I。图像显示在剥离覆盖的骨膜后，鼓泡已完全暴露。导孔的最佳位置位于鼓泡穹窿尾侧边缘与鼓泡头侧部分可见的一条细微不透明线（代表鼓膜）之间的中点处。第二个相邻的导孔可能有助于更轻松地去除鼓泡骨的顶部。应避免深部钻孔，以防损伤下方的镫骨动脉。图像底部的深色金属物体是钛制软组织牵开器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="牙科种植过程，暴露的骨窝，临床操作照片，手术细节。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图8. 暴露圆窗隐窝II。在20倍放大下观察，鼓室骨窦未封盖，暴露圆窗隐窝（箭头所示）及镫骨动脉（位于隐窝外侧1-2 mm的红色结构）。该隐窝常位于鼓室穹窿后部与耳囊相交形成的锐角下方。在施加耳毒性药物或进行引条引流前，必须充分暴露并清晰观察到整个隐窝。去盖过程中应避免过度去除骨质，因为当形成较大骨缺损时，间质液或血液容易涌入腔内造成术区淹没。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="ABR 阈值图；不同频率下随时间变化的听觉功能比较（POD1、POD7、POD14）。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 9"> 
图 9. 代表性结果——七碳醇诱导的听力损失与恢复。 平均听觉脑干反应（ABR）阈值（dB SPL）随纯音短声频率的变化曲线。测量数据按暴露前（黑色-对照）和术后第（POD）1、7、14 天（红色）分组。误差线表示标准误（SEM）。本图根据 Stevens 等人 2014 年的研究重新绘制。15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血管组织显微图像，细胞结构以红色和绿色突出显示，研究对比。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图10"> 
图10. 代表性结果——庚醇暴露后耳蜗靶向损伤 第一部分。 经庚醇处理耳与对照耳的血管纹（StV）中钾内向整流（Kir）通道4.1染色的变化。（A）对照耳典型的正常Kir 4.1染色，血管纹细胞对Kir 4.1具有强亲和性（绿色）。（B）术后第1天（POD1）处理耳。血管纹内可见大片空泡化区域，Kir 4.1亲和性降低（箭头），同时整体StV的Kir 4.1染色强度下降。细胞核用碘化丙啶复染（红色）（B）。比例尺 = 15 µm。该图改编自Stevens等，201415。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经组织荧光显微镜比较；对照组与POD 1组；绿色和红色细胞标记物。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig11.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图11"> 
图11. 代表性结果—庚醇暴露后耳蜗靶向损伤的第二部分。庚醇处理耳与对照耳相比，螺旋韧带（SL）发生的变化。（A）对照耳中SL内正常的Kir 4.1染色（绿色），表现为形态正常的II型螺旋韧带成纤维细胞（II）。（B）庚醇处理耳中，II型螺旋韧带成纤维细胞区域的Kir 4.1染色强度显著降低，细胞核结构紊乱，染色体凝聚/出泡，符合凋亡特征（箭头所示）。细胞核用碘化丙啶（红色）复染。比例尺 = 15 µm。本图改编自Stevens等，2014年15。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示耳蜗染色强度相对表达量随暴露后天数变化的图表；数据分析。" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig12.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 12"> 
图12. 代表性结果 — 庚醇暴露后耳蜗Kir 4.1染色强度的恢复。以暴露后天数为函数，绘制Kir 4.1染色的平均相对亮度。相对亮度定义为：经庚醇处理耳在共聚焦显微镜下测得的Kir 4.1反射强度，相对于对照耳的百分比。注意，POD14–28的数据被合并为曲线上单个数据点。实心圆点代表均值，误差线代表均值的标准误。在POD 7与后续时间点之间，相对亮度显著恢复（Student t检验 p &lt; 0.05，星号标记）。本图重绘自Stevens等，201415。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>

存在多种将耳毒性物质导入动物模型耳蜗的方法。本文介绍了一种通过圆窗龛递送耳毒性物质的手术方案。该方法具有良好的可靠性，可产生靶向的耳蜗内损伤，同时避免对微细结构造成机械性损伤。此外，可进一步用于研究耳蜗的自我修复与再生能力。

研究人员已采用多种动物模型和研究技术来研究哺乳动物的听觉系统。大量基础研究……

本实验的总体目标是通过将耳毒性物质精准递送至小鼠耳蜗的圆窗隐窝，建立内耳损伤模型。首先，解剖皮下脂肪层并轻柔地分离肌肉组织，以暴露鼓泡骨膜；第二步是通过逐步去除骨碎片打开鼓泡，直至暴露圆窗隐窝。接下来，彻底干燥中耳和圆窗隐窝的可见液体，以充分暴露圆窗隐窝。最后一步是在不损伤STA足动脉的前提下，将选定的耳毒性药物填充至圆窗隐窝，并根据药物说明书进行相应的重复操作。最终通过功能学检测（包括听觉脑干反应）和形态学评估，以显示耳蜗微结构的选择性保留或退变。该技术的主要优势，即我们现有的测量方法，在于该操作能够充分暴露错误的窗龛结构，并使药物易于到达耳蜗，从而可直接施加选择性耳毒性老化处理。该技术的优点包括：保留内耳微细结构、避免全身毒性、起效迅速、特定耳蜗细胞类型的可选择性退变，以及结果具有良好的可重复性。该技术可在不同啮齿类动物之间稍作调整后应用，包括大鼠、豚鼠和沙鼠。现在我将演示我在实验室中的操作流程。所有动物实验均按照相应机构动物护理与使用委员会的指南进行。本文所述的所有脊椎动物实验程序均已获得南卡罗来纳医科大学机构动物护理与使用委员会指南的批准。根据批准的操作程序对动物实施麻醉后，给予术前镇痛剂，剂量为每千克体重0.1毫克。此处使用的是丁丙诺啡。检查动物是否已达到外科麻醉水平。小鼠对脚趾夹捏应无反应，且此处所示的书写反射应消失。用1毫升结核菌素注射器吸取0.2毫升含有选定耳毒性试剂的水溶液，注射器需配备钝头的28号半英寸针头，排出注射器内的任何空气，因为气泡可能妨碍试剂的正确施用。使用电推剪去除毛发，去毛区域从耳前皱襞开始，向头部方向延伸至肩带部。从背部矢状中线向外侧延伸至下颌角进行脱毛。使用一次性剃刀以确保脱毛区域清洁整齐。根据机构规程对准备区域的皮肤进行消毒。此处以圆周运动方式局部外用碘伏与乙醇交替处理两分钟。在动物身下放置小型加热垫以维持其体温，保持在36至38摄氏度。随后通过头部固定装置固定动物头部。轻轻夹紧一个小型夹子于动物鼻背处以固定其位置。确认头部固定装置已牢固连接至U形铰接臂的中心。将一根宽1厘米的杆固定在U形臂的左侧，作为左侧头枕，以便暴露右侧操作区域。将小鼠牢固固定于头部固定装置后，将其旋转至左侧卧位。将身体小心放置于平坦的手术操作面，确保整个操作过程中体位稳定，并避免颈椎受到不必要的扭转应力。在手术区域上方放置一台可提供10倍和20倍放大倍数的手术显微镜。确认显微镜能够以无需用手扶持的方式保持其位置，以便在显微放大下操作时可同时使用双手进行手术。使用锐利的剪刀或手术刀片，在耳后褶皱前方约六至八毫米处，做一个长约一至1.5厘米的耳后切口。避免过深切割，以保护 underlying 的血管结构。钝性分离皮下脂肪层。若沿腹侧向内侧方向解剖，需注意避免损伤颈外静脉。若发生出血，可使用可吸收明胶海绵、海绵或棉球压迫止血。当脂肪层被正确分离后，暴露颈部肌肉组织。一个重要的解剖标志是第11对脑神经的一个小分支，该分支环绕颈乳突（C CTO mastoid）的后缘。为向耳廓方向延伸，使用自持式牵开器将CTO中耳炎相关肌肉本体轻柔地向后牵拉。轻柔地分离包裹肌体的透明筋膜。同时，将腮腺和颈外静脉轻柔地向对侧牵开。充分暴露CTO乳突肌肌体后，可在鼓泡的内侧窝处观察到鼓泡骨膜闪亮的穹顶，此处为一条深层颈肌的止点。胸锁乳突肌将进入视野。使用双手技术放置自持牵开器，将CTO乳突分开，轻柔使用双极电凝分离骨膜并暴露其下方的骨组织。然后使用镊子或耳科刮匙轻柔抬起并向周围方向推移骨膜，以充分暴露骨室顶部。现在使用带传动牙科手机钻头，配以1或2毫米锥形尖端，小心地在鼓泡骨上钻一个2毫米的引导孔。钻孔位置位于鼓泡穹窿的下缘与横跨鼓泡颅侧可见的不透明线之间。接着，在附近小心钻第二个引导孔，以利于使用尖头镊子去除鼓泡骨的骨盖。用尖头镊子朝背侧和下侧方向揭开鼓泡骨。注意避免刺穿位于骨岬正下方的耳蜗动脉。尽量减少去除的骨质，以防止在施用药物前有过多液体进入中耳。使用纸捻清除中耳及圆窗龛内所有可见液体，直至暴露出干燥的骨面。此步骤对方案的成功至关重要。在最大放大倍数下观察区域，使用连接1毫升结核菌素注射器的细针头，将一滴耳毒性试剂直接滴加至圆窗龛内，使其完全充满。让试剂在圆窗龛内停留10分钟。在早期阶段，需密切观察干燥小室底部微弱的光反射是否被暗淡且模糊的液体弯月面所取代。这表明小室正在正常充液。当10分钟完全过去后，彻底吸去原有试剂，并更换为相同试剂的新鲜应用。应用次数取决于所用试剂。暴露时间通常在30至60分钟之间。最后一次应用后，保持公牛去帽状态，并使用镊子将软组织覆盖于手术部位。使用4-0非吸收性单股缝线缝合手术部位的皮肤。将动物置于清洁的饲养笼中恢复麻醉，笼内应配备垫料和软质食物。在处死及收获成年C-B-A-C-A-J小鼠耳蜗组织前，每日对动物进行监测。两种性别的小鼠均暴露于耳毒性试剂庚醇（Hept ethanol），通过圆窗膜扩散给药。与接受假手术并给予生理盐水而非庚醇的对照组动物相比，庚醇处理小鼠在术后第1天至第14天均表现出ABR阈值显著升高。乙醇在任何测试频率下均未表现出显著的阈值偏移。针对内向整流钾通道的免疫染色（绿色显示）被用作可视化耳蜗结构损伤与恢复的间接方法。在 theria vais 中，染色强度明显降低。术后第1天，在红色核复染中可见核完整性破坏和染色体浓缩的迹象，这是细胞凋亡的典型特征。当对分层区域的钾通道染色强度进行量化时，经处理耳部显示出在七氟烷暴露后初期出现低谷，随后第7天染色强度显著恢复至接近对照水平，并在此后持续恢复。一旦掌握熟练，若操作得当，该操作可在30至60分钟内完成。需要牢记的是，额外的暴露或补充可能有助于避免因血液浓缩或组织间液导致耳毒性药物被意外稀释。然而，采用这种方法时应谨慎，因为它容易增加意外损伤耳蜗动脉或向圆窗隐窝引入组织间液的风险。这种微创技术可实现对精细生化过程的深入研究，在推进我们对耳蜗体内再生潜力相关研究方面具有重要意义。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

老鼠圆窗途径耳毒性剂递送：一个快速和可靠的技术诱导耳蜗细胞变性

来源：Kozin, E. D., 等．用于听觉通路光遗传学刺激的小鼠背侧耳蜗核直接可视化．J. Vis. Exp.

利用病毒介导的基因转移技术向小鼠背侧耳蜗核导入基因以实现光诱导听觉刺激

来源：Akil, O., et al., 通过圆窗膜进行病毒介导的基因递送至小鼠内耳的手术方法。J. Vis. Exp.

基于病毒载体的基因疗法在小鼠模型中恢复听力的研究

所述的耳后手术入路可实现快速、直接地将药物递送至小鼠耳蜗的鼓阶，同时最大限度减少出血量和动物死亡率。该方法可通过圆窗膜向新生后小鼠递送分子、药物及病毒，用于耳蜗治疗。...

通过圆窗膜进行病毒介导的基因递送至小鼠内耳的手术方法

本实验方案的目的是概述一种手术方法，以在小鼠模型中直接进入背侧耳蜗核。...

直接可视化小鼠背侧耳蜗核以实现听觉通路的光遗传学刺激

本文描述了两种用于向内耳局部给药的显微外科手术方法，并在听力参数、耳蜗细胞结构以及炎症标志物表达方面对二者进行了比较。...

靶向小鼠内耳给药方法的比较研究：鼓泡术 与 经鼓室注射

本实验方案旨在演示新生小鼠耳蜗组织块的制备、培养、处理及免疫染色。该技术可作为 体外...

新生小鼠耳蜗外植体技术作为一种 体外 听力研究中的筛查工具

我们介绍一种通过经鼓膜途径将药物局部递送至耳蜗的技术。通过该途径给药不会干扰顺铂等化疗药物的抗癌疗效。...

经鼓室药物递送治疗耳毒性

本文介绍了一种经半规管进行局部给药的耳蜗造口术（canalostomy），该方法可将药物递送至成年及新生小鼠的内耳，同时对听力和前庭功能造成的损伤最小。该技术可用于向小鼠内耳接种病毒载体、药物以及小分子化合物。...

耳道造口术作为向成年及新生小鼠内耳局部给药的一种外科手术方法

耳蜗植入物的动物模型有助于增进对利用电刺激治疗永久性感音神经性听力损失的技术基础的认识。本研究介绍了一种在小鼠中进行急性致聋和耳蜗植入电极阵列的手术方案，以及通过听觉脑干反应进行功能评估的方法。...

C57BL/6小鼠的耳蜗植入手术及电诱发听觉脑干反应记录

本文描述了一种用于评估正常小鼠带状突触形态特征和功能状态的实验方案。该模型同样适用于噪声诱导和年龄相关性耳蜗突触病变受限模型。文中还讨论了以往小鼠研究的相关结果。...

小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的形态学与功能评估

本文介绍了一种改良的耳蜗表面制备方法，该方法需要进行脱钙处理，并使用细胞与组织粘附剂将耳蜗上皮组织片段粘附于10...

成年小鼠耳蜗表面制备

了解通过圆窗途径向小鼠耳蜗递送耳毒性剂的外科技术，用于建立内耳损伤模型并研究耳蜗细胞变性。该方法可保留耳蜗微结构，适用于听觉神经科学和耳毒性研究。

小鼠圆窗给药法用于耳毒性药物递送：一种诱导耳蜗细胞退变的快速可靠技术

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