测量TCR-pMHC结合 原位 使用基于FRET的显微镜检测法

在本视频中，我们将展示如何测量T细胞抗原受体与肽段负载的主要组织相容性复合物（pMHC）在免疫突触内的结合动力学，该免疫突触位于T细胞与平面支持性脂双层之间。我们将简要介绍蛋白质制备的关键步骤，并通过钙流测定验证脂双层的功能完整性。有关脂双层制备以及单分子荧光显微镜搭建的更详细信息，请参阅我们在《视觉化实验杂志》（Journal of Visualized Experiments）中的并行研究论文。随后，我们将详细说明如何在整体细胞和单分子水平上进行荧光共振能量转移（FRET）测量，并对结果进行分析。

为了推导突触处T细胞受体（TCR）与肽段-MHC复合物（pMHC）结合的动力学，以解释我们在整体研究策略中所采用的基于FRET的检测方法，我们首先展示了T细胞受体（TCR）的晶体结构（图中以蓝色表示），及其与抗原——即负载肽段的MHC分子（pMHC，图中以黄色和红色表示）——的结合状态。我们还引入了一种来自T细胞受体β链反应性抗体age 57的单链可变区片段（scFv）。为了进行定量的FRET检测，必须以位点特异性的方式对FRET供体（在本实验中为该单链片段）和FRET受体（pMHC）分别进行标记。

通过引入一个未配对的半胱氨酸，可实现重组蛋白与荧光染料的共价结合，从而使其能够与荧光分子偶联。如图所示，我们将供体荧光染料 Alexa Fluor 555 或 Side Three 连接到单链片段上，将 FRET 受体 Alexa Fluor 647 或 SI Five 连接到 MHC 结合肽的 C 末端。

如该复合结构所示，Indy 距离约为 41 埃，甚至小于第一半径，即两种染料之间能量转移达到最大值一半时的距离。在我们的实验中，我们采用平面玻璃支撑的脂双层作为替代性抗原呈递细胞。这些脂双层经 PMXC 功能化修饰，含有配体分子 B seven one 和黏附分子 I chem one。

通过这种方式，可以在全内反射荧光模式下进行成像，该模式可激发靠近界面的荧光力，从而显著降低细胞背景信号。只有当单链片段标记的TCR与层内嵌入的PM HCS结合时，才能检测到FRET信号。这使我们能够可视化T细胞受体与PMHC的结合，并在正确折叠的二聚体组织相容性基因复合物中计算其结合动力学。

P seven one 和 I chem one 的胞外部分从感染相应 BUC 病毒的昆虫细胞培养上清液中纯化获得。纯化过程分为三步，首先进行镍亲和层析，随后进行离子交换和凝胶过滤层析。Histo 标签 MHC II 类异源二聚体在大肠杆菌中以包涵体形式表达，并在4摄氏度、存在占位肽的条件下，通过在氧化还原缓冲液中快速稀释进行体外复性。

空间占位肽随后将通过紫外光照射进行裂解。正确折叠的pMHC复合物经纯化并浓缩空间占位肽后，在pH 5.2条件下裂解并替换为荧光肽。

最终产物经过尺寸排阻层析纯化。该单链片段在大肠杆菌中以包涵体形式表达，含有一个未配对的半胱氨酸，通过逐步透析在体外复性，并进行尺寸排阻层析纯化。随后，通过其未配对的半胱氨酸与马来酰亚胺偶联的染料进行标记，并再次经过尺寸排阻层析纯化。

所有重组蛋白最终均经含50%甘油的磷酸盐缓冲液（PBS）透析，浓缩至每毫升含一毫克蛋白，并在-20摄氏度下开始长期保存。采用比例计量的URA2染料检测T细胞内钙离子水平，以验证脂质双层的刺激活性。用URA2-AM酯对T细胞母细胞进行负载。

该化合物通过其AM基团进入细胞，随后在酯酶的作用下被截留在细胞内，酯酶会切除AM部分。将fira 2:00 AM加入约300万T细胞中，终浓度为每升五微摩尔。将细胞从24孔板转移至新试管中，在室温下孵育30分钟。

用成像缓冲液洗涤细胞一次，该缓冲液含有含钙和镁的Hanks平衡盐溶液以及1%的白蛋白。为监测细胞内钙水平，使用可进行紫外激发的自动化倒置显微镜系统。启动定时程序，将少量已加载染料的T细胞加入置于显微镜载物台上并已调焦的功能化脂双层中，并以固定时间间隔采集相差DIC图像以及分别用340和380纳米紫外光激发的两幅荧光图像。

在形成双层接触后，T细胞立即出现钙离子水平升高，通过URA双波长比值在实验开始15分钟时检测得到。向细胞中加入阻断性抗体，使其饱和结合所有pMHC抗原。结果，细胞内钙离子水平下降至非活化状态的水平，后者可作为后续的参照基准。

一旦阻断抗体的存在水平降低至反映非活化状态的数值（我们将该值归一化为1，用于FRET测量），每次实验都需要用TCR反应性单链片段FRET探针对T细胞进行染色。将约100万个细胞转移至一个离心管中，在400 ×g条件下离心。弃去上清液，并用纸巾吸干残留在管壁上的液滴，以确保最小孵育体积约为30 µL，如我之前所述。

将FRET探针在-20摄氏度下以1毫克/毫升的浓度和50%甘油保存。使用Alexa Fluor 555对探针进行特定位点标记，标记蛋白的比例为1:0.3。取0.3微升探针加入细胞中，轻轻弹击管底数次，冰上孵育细胞20分钟。

用预冷的成像缓冲液洗涤细胞。重复此洗涤步骤一次。孵育、离心及低温保存可确保T细胞在暴露于荧光探针时不会将其内化。

这将导致背景荧光升高。此外，在将含有流动小室的载玻片置于显微镜载物台之前，T细胞在洗涤和储存的低温条件下不会丢失探针。需用成像缓冲液依次置换PBS，并不惜一切代价避免双分子层暴露于空气中，因为这会破坏双分子层。

为降低细胞背景信号，我们采用临界角照明。具体操作为：将激发光束调整至发生全内反射的临界角度。关闭激发光，打开宽场照明，将T细胞加入ltec腔室，使其沉降至脂双层表面。

打开激发光源并聚焦于非草坪照明。在草坪中，细胞膜在每个焦平面上沿光轴呈现为环状结构，仅可观察到与双层膜接触的基底膜。上方的焦平面不再被激发，因此不可见。

时间分辨实验方案首先使用红色和绿色激发脉冲对pMHC和TCR进行成像，随后施加红色漂白脉冲以消除P-M-H-C-F受体。在F受体漂白后，采用绿色脉冲对TCR进行成像，并通过红色脉冲验证F受体的消除效果。这些实验在亚秒时间尺度上进行，第一次与第二次绿色脉冲之间的延迟应尽可能短。可选地，可在实验开始时获取DIC图像，双色图像分光技术可实现供体和受体通道的同时检测。

供体激发显示T细胞突触中pMHC的聚集。该预漂白图像验证了pMHC的存在，并表明T细胞受体介导的pMHC结合已经发生。激发后，供体在两个通道中均产生图像。

由于能量转移到F受体通道，供体通道的信号在一定程度上强度降低。FRET受体通道的信号由供体通道的FRET渗漏以及FRET受体的交叉激发共同组成。无论如何，该图像将不用于分析。

在本实验方案中，快速漂白步骤可迅速消除所有被接受的荧光受体的荧光信号。经过适用于 FRET 的漂白处理后，供体荧光信号的强度得以恢复至较高水平，且不会向 FRET 通道发生强度损失。

以下FRET受体预期可验证F脂肪受体完全漂白。让我们放大突触以量化供体恢复情况。确定平均背景强度，该值在FRET受体存在与否的情况下保持恒定。

光漂白后，测定突触的平均强度以及代表性 TCR 簇的平均强度。然后通过归一化受体消融前后差异来计算 FRET 产率。在本示例中，我们测得整个突触的 FRET 为 16%，代表性区域的 FRET 为 26%。

TCR簇的FRET产率随后将被转换为TCR占有率，从而得到二维突触解离常数的单分子数据。这些数据可用于推导突触中TCR与肽-MHC单分子结合的动力学参数。我们采用与之前相同的试剂和标记策略。

然而，为了确保我们确实观察到单个 TCR 与单个肽段 MHC 之间的相互作用，我们选择满足以下标准：一个单分子 FRET 候选事件必须在通俗意义上与单个 FRET 受体或 FRET 供体分子相符。在此，我们采用单个 pMHC 作为 FRET 受体分子，以验证所观察到的 FRET 事件的单分子特性，但其逻辑相反。

使用高能级按钮中的供体和低能级按钮中的弗雷德供体与受体是一种可行的选择。我们通常采用514纳米和647纳米激发光照射与刺激性脂质双层接触的T细胞，依次重复激发供体和受体，激发间隔最短为1毫秒，随后为延迟时间，该时间可根据实验需求进行调整。

为了在激发后的数毫秒内获得足够强的荧光信号以实现单个芯片的检测，我们需要施加每平方厘米一至五千瓦的高激发功率密度。由于光漂白作用，可见的PMHC FRET受体分子数量迅速下降至一个水平，在此水平下，单个FRET受体荧光信号可在每平方微米含有30个或更多标记PMHC的双分子层中被区分出来。此处展示了一个总时间延迟为42毫秒的示例。

用红色圆圈标记的单个FRET事件在第二和第三时间点变得可见。它与用绿色圆圈标记的单个S5分子共定位。在此示例中，可观测到的FRET事件的轨迹长度为2，收集更多单分子FRET轨迹，如表中所示，共128条轨迹。

接下来，计算轨迹的互补累积和（如绿色数字所示），并对其进行归一化处理，得到归一化值曲线，并用单指数函数进行拟合。期望值略大于 1.5 个时间帧。该值取决于 TCR 肽、MHC 结合以及光漂白特性；为了能够区分这两方面的贡献，必须至少在三个不同的时间点计算期望值。

现在将所有期望值相对于相应的时间滞后进行绘图，并将数据点拟合到包含此处寿命的显示函数。该寿命为 2.12 秒，以及光漂白的期望值 f Fred。如图所示及先前更详细的描述，供体在 F Fred 可接受的漂白后恢复，可用于在几步之内确定在免疫突触内有效的二维解离常数。

在此，我们将分析重点放在 TCR 结合及 TCR 簇上，此处 T-C-R-P-M-H-C 结合最为显著。从所示的 F FRED 产量测量结果中可以明显看出，不同个体 TCR 簇间的产量存在显著差异。

将 F 值乘以比例因子 C 可得到 TCR 占有率，该参数描述了结合 pMHC 的 TCR 数量与其总数之间的比例。C 值需针对特定的 FRE 配对组合及所使用的 FRE 系统测定一次。在本演示文稿的最后部分，我们将更详细地说明如何测定 C 值，例如，该过程涉及将 SI3 和 SI5 特异性地置于 TCR 特异性的单链抗体片段以及 MHC 结合肽的 C 末端。由此可获得约两个突触的二维解离常数，该常数可根据 TCR 占有率（记为 A）和脂质双层上 pMHC 的初始密度计算得出。

所示关系源自质量作用定律，并在与本视频配套的文章中进行了更详细的解释。在我们的示例中，pmcs 的初始密度为每平方微米 30 个分子。我们得到一组在 T 细胞突触中有效的二维 kd 分布，其中位值约为每平方微米 34 个分子。

结合速率分布可通过突触二维KD分布和此处相应的解离速率（0.41每秒）计算得出，该解离速率是通过在24摄氏度下对单分子FRET轨迹进行分析确定的。中位值约为每分子每秒0.01平方微米。总之，TCR与肽-MHC之间的FRET测量能够对描述C2中反应动力学的所有动力学参数进行综合分析。

原则上，该方法可推广应用于其他受体-配体相互作用的分析，因为这些相互作用可能在细胞间识别中起关键作用。最后但同样重要的是，我们讨论如何通过实验确定常数 C，该常数用于将脂肪产量转换为 TCR 占有率。此步骤仅需执行一次。

所确定的常数 C 随后可用于所有后续实验，前提是使用相同的 FRET 系统及相同的荧光染料组合。在本实验流程中，我们本质上是通过受体光漂白后供体的恢复情况，将单个 TCR 簇中测得的 FRET 效率与在敏化 FRET 通道中检测到的相应强度值关联起来。如前所述，FRET 效率是根据 FRET 受体消融前后经背景校正的 FRET 供体通道图像确定的。

敏化FRET通道需要与F供体通道以及X轴和Y轴对齐，并校正背景信号。此处展示了弗雷德供体渗漏和弗雷德受体交叉激发现象。文章中提供了如何校正弗雷德供体渗漏和弗雷德受体交叉激发的详细说明。

在观看本视频的同时，针对每个 TCR 簇，计算经校正的 FRET 图像中目标信号与相应经校正的 FRET 供体图像的比值。确定单个 FRET 供体的校正平均信号以及单分子 FRET 事件的信号，并计算该比值。TCR 占有率则通过将上述两个比值相乘得出。

现在，将针对各个 TCR 聚集体测得的 fret 产率对其 TCR 占有率作图。然后通过线性回归确定 C，如本例所示。在我们的示例中，C 值约为 2。

观看本视频后，您应能够利用蛋白质功能化的脂双层结合单分子荧光显微镜技术，测量pMHC与TCR之间的突触结合动力学。本文讨论了所有必要步骤，包括蛋白质制备、T细胞标记以及最终的FRET测量。此外，还详细展示了图像分析过程，从而获得T细胞活化曲线和FRET值。

最后，展示了测定动力学结合与解离速率所依据的方法。原则上，类似的方法也可用于测定其他突触受体与配体的相互作用，但可能需要进行适当的修改。