通过16S rRNA基因测序与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定罕见细菌病原体
2016年7月11日
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）与分子技术（16S rRNA 基因测序）可实现对常规诊断中罕见细菌病原体的鉴定。本方案的目标在于结合这两种技术，从而获得更准确、更可靠的数据。
本基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）实验方案的总体目标是通过一种快速且经济有效的方法，提高对罕见病原体的分型能力。该方法有助于解答诊断微生物学领域中的关键问题，能够实现对罕见细菌病原体的快速鉴定。今天，我们将讨论Odoratimimus以及Myroides属细菌。
为了演示该方法并讨论结果的解读。通常，初次接触此方法的人员可能会感到困难，因为细菌的转移、与基质的覆层以及结果的解读均需要一定的技术技能和微生物学专业知识。我们最初萌生使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）筛查罕见细菌的想法，是在我们医院收治了一名由产味微杆菌（Myroides odoratimus）引起糖尿病足感染的患者时。
按照文本方案所述，首先进行细菌DNA提取、16S核糖体DNA PCR扩增及Sanger测序。使用无菌牙签将单个细菌菌落转移至96孔钢靶的一个孔中。在钢靶上已风干的菌体上加1微升70%甲酸，静置干燥约2至3分钟。
在斑点上覆盖1 µL基质溶液，该溶液含有50 mg/mL的CHCA，溶剂组成为50%乙腈、2.5%三氟乙酸和47.5%水。将涂布样本与覆盖的基质在通风橱中静置约五分钟，使其自然风干。将样品引入质谱仪时，通过按下仪器的进/出按钮，对样品加载口进行通气。
打开加载口，插入带有干燥细菌涂片及基质的MALDI-TOF质谱靶板。关闭加载口并再次抽真空。观察真空度，当达到4.5百万毫巴时，开始检测。
打开 MMIS 分析软件，点击文件菜单。选择“新建分类”，此时应弹出一个名为“MALDI Biotyper 实时分类向导”的新窗口。在“项目名称”字段中输入项目名称，然后点击“新建”。在名为“新建项目”的新对话框中，核对项目名称，然后点击“确定”按钮继续。
在 MALDI Biotyper 实时分类向导中，观察分析物放置窗口。选择目标位置，右键单击任意选定的位置，然后选择添加样品。在自动打开的表格视图中，输入样品名称、样品编号，以及可选的备注信息。
单击“下一步”按钮继续。接下来，观察 MALDI Biotyper 方法选择窗口。从分类树的 MSP 中选择“Bruker Taxonomy”，然后单击“下一步”继续。
然后，观察项目摘要窗口。核对上述已输入的实际分类项目中的各项内容。单击“Finish”按钮以启动分类运行。
当达到适当的真空度时，测量将自动开始。继续执行分类运行，直至测量成功完成。测量完成后，打开“View”菜单并单击“Results”，以查看 MALDI Biotyper 实时分类项目一中的结果表格。
在默认的网络浏览器中以 HTML 文件格式查看布鲁克-达利托尼克 MALDI 生物鉴定仪（Bruker-Daltonik MALDI Biotyper）的分类结果。打印并保存结果。图中显示的是通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）实时测量并分类的质谱图。
每条谱图均被赋予一个物种名称和一个反映测量质量的评分值。评分高于2.300表示物种鉴定高度可信；评分在2.000至2.300之间表示物种鉴定可靠。
得分低于1.700和2.000表示可能的物种鉴定，而低于1.700的得分为不可靠结果。在固体培养基上纯培养的细菌病原体的鉴定需要两到三分钟。
需要牢记的是，只有当仪器可靠地包含相应质谱时，才能通过MALDI-TOF MS检测到罕见的细菌病原体。否则，必须通过整合来自已鉴定分离株的标准菌株的MaSDA质谱数据来进行补充。当评分结果无法明确鉴定菌株时，可采用其他进一步的方法，如生化特征分析或16S rDNA测序。
尽管该方法可用于细菌检测，但也适用于其他微生物，如真菌或厌氧菌。此外，还可用于测定细菌耐药性。在操作具有危害性的基质时，务必佩戴手套、防护眼镜，并在通风橱内操作。
此外，必须将基质彻底干燥并充分涂布，以避免在分析室中发生溅出。
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概述
本方案概述了使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）来提高对罕见细菌病原体鉴定能力的方法。通过将该技术与分子生物学技术相结合，研究人员可在微生物学领域实现更准确的诊断。
关键研究要素
科学领域
- 微生物学
- 诊断技术
- 病原体鉴定
背景
- MALDI-TOF MS 是病原体分型的有力工具。
- 罕见细菌病原体在常规诊断中带来挑战。
- 了解传统方法的局限性至关重要。
- 有效实施需要具备相应的技术技能。
研究目的
- 提高对罕见病原体的分型能力。
- 提供一种快速且具有成本效益的诊断方法。
- 通过特定的细菌实例展示该方法的应用。
使用的方法
- 用于病原体筛查的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。
- 用于分子鉴定的16S rRNA基因测序。
- 细菌转种与涂布的技术操作步骤。
- 质谱分析结果的判读。
主要结果
- 成功鉴定出芳香黄杆菌（Myroides odoratimimus）。
- 展示了对罕见病原体进行快速诊断的能力。
- 强调了技术专长的重要性。
- 提供了该方法在临床环境中适用性的见解。
结论
- 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）结合分子生物学技术可提升诊断能力。
- 有效应用该方法需经过系统培训。
- 未来应用可能进一步拓展病原体鉴定的范围。
常见问题
行业重要性概述
准确鉴定罕见细菌病原体对于生物制药研发中的诊断微生物学至关重要，特别是针对免疫功能低下患者群体。将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）与16S rRNA测序相结合，可实现快速、经济的物种水平鉴定，有助于在抗菌靶点验证中进行机制性风险排除。该联合方法通过减少病原体检测中的假阴性结果，提高了临床前模型的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过确认感染模型中罕见病原体的身份，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：提供符合命名规范的可靠菌株鉴定，是可重复的目标去风险化所必需的。
- 预测价值：通过在与疾病相关的系统中准确表征病原体，支持项目组合的优先筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成可量化的评分输出（例如，>2.300 表示极有可能的鉴定结果），可在抗菌筛选中实现标准化的阳性结果确认。
- 操作价值：通过快速（<3 分钟）的纯培养物鉴定促进检测准备，提高筛选通量和可扩展性。
- 可重复性价值：通过标准化的谱图匹配和经过验证的数据库依赖，确保不同实验室之间的结果可比性。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过在具有临床相关性的感染模型中验证罕见病原体，将发现研究与临床前研究的连续性联系起来。
- 操作价值：当评分阈值（2.000–2.300）确认物种鉴定可靠时，可支持基于风险评估的推进决策。
- 转化连续性：在免疫功能低下模型中，当病原体的存在与宿主反应相关时，有助于生物标志物的匹配。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到临床前评估的发现研究连续过程，在此过程中，准确的病原体鉴定可为机制研究和先导化合物评价提供依据。
- 发现生物学：通过在感染模型中确认罕见细菌病原体，支持假设验证，减少机制上的不确定性。
- 筛选：提供即用型、经过验证的生物系统，并输出定量结果，用于可靠地评估化合物。
- 分析：提供基于评分的读数（例如，MALDI Biotyper 分类），实现不同条件间的客观比较和阳性结果验证。
- 转化研究：在与疾病相关的系统中进行病原体验证，从而与临床前研究形成衔接，但仅在有源材料支持时适用。
- 企业级复用：可在多个罕见病原体项目中作为可重复使用的诊断能力，减少重复验证工作。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，减少病原体错误指认，并降低机制层面的风险。
- 操作价值：实现跨实验室病原体鉴定的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过快速诊断提升抗菌项目中“推进/终止”决策的质量，提高资本使用效率，并降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：在临床前模型中基于确认的病原体身份，对抗菌候选物进行基于风险的优先级排序。
实施注意事项
- 细菌转移、基质覆盖及结果判读需要微生物学专业知识。
- 依赖配备更新的分类学数据库（如 Bruker Taxonomy）的 MALDI-TOF 质谱仪，以实现准确的谱图匹配。
- 需要标准化的样品制备流程，以确保基质干燥且涂布均匀，防止分析仪污染。
- 当 MALDI-TOF 鉴定得分低于 1.700 时，需回退至 16S rRNA 测序或生化分型进行鉴定。
- 操作过程中涉及危险基质溶液（如甲酸、乙腈）的处理，须在通风橱内佩戴个人防护装备，并遵守安全操作规程。
