Name: 无标记单分子检测使用微型环光学谐振器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解使用微型环光学谐振器进行无标记单分子检测的方法。该技术通过频率锁定实现超高灵敏度检测，无需标记即可分析蛋白质折叠与结合动力学，为生化研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究部分得到了美国国家普通医学科学研究所国家研究服务奖（T32GM07616）的资助。

1. 实验设置与样品制备
<ol>
	<li>采用先前所述的光刻、刻蚀和熔融工艺制备微环谐振器6在硅晶圆（芯片）上制备微环形谐振器，其典型主直径为80–100 µm，次直径为2 µm。</li>
	<li>从光纤盘上解开约一米长的单模光纤（包层直径125 µm，模场直径4.3 µm）。</li>
	<li>在光纤未缠绕部分的中间位置，使用剥线钳剥离光纤周围的一小段（2.5 cm）聚合物涂层。注意：此部分光纤将用于通过渐逝场耦合将光导入微环谐振器。</li>
	<li>使用异丙醇和无绒布清洁已剥除涂覆层的光纤。</li>
	<li>使用磁性夹具制成的光纤夹具固定这段光纤。</li>
	<li>使用氢气喷灯和两个以60 µm/min速度反向移动的步进电机，通过熔融和拉伸将剥离后的光纤变细至约500 nm。将光纤置于火焰上部，火焰高度应约为10 mm。当光纤的透射光不再发生波动时，停止拉伸操作；透射光的变化可通过肉眼观察（观察光纤侧向散射光的闪烁）或通过将光纤连接至连接示波器的光电二极管进行监测。</li>
	<li>将光纤一端切断，并插入裸纤适配器中。将该端光纤放入光电探测器的输入端口。</li>
	<li>将光纤卷的另一端通过光纤耦合器与激光器连接。</li>
	<li>将微环芯片使用环氧树脂或双面胶带固定在样品台（不锈钢，37.8 mm × 6.4 mm × 3.2 mm）上。</li>
	<li>将样品台安装在定位平台上方，该平台由一个三维微米调节装置（三维微调架）支撑的三维纳米定位（纳米立方体）平台组成（参见设备清单）。所有实验均需在气浮隔振光学平台上进行，以最大限度减少振动。</li>
	<li>使用三轴千分尺粗略定位样品芯片。</li>
	<li>使用纳米定位器将含有微环谐振腔的芯片与光纤对齐。注意：需将微环谐振腔调整至与入射光波长距离范围内（约633 nm）。为便于观察此过程，可在芯片上方和侧方各放置一个成像柱（含物镜和相机的镜管，参见设备清单）。</li>
	<li>使用光纤在线偏振控制器（见设备清单）调节通过光纤的激光偏振态，该控制器带有可调节偏振的旋钮。注意：当测得的光纤透射率下降峰最窄时，即达到最佳偏振状态。在示波器上观察该下降峰（详见步骤2.2）。</li>
	<li>使用玻璃载片作为间隔物，用环氧树脂将盖玻片固定在样品台上，构建样品室。注意：可用聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas） enclosure 覆盖整个装置，以减少空气流动；应留出一个小开口，以便通过管路泵入溶液。</li>
	<li>将颗粒悬浮液或单分子水溶液在室温水浴（约500 ml）中热平衡至少1小时。注意：使用制造商指定的相应缓冲液在微量离心管中将样品稀释至所需浓度。 例如，PBS 或 HEPES。若未检测到结合事件，可提高缓冲液的盐浓度。</li>
	<li>涡旋含有颗粒的溶液（1 ml）约 2 秒。</li>
	<li>使用1 ml注射泵，以1 ml/min的流速将含有颗粒的溶液注入样品室。</li>
	<li>样品室充满后，关闭注射泵。</li>
	<li>等待30秒后再记录数据，以尽量减少流体流动引起的机械振动对测量结果的影响。</li>
</ol>
2. 频率锁定
<ol>
	<li>由于注入液体会导致耦合状态受到干扰，因此通过使用纳米定位器移动样品架，将环形谐振器重新耦合至光纤。</li>
	<li>通过计算机控制输入激光器扫描多种波长，定位微环谐振器的共振波长。该步骤通过向激光控制器内的压电元件发送三角波电压信号来调节激光波长。实验采用可见光（635 nm ± 2.5 nm），因为在此波长下水对光的吸收较低。</li>
	<li>将光纤输出端接入自动平衡光电接收器，测量光纤中的光传输。使用BNC电缆将光电接收器的输出端连接至示波器。在示波器上可观察到，当处于微环谐振器的共振波长时，光纤中的光传输量下降。</li>
	<li>通过电缆将光电接收器的输出端连接至频率锁定反馈控制器的主输入端（参见设备列表）。</li>
	<li>在软件界面中以Ziegler-Nichols整定规则14经验性设置比例-积分-微分（PID）参数，并以2 kHz的调制频率和19 fm的波长振荡幅度，运行频率锁定反馈控制器的自动锁定模式。注意：这些参数只需在所有实验开始前设置一次。</li>
	<li>在样品腔填充完成后，将激光波长自动锁定至微环谐振器的共振波长。注意：若波长偏移过大，反馈控制器将失去锁定，并自动切换至扫描模式以重新定位共振波长。此情况通常发生在波长偏移超过约一个线宽时（本研究所涉及的所有系统中至少为600 fm）。</li>
	<li>使用24位数据采集卡以20 kHz的采样频率记录反馈控制器的输出信号，并通过数据采集软件将数据导出为文本文件。</li>
</ol>
3. 数据处理 &amp;#38; 分析
<ol>
	<li>在 MATLAB 中对数据进行傅里叶变换。</li>
	<li>使用低通滤波器对数据进行处理 &#34;砖墙&#34; 使用截止频率为1 kHz的滤波器，以去除施加的2 kHz抖动频率（参见补充代码文件截图1）。</li>
	<li>使用16 Hz的窗口大小对数据进行计算式陷波滤波。注意：此步骤旨在去除已知的噪声源，本例中包括60 Hz的电源线噪声及其谐波，以及来自激光驱动器的100 Hz噪声及其谐波（参见补充代码文件截图1）。</li>
	<li>将数据进行逆傅里叶变换，还原至时域。</li>
	<li>使用1,001个样本的窗口大小对数据进行中值滤波（参见补充代码文件截图2）。</li>
	<li>使用 Kerssemakers 的步进检测算法定位共振波长的阶跃变化 等15.</li>
	<li>生成每个结合步骤振幅的直方图。</li>
	<li>使用公式 (1) 计算粒径（见讨论部分）。</li>
</ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
<li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnight%2C+A+%22Single+molecule+biology%22">Single molecule biology</a>. , Elsevier/Academic. (2009).</li>
<li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li>
<li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li>
<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
<li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li>
<li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li>
<li>Åström, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%85str%C3%B6m%2C+KJ+%22Feedback+systems+%3A+an+introduction+for+scientists+and+engineers%22">Feedback systems : an introduction for scientists and engineers</a>. , Princeton University Press. (2008).</li>
<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
<li>Su, T. -T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Label-free+detection+of+single+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%22">Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators</a>. , California Institute of Technology. (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

当颗粒结合时，环形谐振腔的共振波长（λ）增加；若颗粒解离，则共振波长相应减小（即发生下降台阶事件）。通过统计每个波长台阶幅度的直方图，可确定颗粒直径（d）。每个波长台阶的高度变化源于结合颗粒的尺寸差异以及颗粒在微环上的结合位置。当颗粒结合在微环赤道处——此处电场（E0,max）最强——共振波长的变化达到最大值（即最大台阶高度）。该最大波长变化量（Δλ）与颗粒直径的关系由公式（1）8给出，其中a为颗粒半径，D为基于结合颗粒及其周围介质折射率的介电常数，Vm为通过有限元模拟确定的微环内光场的模式体积2，E0(rs)为同样通过有限元模拟确定的颗粒赤道处的电场振幅：
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="al...

单分子检测实验有助于减少生物传感器中分析物的使用量、实现疾病的早期检测以及研究分子的基本特性3。此类实验通常依赖标记物进行，然而，标记物并不总是能够针对特定蛋白质获得，且会增加成本，可能干扰所研究的生物事件，同时在实时现场实验或即时诊断中使用时可能带来不便。
目前无标记生物传感的金标准是表面等离子体共振4，然而商用的表面等离子体共振系统的检测下限通常在纳摩尔（nM）量级。近年来，光学谐振器作为一种有前景的技术，已被用于无标记单分子生物检测5。光学谐振器的工作原理基于光的长期（纳秒级）限域效应6,7。光通常通过光纤以渐逝场耦合方式进入这些器件。当光纤中传输的光波长与谐振器的共振波长匹配时，光便能高效地耦合进入谐振器。耦合后的光在谐振腔内发生全内反射，进而在谐振器周缘附近产生渐逝场。当粒子进入该渐逝场并与谐振器结合时，谐振器的共振波长会发生改变，其变化量与粒子的体积成正比8。
在检测能力方面，微球谐振器此前已被用于检测单个甲型流感病毒颗粒（100 nm）9,10。最近，等离子体增强型微球光学谐振器已被用于检测单个牛血清白蛋白分子11和8聚寡核苷酸12，但该方法将每个器件的颗粒捕获面积限制在0.3 µm2。较大的捕获面积生物传感器更有利于最大化颗粒检测的概率。目前，具有大（&#62; 100 µm2）捕获面积的基于溶液的无标记生物传感技术仅限于检测直径≥ 25 nm的聚苯乙烯颗粒。
我们开发了一种基于光学谐振器技术的无标记生物传感系统，该技术称为频率锁定光学 whispering gallery 模式回音壁谐振器（Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator, FLOWER）13（图1），能够实现溶液中单分子的时间分辨检测。FLOWER 利用微环形光学谐振器的长光子寿命，结合频率锁定反馈控制、平衡检测和计算滤波技术，实现对微小粒子的检测，灵敏度可达单个蛋白质分子。频率锁定技术的使用使系统能够在粒子结合时持续追踪微环谐振频率的偏移，而无需对激光波长进行大范围扫描或调谐。FLOWER 的原理可用于增强其他检测技术的性能，包括等离子体增强技术。下文将描述实施 FLOWER 的具体操作步骤。

<table><tbody><tr><td>可调谐二极管激光器</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>激光控制器</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>频率锁定反馈控制器</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>自动平衡光电接收器</td><td>Newport</td><td>Model 2007</td><td></td></tr><tr><td>在线偏振控制器</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>24位数据采集卡</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>重组人白细胞介素-2</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>20 nm 聚苯乙烯微球</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ 压电平台</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>光学平台</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>成像柱物镜</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>成像柱（适配管）</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>成像柱用高分辨率CCD相机</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

基于微环形光学谐振器的无标记单分子检测

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

检测低浓度分子直至单分子水平，对疾病早期诊断以及分子行为的基础研究等领域具有重要意义。单分子检测技术通常依赖荧光标记物或量子点等标记物，然而标记物并非总是可用，且会增加成本和实验复杂性，并可能干扰所研究的生物事件。光学谐振器作为一种有前景的技术，能够在无需标记的情况下实现单分子检测。目前，非等离激元增强的裸光学谐振器系统在溶液中检测到的最小粒子为25 nm的聚苯乙烯小球1。我们开发了一种名为频率锁定光学回音壁模倏逝波谐振器（FLOWER）的技术，能够突破这一限制，实现在水溶液中的无标记单分子检测2。由于信号强度与粒子体积成正比，本工作在信噪比（SNR）方面相较当前技术水平提升了&#62; 100倍。本文旨在介绍FLOWER技术背后的实验流程，以促进其在相关领域的广泛应用。

微环谐振波长随时间发生的阶梯状变化清晰地反映了颗粒结合事件（图 2A）。这些阶梯的高度以直方图形式展示于图 2B中。图 2-4 分别展示了外泌体（纳米囊泡）、5 nm 二氧化硅微球以及单个人类白细胞介素-2 分子结合过程的代表性信号轨迹。阶梯状信号的变化幅度随颗粒尺寸变化而变化，这一事实表明该技术操作正确。可通过生成阶梯高度的直方图（图 2B），并将观测到的最大阶梯高度与理论预测值进行比较来分析该结果，如下文所述。
<img alt="激光反馈系统示意图，显示 PID、分束器、微环、光电接收器的设置。" src="/files/ftp_upload/53180/53180fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 环形谐振器传感系统...

我们开发了一种基于光学谐振器技术的无标记生物传感系统，该技术称为频率锁定光学回音壁模式倏逝波谐振器（FLOWER），能够检测溶液中的单个分子。本文将介绍并展示该工作的相关实验步骤。

检测低至单分子水平的微量分子浓度，在疾病早期诊断和基础研究等领域具有重要意义。

本实验的总体目标是利用基于光学谐振腔技术和频率锁定的技术，在无需标记的情况下检测单个分子和超小纳米颗粒。该方法有助于解答生物化学领域中的一些关键问题，例如蛋白质折叠和结合动力学。该技术的主要优势在于，无需对目标分子进行标记即可实现其检测。该技术的设置包括将微 OID 芯片与光纤耦合。首先，获取一个微 OID 芯片。这是一种尺寸约为 6.5 毫米 × 5.5 毫米的硅芯片，其上制备有微 OID。如图所示，微米级OID的主直径为80至100微米，次直径为2微米。暂时将芯片放置一旁，准备光纤以实现与芯片的耦合。使用一卷单模光纤，展开约一米长的光纤。取一把剥线钳，大致位于光纤的未缠绕部分中间位置。用其剥离光纤上一段 2.5 厘米长的聚合物涂层。该去除了涂层的区域即为光纤的耦合区域。剥除光纤涂覆层后，使用无尘布和异丙醇酒精清洁已剥除的区域。接着，使用带磁性夹具的光纤夹具固定清洁后的部分。下一步，将步进电机布置为向相反方向拉伸光纤。 调整光纤夹具的位置，以便在剥离区域两侧将步进电机连接到光纤上。此外，在光纤一端连接激光器，作为光源。启动步进电机，使其向相反方向移动以拉伸光纤，并使用氢氧火炬熔化光纤的剥离部分。持续监测光纤侧向散射的光。若出现闪烁现象，表明光在光纤中的传输不稳定，需进一步拉细。当闪烁停止时，停止加热和拉伸光纤，此时光纤直径已减小至约500纳米。纤维拉细后，断开光源，并将纤维及其磁性夹具支架从牢固的电机上取下。接着，将纤维转移至配备有定位平台的气浮隔振台上。将纤维连同其磁性夹具支架放置在样品芯片前方的支撑块上。定位平台是一个位于三轴千分尺之上的三轴纳米定位平台。除了纳米定位平台外，还配有顶视和侧视成像柱，以辅助对准。继续操作光纤，确保其已剥除涂覆层的部分靠近定位平台。准备将光纤的自由端引入测量系统。在切割自由端后，将其插入裸光纤适配器中。使用该适配器将光纤连接到连接至示波器的自动平衡光电接收器的输入端口。现在将注意力集中到光纤的另一端。首先，将此端连接至一个光学耦合器。然后将光纤与在线偏振器的输出端耦合，该偏振器的输入来自一个50:50的分束器和一个可调谐二极管激光器。以下是截至目前所连接部分的示意图。请注意，分束器的第二路输出需通过一个串联式偏振器，并用作自平衡光电接收器的参考信号。下一步是准备使用不锈钢样品支架安装微型 OID 芯片。使用双面胶带将芯片固定在样品 holder 上。然后将微芯片放置在样品 holder 的顶部。现在将带有芯片的样品 holder 安装到纳米定位平台的顶部。此处，支架和芯片已放置在配备三个微米尺的定位平台上。粗略定位芯片相对于光纤的位置。此图为完成粗定位后的芯片与光纤位置。接下来，进一步调整定位器，并使用成像柱将芯片与光纤对齐。使用波长与光纤激光波长相同的微OID时，该图像显示的是光纤与微环。在完成精细定位步骤后，视野中心附近的圆形贴纸可作为定位辅助。现在继续搜索微环的共振波长。生成一个三角波形电压信号，以调节激光波长在约635纳米±2.5纳米范围内。随后扫描波长以寻找共振峰。在示波器上观察光纤中的透射信号。请注意，在共振波长处，透射率会下降。此时需调节激光光源的偏振态。调节光纤中的串联偏振控制器，以优化光纤内激光光的偏振状态。使用示波器观察光电接收器的输出，并调节偏振，直至测得的透射凹陷最窄。优化偏振后，在样品台上构建样品腔室。该腔室由一片盖玻片通过环氧树脂粘合到显微镜载玻片上构成。载玻片起到间隔作用，使盖玻片能够悬伸出芯片和光纤。设置一个1 mL的注射泵及管路，以每分钟1 mL的流速将实验样品注入腔室中。接下来，取1 mL已平衡至室温的样品用于注入泵中。本例中，该样品为含有5 nm二氧化硅微球的溶液。样品注入后，观察样品室，当样品室充满时停止进样。本样品室已充满含有5 nm二氧化硅微球的溶液，样品注入过程已停止。等待30秒以减小振动影响后，搜索微谐振器的共振波长。再次使用示波器观察共振时光纤中的吸收谷值和透射信号。这是当前实验装置的示意图，包括比例-积分-微分（PID）控制器。积分器与抖动。将控制器以自动锁定模式运行，并在峰值顶端进行锁定。将抖动频率设置为两千赫兹，将波长振荡幅度设置为19飞米。通过实验确定 PID 参数后，自动将激光波长锁定至微腔的共振波长。通过记录反馈控制器的输出来收集数据。以下是采用三种不同尺寸结合颗粒（按尺寸顺序）的实验方案所获得的共振偏移（单位：飞米）随时间（单位：秒）变化的代表性曲线。这些颗粒为外泌体或纳米囊泡、5纳米二氧化硅珠以及人白细胞介素-2分子。请注意每组数据中垂直和水平坐标轴的不同尺度。观察到不同粒径的粒子在数据中呈现不同的信号尺度，表明该技术操作正确。当粒子结合到微环谐振腔（OID）时，OID 的共振波长增加，导致信号曲线上升一个台阶；当粒子解离时，共振波长减小，导致信号曲线下降一个台阶。每个波长步长的高度由颗粒的大小及其在微球体上的位置决定。时间尺度则由颗粒的OID动力学决定。一旦掌握，若操作正确，该技术可在约三小时内完成。在进行此操作时，重要的是要始终注意保持所有物品尽可能清洁、无尘。

label-free-single-molecule-detection-using-microtoroid-optical

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

无标记单分子检测使用微型环光学谐振器

生物传感器通过表面修饰将高灵敏度传感器与高特异性探针结合，从而与复杂的生物环境相互作用并实现靶向检测。在此，我们演示了使用硅烷偶联剂作为桥梁，通过生物素对二氧化硅光学传感器进行表面功能化修饰的方法。...

使用硅烷偶联剂将生物探针连接到二氧化硅光学生物传感器上

我们介绍了使用二氧化碳激光回流技术制备二氧化硅谐振腔的方法，包括自支撑微球和片上微环腔。该回流工艺可消除表面缺陷，从而在两种器件中实现较长的光子寿命。所制得的器件具有极高的品质因数，可应用于从光通信到生物检测等多个领域。...

二氧化硅超高品质因子微谐振器的制备

本视频展示了利用局域表面等离子体共振成像技术检测单个细胞分泌的蛋白质。通过微流控装置和带有肽段的等离子体纳米结构芯片，在共振角度下反射光强度的变化可反映出与单个细胞分泌蛋白之间的相互作用。...

基于局域表面等离子体共振成像的单细胞蛋白分泌检测

荧光核心微腔传感器在石英微毛细管的通道内采用高折射率量子点涂层。泵入毛细管通道的流体折射率发生变化时，会引起微腔荧光光谱的偏移，该偏移可用于分析通道内的介质。...

荧光核微腔的合成与操作用于折射率传感

一种参考干涉仪技术被用于探测超高品质因子微腔，该技术旨在消除纳米探测中的不良激光抖动噪声。本文提供了装置的组装、调试和数据采集说明，以及用于确定腔体品质因子的测量过程。...

用于纳米检测的参考干涉仪实现

最近，通过光辐射压力和受激布里渊散射，已在微流控光力学谐振器中实验验证了参量型光力学激发。本文描述了这些微流控谐振器的制备方法，以及产生和验证光力学振荡的技术方案。...

微流控光机械振荡器的制备与测试

传统光学操控技术的可扩展性和分辨率受衍射效应限制。我们克服了衍射极限，描述了一种利用在金膜表面制备的、由紧密排列的C形等离激元谐振器构成的路径，在芯片上实现纳米颗粒光学传输的方法。...

纳米光学传送带的制备与操作

在液滴微流控中，多色荧光检测通常需要使用体积庞大且结构复杂的基于倒置荧光显微镜的检测系统。本文介绍一种紧凑且模块化的多色检测方案，该方案利用光纤阵列通过单个光电探测器对采集的多色数据进行时间编码。...

使用光纤实现液滴微流控的多色荧光检测

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。...

使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

本文追踪了氮化硅薄膜谐振器的生命周期，从设计、制备到表征的全过程。...

高Q值氮化硅薄膜谐振器的制备与表征

了解使用微型环光学谐振器进行无标记单分子检测的方法。该技术通过频率锁定实现超高灵敏度检测，无需标记即可分析蛋白质折叠与结合动力学，为生化研究提供可靠工具。

基于微环形光学谐振器的无标记单分子检测

探索更多视频