基于微环形光学谐振器的无标记单分子检测

本实验的总体目标是利用基于光学谐振腔技术和频率锁定的技术，在无需标记的情况下检测单个分子和超小纳米颗粒。该方法有助于解答生物化学领域中的一些关键问题，例如蛋白质折叠和结合动力学。该技术的主要优势在于，无需对目标分子进行标记即可实现其检测。

该技术的设置包括将一个微型 OID 芯片与一根光纤耦合。首先，获取一个微型 OID 芯片。该芯片是一个尺寸约为 6.5 毫米 × 5.5 毫米的硅基芯片，其上制备有微型 OID 结构。

如图所示，微米级OID的主直径为80至100微米，次直径为2微米。暂时将芯片放置一旁，准备光纤以实现与芯片的耦合。使用一卷单模光纤，展开约一米长的光纤。

取一把剥线钳，大致位于光纤的未缠绕部分中间位置。用剥线钳剥离光纤上一段2.5厘米长的聚合物涂层。该去除了涂层的区域即为光纤的耦合区域。

剥除光纤涂覆层后，使用无尘布和异丙醇酒精清洁已剥除的区域。接着，使用带磁性夹具的光纤夹具固定清洁后的部分。下一步，将步进电机布置好，以便向相反方向拉伸光纤。

调整光纤夹具的位置，以便在剥离区域两侧将步进电机连接到光纤上。此外，在光纤的一端连接一个激光器，作为光源。启动步进电机，使其向相反方向移动以拉伸光纤，并使用氢氧火炬熔化光纤的剥离部分。

持续监测光纤侧向散射的光信号。若出现闪烁现象，表明光在光纤中的传输不稳定，需进一步拉细。当闪烁停止时，停止加热和拉伸光纤，此时光纤直径已减小至约500纳米。

纤维拉细后，断开光源，并将纤维及其磁性夹具支架从牢固的电机上取下。接着，将纤维移至配备定位平台的气浮隔振台上。将纤维连同其磁性夹具支架放置在样品芯片前方的支撑块上。

定位平台是一个位于三轴千分尺之上的三轴纳米定位平台。除了纳米定位平台外，还配有顶视和侧视成像柱，以辅助对准。继续处理光纤时，应确保其已剥除涂覆层的部分靠近定位平台。

准备将光纤的自由端引入测量系统。在切割光纤自由端后，将其插入裸光纤适配器中。使用该适配器将光纤连接至连接示波器的自动平衡光电探测器的输入端。

现在将注意力集中到光纤的另一端。首先，将此端连接至一个光学耦合器。然后将光纤与在线偏振器的输出端耦合，该偏振器的输入来自一个50:50的分束器和一个可调谐二极管激光器。

以下是截至目前所建立连接的示意图。请注意，分束器的第二输出端通过一个内置偏振器，并用作自平衡光电接收器的参考信号。下一步是准备使用不锈钢样品支架安装微 OID 芯片。

使用双面胶带将芯片固定在样品 holder 上。然后将微芯片放置在样品 holder 的顶部。现在将带有芯片的样品 holder 安装到纳米定位平台的顶部。

此处，支架和芯片已放置在配备三个X轴微米调节装置的定位台上。粗略调整芯片相对于光纤的位置。图中显示的是完成粗调定位后的芯片与光纤。

接下来，进一步调整定位器，并使用成像柱将芯片与光纤对齐。使用波长与光纤激光波长相同的微OID时，该图像显示的是光纤与微环。在完成精细定位步骤后，视野中心附近的圆形贴纸为定位辅助标记。现在继续搜索微环的谐振波长。

生成一个三角波电压信号，以调节激光波长在约635纳米±2.5纳米范围内。随后扫描波长以寻找共振峰。在示波器上观察光纤中的透射信号。

请注意，在共振波长处，透射率会下降。此时需调整激光光的偏振态。调节光纤中的偏振控制器，以优化光纤内激光光的偏振状态。

使用示波器观察光电接收器的输出，并调节偏振态，直至测得的透射凹陷最窄。优化偏振态后，在样品台上构建样品腔。

该腔室由一片盖玻片通过环氧树脂粘合到显微镜载玻片上构成。载玻片起到间隔作用，使盖玻片能够悬伸出芯片和光纤。设置一个1 mL的注射泵及管路，以每分钟1 mL的流速将实验样品注入腔室中。

接下来，取一毫升已平衡至室温的样品用于注入泵中。在此情况下，该样品为含有5 nm二氧化硅微珠的溶液。注入后，观察样品室，并继续注入样品，当样品室充满时停止注入。此时该样品室已完成进样，其中已充满含有5 nm二氧化硅微珠的溶液。

等待30秒以减小振动影响后，搜索微谐振器的共振波长。再次使用示波器观察光纤在共振时的吸收谷值和透射情况。这是当前实验装置的示意图，其中包括比例-积分-微分（PID）控制器。

积分器与抖动。将控制器以自动锁定模式运行，并在峰值顶部进行锁定。将抖动频率设置为 2 千赫兹，将波长振荡幅度设置为 19 飞米。

通过实验确定 PID 参数后，可自动将激光波长锁定至微球谐振波长。通过记录反馈控制器的输出来收集数据。以下是采用三种不同尺寸结合颗粒（按尺寸顺序）的实验方案所生成的、以飞米为单位的谐振偏移随时间（秒）变化的代表性曲线。

这些颗粒是外泌体或纳米囊泡。五纳米的二氧化硅微球以及人白细胞介素-2分子。注意每组数据中垂直和水平轴（AE）的不同尺度。

观察到不同粒径的粒子在数据中呈现不同的尺度，表明该技术操作正确。当粒子结合到微腔（OID）时，微腔的共振波长增加，导致信号轨迹出现上升台阶；当粒子解离时，共振波长减小，导致信号轨迹出现下降台阶。

每个波长步长的高度由颗粒的大小及其在微球体上的位置决定。时间尺度则由颗粒微球体的动力学决定。一旦掌握，若操作正确，该技术可在大约三小时内完成。在进行此操作时，重要的是要始终记住尽可能保持所有物品清洁且无尘。