无标记单分子检测使用微型环光学谐振器
December 29th, 2015
我们开发了一种基于光学谐振器技术的无标记生物传感系统，称为锁频光学耳语倏逝共振器 （FLOWER），能够检测溶液中的单个分子。这里描述和介绍了这项工作背后的过程。
该程序的总体目标是使用基于光学谐振器技术和频率锁定的技术在不使用标记的情况下检测单个分子和超小纳米颗粒。这种方法可以帮助回答生化领域的关键问题，例如蛋白质折叠和结合动力学。该技术的主要优点是不需要标记目标分子即可对其进行检测。
该技术的设置涉及将 micro OID 芯片耦合到光纤。首先，获取 micro OID 芯片。这是一个大约 6.5 毫米 x 5.5 毫米的硅芯片，上面制造了一个微型 OID。
如图所示，微型 OID 的大直径为 80 至 100 微米，小直径为 2 微米。现在，将芯片放在一边并准备光纤以耦合芯片。使用线轴上的单模光纤，并展开大约一米的光纤。
获取剥线钳，大致在展开光纤的中间。使用它们从光纤上剥离 2.5 厘米的聚合物涂层段。这个剥离区域是光纤的耦合区域。
剥离光纤后，使用无绒湿巾和异丙醇清洁剥离区域。接下来，使用带有磁性夹的光纤支架将清洁后的部分固定到位。下一步，安排步进电机以向相反方向拉动光纤。
放置光纤支架，以便将步进电机连接到剥线区域任一侧的光纤上。此外，将激光器连接到光纤的一端以用作光源。启动步进电机以相反方向移动以拉伸光纤，并使用氢炬熔化光纤的剥离部分。
持续监测从光纤横向散射的光。闪烁表示通过光纤的透光率波动，需要进一步减薄。当闪烁停止时，停止加热和拉扯光纤，光纤已经细到大约 500 纳米。
光纤变细后，拆下光源，从顽固的电机上取下光纤及其磁性夹架。接下来，将纤维移动到配备有定位台的气动隔离工作台上。将光纤头放在样品芯片前方支撑块上的磁性夹支架中。
定位台是位于三轴千分尺顶部的三轴纳米定位台。除了纳米定位台外，还有顶视图和侧视图成像柱，以帮助对准。通过确保光纤的剥离部分靠近定位阶段，继续使用光纤。
准备将纤维自由端引入测量系统。劈开自由端后，将其插入裸露的光纤适配器中。使用适配器将光纤连接到连接到示波器的自动平衡光电接收器的输入端。
现在专注于光纤的另一端。首先，将此端连接到光耦合器。然后将光纤耦合到在线偏振器的输出端，该偏振器的输入来自 50 50 分束器和 ATT 可调二极管激光器。
以下是到目前为止的联系示意图。请注意，分束器的第二个输出通过内联偏振器，并用作自动平衡光电接收器的参考。下一步是准备使用不锈钢样品架安装微型 OID 芯片。
使用双面胶带将芯片固定到样品架上。然后将微芯片放在样品架的顶部。现在将带有芯片的样品架安装在纳米定位台的顶部。
在这里，支架和芯片通过三个 Xs 千分尺安装在定位台上。粗略定位，样品芯片相对于纤维。这是课程定位完成后的芯片和光纤。
接下来，进一步调整定位器，使用成像柱将芯片平行于光纤。用具有光纤激光波长的微型 OID，该图像是光纤和微米。在精细定位步骤之后，靠近视野中心的圆形贴纸是一种定位辅助工具。现在继续搜索微的谐振波长。
生成三角波形电压信号，将激光波长调节在约 635 纳米正负 2.5 纳米。现在扫描波长以搜索谐振。在示波器上观察通过光纤的传输情况。
请注意，在共振波长处，透射率下降。此时，调整激光的偏振。调整在线偏振控制器以优化光纤中激光的偏振。
使用示波器查看光电接收器的输出并调整极化，直到测得的透射率下降看起来最窄。优化极化后，构建样品室。在样品台上。
该腔室由玻璃盖玻片环氧树脂和显微镜组成。滑。滑块充当垫片，允许盖玻片悬垂在芯片和光纤上。布置一个 1 毫升注射泵和管道，以每分钟 1 毫升的速度将实验样品引入腔室。
接下来，取 1 mL 室温平衡样品装入泵中。在这种情况下，它是具有 5 纳米二氧化硅珠的溶液。加载后，观察样品室并注入样品 当腔室装满时停止，样品注射已停止在该腔室中，该腔室中充满了含有 5 纳米二氧化硅珠的溶液。
等待 30 秒以尽量减少振动的影响后，搜索微的共振波长。同样，使用示波器观察谐振时通过光纤的 Dip 和 Transmission。这是此时实验装置的示意图，包括比例积分微分或 PID 控制器。
积分器和抖动器。在峰值顶部锁定的自动锁定模式下运行控制器。将抖动频率设置为 2 kHz，并将波长振荡幅度设置为 19 飞米。
根据经验找到 PID 设置后，自动将激光的波长锁定到微 oid 的共振波长。通过记录反馈控制器的输出来收集数据。以下是使用三种不同结合粒子（按大小顺序）的方案产生的以秒为单位的共振偏移与时间（以秒为单位）的代表性痕迹。
这些颗粒是外泌体或纳米囊泡。5 纳米二氧化硅珠和人白细胞介素 2 分子。请注意每个数据集中垂直和水平 AE 的不同比例。
在数据中观察到不同粒径的不同尺度表明该技术已正确执行。当粒子与 oid 结合时，OID 的谐振波长增加，导致迹线上升。当粒子解除束缚时，共振波长减小，导致阶跃下降。
每个波长步长的高度由粒子的大小及其在微粒上的位置决定。时间尺度由粒子 OID 动力学决定 一旦掌握，如果作正确，这项技术可以在大约三个小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住保持一切尽可能清洁和无尘。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文介绍了一种利用频率锁定光低语逸散共振腔（FLOWER）技术的无标签生物传感系统，用于检测溶液中的单分子。所描述的方法允许检测超小纳米粒子而无需标记，解决了生物化学研究中的重大问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 纳米技术
- 光学传感
背景
- 单分子的检测对于理解生物化学过程至关重要。
- 传统方法通常需要标记，这可能会改变分子的行为。
- 光学共振腔技术为生物传感提供了一种新方法。
- 频率锁定提高了检测的灵敏度和特异性。
研究目的
- 开发一种无标签检测单分子的方法。
- 改善对蛋白质折叠和结合动力学的理解。
- 提供一种可靠的生物化学分析技术。
使用的方法
- 利用微型OID芯片与光纤耦合。
- 频率锁定以增强检测能力。
- 无标签检测目标分子。
- 涉及硅微型OID制造的实验设置。
主要结果
- 成功检测溶液中的单分子。
- 展示了无标签生物传感的优势。
- 对超小纳米粒子行为的洞察。
- 在各种生物化学领域的潜在应用。
结论
- FLOWER系统代表了生物传感技术的重大进步。
- 无标签检测为生物化学研究开辟了新途径。
- 该方法可以促进分子相互作用的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators addresses a critical bottleneck in early discovery by enabling direct, non-perturbative measurement of molecular interactions. This capability enhances predictive confidence in target validation and mechanistic studies, supporting risk-adjusted portfolio decisions. The FLOWER technique's sensitivity and label-free operation position it as a reusable platform for high-value R&D inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of molecular binding and folding without label-induced artifacts.
- Supports mechanistic de-risking by providing real-time, quantitative detection of single molecule events.
- Improves predictive confidence in target engagement and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, label-free assay systems for downstream compound screening.
- Delivers quantitative, reproducible readouts suitable for standardization across discovery teams.
- Enables rapid assessment of molecular interactions for screening readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting detection of disease-relevant biomolecules.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling sensitive, label-free detection in complex matrices.
- Reduces biological risk in preclinical advancement through robust, artifact-free measurement.
Pipeline & Workflow Integration
The FLOWER method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting hypothesis testing and mechanistic validation before preclinical transition.
- Discovery Biology: Advances hypothesis-driven research by enabling direct measurement of molecular events.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative outputs for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates high signal-to-noise resonance shift data for comparative analysis of binding events.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity across discovery and preclinical phases.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, label-free detection platform adaptable to diverse molecular targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes detection workflows and enhances reproducibility across R&D teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical resonator setup and precision alignment.
- Demands access to specialized instrumentation, including microtoroid chips and frequency locking controllers.
- Necessitates rigorous cleanliness and dust control to maintain sensitivity.
- May require adaptation for different molecular targets or sample matrices.
- Operational throughput and scalability depend on technical proficiency and infrastructure.
