体外利用AC-6饲养系统从共同淋巴样前体细胞生成小鼠浆细胞样树突状细胞

本实验的总体目标是提供一种高效生成浆细胞样树突状细胞（PDCs）的方法，以用于研究其发育过程。该方法有助于解答免疫学领域的一些关键问题，例如：PDC的发育是如何被调控的？该技术的主要优势在于，能够利用少量前体细胞高效地生成大量PDCs。

该技术的应用前景涉及与 PDC 相关的自身免疫性疾病治疗，例如系统性红斑狼疮、手足徐动症和银屑病。今天将由实验室的优秀学生 xang 演示实验操作。在骨髓细胞收获前一日，将 AC6 基质细胞系细胞以每孔 5.9 × 10⁴ 个细胞的密度接种于 12 孔板的各个孔中，每孔加入适量培养基，于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。次日清晨，以 3000 rad 的剂量对 AC6 细胞进行 γ 射线照射，并更换培养基为 1 毫升完全培养基。

接下来，将适当数量的成年野生型 C57BL/6 小鼠放入解剖托盘中，并用 70% 乙醇对动物进行消毒。然后将托盘转移至半无菌罩内，于每只动物腹部中线处做切口，剥离远端部位的皮肤，包括下肢部分，以暴露股骨和胫骨；在膝关节上方剪断股骨，在膝关节下方剪断胫骨，并在收集过程中使用剪刀将肌肉组织从骨骼上剥离。将分离出的骨骼置于含有 5 毫升完全 RPMI 培养基的 6 厘米培养皿中，并将培养皿转移至无菌培养罩内。

现在，用完全 RPMI 培养基填充一支带有 27 号针头的 3 毫升注射器，并用剪刀剪去每根骨骼的两端。将针头插入每根骨骼中，从每一端轻轻注射一次完全 RPMI 培养基，以冲洗出骨髓。然后取下针头，在培养皿中轻柔地吸取并吹打细胞 3 至 5 次，以制备单细胞悬液。

离心细胞后，用1 mL CK缓冲液裂解红细胞，并加入10倍体积的完全RPMI培养基终止反应。室温静置1分钟后，让死细胞团块和碎片沉淀5分钟，然后小心将上清液倒入新离心管中。再次离心细胞后，将全部骨髓细胞重悬于100 µL FACS缓冲液中，用于通过流式细胞术分析普通淋巴样前体细胞（common lymphoid progenitors, CLPs）。

接下来，用抗 CD 16 至 32 抗体对细胞进行封闭，时间为一到两分钟，随后用适当的抗体混合物同时对细胞进行染色。冰上孵育 15 分钟后，用 3 毫升 fax 缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于 300 微升新鲜 fax 缓冲液中。然后将细胞悬液通过 40 微米滤网过滤，并立即使用适当的滤光片和电压在流式细胞仪上分选细胞。

将目标细胞收集到含有8毫升完全RPMI培养基的15毫升离心管中。为了获得高度富集的PDCM细胞群体，关键步骤是从收获的骨髓细胞中分选出正确的CLP细胞群体，并利用Z六饲养系统进行体外培养。分选结束后，离心细胞，然后用足量的完全RPMI重悬CLP细胞沉淀，使细胞密度达到约5 × 10⁴ 个细胞/毫升。

将每孔500个细胞接种至含有AC六种饲养细胞的12孔板中，向共培养体系中添加100纳克/毫升的FL三配体，然后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，并定期在显微镜下观察树突状细胞（DC）的发育情况。第12天，收集共培养上清液中的细胞，用0.5毫升完全RPMI培养基洗涤每个孔一次，合并所得上清液及洗涤液。随后向每孔加入0.5毫升新鲜培养基，使用细胞刮棒刮下贴壁细胞。

将脱离的细胞与悬浮细胞合并，离心获得的细胞悬液。通过在50 µL封闭缓冲液中重悬沉淀来重悬细胞。然后计数细胞，并在Fc受体封闭后对CD11c、CD11b和B220表达进行染色。

如上所述，随后可对共培养细胞进行分析，检测其中是否存在传统的 CD11C 阳性、CD11B 阳性、B220 阴性以及浆细胞样 DC（pDC）CD11C 阳性、CD11B 阴性、B220 阳性细胞群，总数可达 4 至 6 × 10⁷ 个。骨髓细胞通常来源于一只 6 至 8 周龄的野生型 C57BL/6 小鼠的股骨和胫骨，一只 C57BL/6 小鼠通常可获得约 5 × 10⁴ 个 CLP（common lymphoid progenitors，共同淋巴样前体细胞）。在通过流式细胞术分选后，如上所述，与 AC6 饲养层细胞共培养第 3 至 4 天时，开始出现成坑样区域形成细胞（cobblestone area-forming cells），其上悬浮着呈圆形的浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid DC）。

到第8天时，浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid DC）的数量在第12至14天左右达到峰值，此时细胞在完全发育后开始进入凋亡阶段，其数量随之逐渐减少。传统型树突状细胞（conventional DC）集落在第6至8天出现较晚，呈贴壁生长，具有较大的梭形形态。流式细胞术分析显示，共培养体系中91%的细胞为CD11c阳性、CD11b阴性、B220阳性浆细胞样树突状细胞，6%为CD11c阳性、CD11b阳性、B220阴性传统型树突状细胞，表明通过该方法，浆细胞样树突状细胞的数量较原始CLP群体扩增了约100倍。

在进行该实验操作时，重要的是在分化后添加CLP之前，确保a c六孔细胞状态良好且C密度正确。该技术为DC生物学领域的研究人员克服了使用少量前体细胞研究DC发育的局限性铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用C六孔BEAT系统在体外由CLP诱导生成PC细胞。