Name: 在体外产生的常见淋巴祖使用AC-6馈线系统的小鼠浆细胞样树突细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学习使用AC-6饲养层系统和Flt3配体从小鼠常见淋巴祖细胞体外高效生成浆细胞样树突状细胞的方法。该技术可利用少量祖细胞获得大量pDC，为自身免疫疾病研究提供重要工具。

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我们感谢Markus Manz博士和Irving Weissman博士提供试剂。同时感谢台湾大学医学院第一和第二核心实验室的流式细胞分析与细胞分选核心设施以及台湾大学医院所提供的服务。本研究由台湾科技部（MOST 102-2320-B-002-030-MY3）和台湾国家卫生研究院（NHRI-EX102-10256SI 和 NHRI-EX103-10256SI）资助。

野生型 C57BL/6 小鼠购自中国台湾国家实验动物中心（NLAC）。所有小鼠均在特定无病原体条件下饲养和保藏。实验方案及动物使用程序均经台湾大学医学院机构动物照护及使用委员会审查并批准（许可编号：20120075）。此外，研究人员在进行实验时尽一切努力减少动物可能经历的疼痛、痛苦或应激。所述所有操作均在室温下佩戴手套进行。
1. AC-6 饲养细胞的制备
注意：AC-6.21（简称 AC-6）基质细胞系18（由斯坦福大学 I. Weissman 提供）应培养在添加了15%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中。为用作饲养层细胞，AC-6细胞需在共培养前一天接受3,000 rad（30 Gy）的γ射线照射，以阻止其增殖。需注意，若AC-6细胞在传代培养过程中过度拥挤，或传代次数超过20代，其支持分化的能力往往会下降。
<ol>
	<li>用 1 ml 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤 AC-6 细胞一次，并通过抽吸去除 DPBS。加入 0.8 ml 胰蛋白酶溶液（含 0.05% 胰蛋白酶和 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液），在 37oC、5% CO2 条件下处理 3–5 分钟，随后用 10 倍体积的培养基稀释以终止反应，制备成单细胞悬液。</li>
	<li>将 AC-6 细胞以每孔 5.9×104 个细胞的密度接种至 12 孔板中，在 37oC、5% CO2 条件下过夜培养。 
	注意：AC-6 细胞的密度至关重要，较低的密度有利于 cDC 的生成。以每孔 5.9×104 个细胞的密度接种可使 AC-6 细胞在次日达到汇合状态，此状态最有利于从 CLP 细胞诱导生成 pDC。</li>
	<li>使用 γ 射线辐照仪对 AC-6 细胞进行 3,000 rad（30 Gy）的辐照处理。 
	注意：该辐照剂量经过优化，旨在阻止细胞增殖，同时保持细胞足够长的存活时间，以提供 CLP 向 DC 分化过程中所需的细胞因子及细胞间接触信号。</li>
	<li>抽吸培养基，更换为 1 ml 完全 RPMI 培养基（含 10% 热灭活 FBS、50 µg/ml 庆大霉素和 50 µM β-巯基乙醇的 RPMI 培养基）。</li>
</ol>
2. 从小鼠中分离骨髓细胞
<ol>
	<li>采用 CO2 窒息法结合颈椎脱位处死小鼠。将小鼠置于解剖托盘上，并用 70% 乙醇进行表面消毒。在腹部中线处做切口，剥离小鼠远端皮肤，包括覆盖下肢的皮肤。</li>
	<li>在半无菌操作台内进行解剖。剪断膝关节上方的股骨和下方的胫骨以取出骨骼。用剪刀去除附着在骨上的肌肉，将骨骼放入含有 5 ml 完全 RPMI 培养基的 6 cm 培养皿中。</li>
	<li>转移至无菌细胞培养超净台。用连接 27G 针头的 3 ml 注射器吸取完全 RPMI 培养基。用剪刀剪去骨的两端，将 27G 针头插入骨髓腔，从每端各轻柔注入一次完全 RPMI 培养基，以冲洗出骨髓细胞。</li>
	<li>取下针头，使用该注射器在培养皿中轻柔吹打细胞 3–5 次，制备单细胞悬液。</li>
	<li>以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入 1 ml ACK 裂解缓冲液（150 mM NH4Cl，10 mM KHCO3，0.1 mM EDTA）裂解红细胞，孵育 1 分钟后，加入 10 倍体积的完全 RPMI 培养基终止反应。静置 5 分钟，使死亡细胞团块和组织碎片在重力作用下沉降形成沉淀。 
	注意：静置时间不得超过 5 分钟，否则会导致活细胞沉降而造成细胞损失。</li>
	<li>缓慢将含有细胞的上清液转移至新离心管中，保留沉淀物于原管内。</li>
	<li>以 500 × g 离心 5 分钟使细胞成团，随后吸除并弃去上清液。</li>
	<li>将总骨髓细胞（通常每只小鼠可获得 4–6 × 107 个骨髓细胞）重悬于 100 µl FACS 缓冲液（1× PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA）中。</li>
</ol>
3. CLP 的 FACS 分析与分选
<ol>
	<li>在 FACS 缓冲液（步骤 2.9）中加入抗 CD16/32 抗体（杂交瘤上清液，克隆号 2.4G2，每反应 50 µl 或 1–2 µg），作用 1–2 分钟，以阻断 Fc 受体。 
	注意：抗 CD16/32 也称为 Fc 封闭抗体，用于防止抗体非特异性结合表达 Fc 受体的细胞，包括粒细胞、单核细胞和 B 淋巴细胞。</li>
	<li>在冰上避光孵育 15 分钟，同时使用以下荧光染料标记的抗体对细胞进行染色（针对 4×107 个细胞）。抗体包括：PE 标记的谱系标记物（每种 0.2 µg），即抗 CD3（17A2）、抗 CD8（53-6.7）、抗 B220（RA3-6B2）、抗 CD19（eBio1D3）、抗 CD11b（M1/70）、抗 Gr-1（RB6-8C5）、抗 Thy1.1（HIS51）、抗 NK1.1（PK136）、抗 TER119（TER-119）和抗 MHC-II（NIMR-4）；0.2 µg 抗 c-Kit-PerCP-Cy5.5（2B8）；0.2 µg 抗 IL-7Rα-PE-Cy7（A7R34）；0.4 µg 抗 M-CSFR-APC（AFS98）；以及 1 µg 抗 Sca-1-FITC（D7）。</li>
	<li>用 3 ml FACS 缓冲液洗涤细胞，并在 500 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于 300 µl FACS 缓冲液中，并通过 40 µm 细胞滤器过滤。</li>
	<li>用额外的 100 µl FACS 缓冲液冲洗离心管，以回收残留细胞，并使用同一细胞滤器将液体过滤至无菌 FACS 分选管中。</li>
	<li>染色后立即使用适当的滤光片和电压进行流式细胞术分析，以检测信号。使用 488 nm 激光检测 FITC 和 PerCP-Cy5.5 标记的抗体，561 nm 激光检测 PE 和 PE-Cy7 标记的抗体，633 nm 激光检测 APC 标记的抗体。</li>
	<li>根据以下表型标记分选 CLP 细胞：lin-c-kitintSca-1intM-CSFR-IL-7Rα+（如步骤 3.2 所染色），使用细胞分选仪进行分选。将分选出的细胞收集至含有 8 ml 完全 RPMI 培养基作为缓冲层的 15 ml 管中。</li>
	<li>记录分选结束时细胞分选仪显示的分选细胞绝对数量。通常，从小鼠骨髓中可获得约 5×104 个 CLP 细胞。</li>
</ol>
4. 共培养CLPs与AC-6
<ol>
	<li>将步骤 3.7 中分选的细胞在 500 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，并用足量的完全 RPMI 培养基重悬细胞沉淀，使细胞密度约为 5×104 个细胞/毫升。将 500 个细胞/孔接种至含有步骤 1.4 中制备的饲养细胞的 12 孔板中。</li>
	<li>加入 100 ng/ml FL19（hu-Flt3L-Ig，由瑞士苏黎世大学医院 M. Manz 提供的表达系统在本实验室制备），在 37oC、5% CO2 条件下培养，并定期在显微镜下观察树突状细胞（DC）的发育情况。 
	注意：可使用市售的重组人源 FL 或小鼠 FL 替代 hu-Flt3L-Ig，以支持 DC 的发育。</li>
	<li>在第 12 天收集上清液中的细胞，并用 0.5 ml 完全 RPMI 培养基洗涤孔板一次，合并所得上清液。加入 0.5 ml 新鲜培养基，并用细胞刮刀刮下贴壁细胞。</li>
	<li>合并两部分含细胞的培养基，于 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>倾去上清液，将细胞重悬于 50 µl FACS 缓冲液中。加入 50 µl 抗 CD16/32 杂交瘤上清液，孵育 1–2 分钟以阻断 Fc 受体。</li>
	<li>使用以下抗体（每种 0.05 µg）对所有细胞进行计数并染色：抗 CD11c-APC（N418）、抗 CD11b-FITC 和抗 B220-PE。</li>
	<li>按照步骤 3.3 所述方法洗涤并离心细胞。</li>
	<li>将细胞重悬于 100 µl FACS 缓冲液中，圈选 CD11c+ 细胞，并分析传统树突状细胞（cDCs，CD11c+CD11b+B220-）和浆细胞样树突状细胞（pDCs，CD11c+CD11b-B220+）17。</li>
</ol>

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<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li>
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<li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li>
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<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在此我们描述一种 体外 一种可从少量CLPs高效生成树突状细胞（DCs），尤其是浆细胞样树突状细胞（pDCs）的培养体系。该培养体系的独特之处在于使用AC-6细胞（一种基质细胞系）作为饲养层。该方法已被证实不仅能提供IL-7、SCF、M-CSF和FL等细胞因子，20，还包括细胞间的接触21 支持DC发育所必需。AC-6细胞此前已被用于促进相关研究。 体外 多种前体细胞分化为树突状细胞的发育过程8,16,22我们发现，接种适当密度的AC-6饲养细胞对于支持pDCs从CLPs高效分化至关重要。具体而言，接种5.9×10⁵4 在12孔板中，γ射线照射的AC-6细胞于次日达到汇合状态，适用于pDC的发育。较低的AC-6细胞密度（3.9×10⁵412 孔板中的每个孔）倾向于支持 cDC 的发育24因此，建议首先接种不同浓度的AC-6细胞，以在扩增培养体系时优化培养条件。23此外，同样重要的是&#160;必须严格维护AC-6细胞，包括密切注意传代次数，且绝不可使...

树突状细胞（DCs）是一类专业的抗原呈递细胞，在调控免疫应答中发挥重要作用1。尽管DCs具有异质性，但通常可分为两大类：传统树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）2,3。除了存在于淋巴器官外，cDCs和pDCs也分布于肺、肠道和皮肤等组织中2。cDCs和pDCs在形态上有所不同，cDCs具有树突状突起，而pDCs的形态更类似于浆细胞。此外，小鼠DC的通用标志物CD11c在cDCs上的表达水平高于pDCs。cDCs还可进一步分为CD11b+CD24- cDCs和CD11b-CD24+ cDCs，这两类细胞表达的MHC II类分子和共刺激分子水平均高于pDCs2。相比之下，成熟的pDCs可选择性表达Siglec-H和BST24。在功能上，cDCs的抗原呈递能力优于pDCs；然而，pDCs在病毒感染或炎症刺激下能够产生大量I型干扰素5。
cDC和pDC的寿命较短，因此必须由骨髓（BM）中的前体细胞持续补充6,7将普通髓系祖细胞（CMPs）和普通淋巴系祖细胞（CLPs）过继转移至致死剂量照射的小鼠体内，证明cDCs和pDCs均可由这两种谱系生成8-10然而，存在一部分pDCs表达RAG1/2，并在IgH位点具有重排的D-J片段11,12这些细胞在分子特征上也与B淋巴细胞具有相似性，包括表达B220标志物、核酸感应受体（TLR7/TLR9）以及转录因子Spib 和 Bcl11a)13，这些特征均被认为是淋巴细胞系的标志。因此，CLPs 可能是理想的选择 体外 由于谱系相似性，pDCs的生成。
尽管人类和小鼠中cDCs和pDCs的频率都非常低6，树突状细胞（DCs），特别是经典树突状细胞（cDCs），可以被诱导生成 体外 在细胞因子（如GM-CSF）存在的情况下，从骨髓或前体细胞中11,14 或使用无饲养层系统制备 Flt3 配体（FL） 11,15,16然而，遗憾的是，无法大量生成pDCs 体外 使用 FL11,15,16. 之前我们已证明，pDCs 可被高效地生成 体外 使用AC-6饲养层系统从CLPs中分离17使用AC-6基质细胞系在培养体系中的优势在于其能够提供细胞间接触以及分泌支持从CLPs大量生成pDCs的细胞因子。尽管该体系的产量较高，但仍需严格重复以下所述操作步骤，以确保pDCs的高效生成。

<table><tbody><tr><td>抗小鼠 Ly6g/Ly6c（PE），克隆 RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>谱系标记</td></tr><tr><td>抗小鼠 NK1.1（PE），克隆 PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>谱系标记</td></tr><tr><td>抗小鼠&amp;nbsp; CD11b（PE），克隆 M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>谱系标记</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD19（PE），克隆 eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>谱系标记</td></tr><tr><td>抗小鼠 B220（PE），克隆 RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>谱系标记/FACS</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3（PE），克隆 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>谱系标记</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD8a（PE），克隆 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>谱系标记</td></tr><tr><td>抗小鼠 MHC-II（PE），克隆 NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>谱系标记</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ter119（PE），克隆 TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>谱系标记</td></tr><tr><td>抗小鼠 Thy1.1（PE），克隆 HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>谱系标记</td></tr><tr><td>抗小鼠 M-CSFR（APC），克隆 AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>抗小鼠 c-Kit（PerCP/Cy5.5），克隆 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>抗小鼠 Sca-1（FITC），克隆 D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>抗小鼠 IL-7Ra（PE/Cy7），克隆 A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c（PerCP/Cy5.5），克隆 N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b（FITC），克隆 M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>FACS</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>细胞分选仪</td></tr><tr><td>FACS 分选管&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>流式分析软件</td></tr></tbody></table>

体外利用ac-6饲养系统从共同淋巴样前体细胞生成小鼠浆细胞样树突状细胞

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

浆细胞样树突状细胞（pDCs）是一类强大的Ⅰ型干扰素（IFN-I）产生细胞，可在感染或炎症反应中被激活。然而，由于其在淋巴器官中频率较低，加之现有研究方法的局限，pDCs功能的研究受到阻碍。 体外 树突状细胞的生成通常更倾向于产生经典树突状细胞（cDCs）而非浆细胞样树突状细胞（pDCs）。本文介绍一种从常见淋巴样祖细胞（CLPs）高效生成pDCs的独特方法。 体外具体而言，本方案详细描述了如何从骨髓中纯化CLPs，并在Flt3配体存在下，通过与γ射线照射的AC-6饲养细胞共培养以生成pDCs。该培养系统的一个独特特征是CLPs会迁移至AC-6细胞下方，并形成类鹅卵石区域细胞（cobblestone area-forming cells），这是扩增pDCs的关键步骤。在最佳条件下，经过约2周培养后可生成形态上 distinct 的树突状细胞，即pDCs和cDCs，其中pDCs占比为70–90%。通常情况下，采用该方法生成的pDCs数量约为接种CLPs数量的100倍。因此，该系统是一种可高效生成大量pDCs的新型方法，有助于进一步研究这些细胞的发育与功能。

通常从一只6-8周龄的野生型C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离出约4-6×107个骨髓细胞。为分选CLP，需将全部骨髓细胞用PE标记的谱系标志物抗体（CD3、CD8、B220、CD19、CD11b、Gr-1、Thy1.1、NK1.1、TER119和MHC-II）、抗c-Kit-PerCP/Cy5.5、抗Sca-1-FITC、抗M-CSFR-APC以及抗IL-7Rα-PE/Cy7进行染色，随后通过细胞分选仪进行分析和分选。CLP的分选策略见图1。通常，从一只C57BL/6小鼠可获得约5×104个CLP。若需获得更多CLP，可合并3-4只小鼠的骨髓细胞，并在分选前相应调整实验方案。
将500个CLP细胞与5.9×106个AC-6饲养细胞共培养后，到第3-4天开始出现鹅卵石样区域形成细胞（CAFC）。到第8天，出现圆形的浆细胞样树突状细胞（pDC），悬浮于CAFC之上（图2A）。pDC数量在第12-14天左右达到峰值，此时pDC在完全发育后开始发生凋亡，...

本研究中，我们介绍了一种 体外 可高效生成浆细胞样树突状细胞的培养系统 由 在Flt3配体存在下，将普通淋巴样祖细胞与AC-6饲养细胞共培养。

体外利用AC-6饲养系统从共同淋巴样前体细胞生成小鼠浆细胞样树突状细胞

浆细胞样树突状细胞（pDCs）是强大的Ⅰ型干扰素（IFN-I）产生细胞，可在感染发生时或某些疾病过程中被激活……

本实验的总体目标是提供一种高效生成浆细胞样树突状细胞（PDCs）的方法，以用于研究其发育过程。该方法有助于解答免疫学领域的一些关键问题，例如：PDC的发育是如何被调控的？该技术的主要优势在于，能够利用少量前体细胞高效地生成大量PDCs。该技术的应用前景涉及与 PDC 相关的自身免疫性疾病治疗，例如系统性红斑狼疮、手足徐动症和银屑病。今天将由实验室的优秀学生 xang 演示实验操作。在骨髓细胞收获前一日，将 AC6 基质细胞系细胞以每孔 5.9 × 10⁴ 个细胞的密度接种于 12 孔板的各个孔中，每孔加入适量培养基，于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。次日清晨，以 3000 rad 的剂量对 AC6 细胞进行 γ 射线照射，并更换培养基为 1 毫升完全培养基。接下来，将适当数量的成年野生型 C57BL/6 小鼠放入解剖托盘中，并用 70% 乙醇对动物进行消毒。然后将托盘转移至半无菌罩内，于每只动物腹部中线处做切口，剥离远端部位的皮肤，包括下肢部分，以暴露股骨和胫骨；在膝关节上方剪断股骨，在膝关节下方剪断胫骨，并在收集过程中使用剪刀将肌肉组织从骨骼上剥离。将分离出的骨骼置于含有 5 毫升完全 RPMI 培养基的 6 厘米培养皿中，并将培养皿转移至无菌培养罩内。现在，用完全 RPMI 培养基填充一支带有 27 号针头的 3 毫升注射器，并用剪刀剪去每根骨骼的两端。将针头插入每根骨骼中，从每一端轻轻注射一次完全 RPMI 培养基，以冲洗出骨髓。然后取下针头，在培养皿中轻柔地吸取并吹打细胞 3 至 5 次，以制备单细胞悬液。离心细胞后，用1 mL CK缓冲液裂解红细胞，并加入10倍体积的完全RPMI培养基终止反应。室温静置1分钟后，让死细胞团块和碎片沉淀5分钟，然后小心将上清液倒入新离心管中。再次离心细胞后，将全部骨髓细胞重悬于100 µL FACS缓冲液中，用于通过流式细胞术分析普通淋巴样前体细胞（common lymphoid progenitors, CLPs）。接下来，用抗 CD 16 至 32 抗体对细胞进行封闭，时间为一到两分钟，随后用适当的抗体混合物同时对细胞进行染色。冰上孵育 15 分钟后，用 3 毫升 fax 缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于 300 微升新鲜 fax 缓冲液中。然后将细胞悬液通过 40 微米滤网过滤，并立即使用适当的滤光片和电压在流式细胞仪上分选细胞。将目标细胞收集到含有8毫升完全RPMI培养基的15毫升离心管中。为了获得高度富集的PDCM细胞群体，关键步骤是从收获的骨髓细胞中分选出正确的CLP细胞群体，并利用Z六饲养系统进行体外培养。分选结束后，离心细胞，然后用足量的完全RPMI重悬CLP细胞沉淀，使细胞密度达到约5 × 10⁴ 个细胞/毫升。将每孔500个细胞接种至含有AC六种饲养细胞的12孔板中，向共培养体系中添加100纳克/毫升的FL三配体，然后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，并定期在显微镜下观察树突状细胞（DC）的发育情况。第12天，收集共培养上清液中的细胞，用0.5毫升完全RPMI培养基洗涤每个孔一次，合并所得上清液及洗涤液。随后向每孔加入0.5毫升新鲜培养基，使用细胞刮棒刮下贴壁细胞。将脱离的细胞与悬浮细胞合并，离心获得的细胞悬液。通过在50 µL封闭缓冲液中重悬沉淀来重悬细胞。然后计数细胞，并在Fc受体封闭后对CD11c、CD11b和B220表达进行染色。如上所述，随后可对共培养细胞进行分析，检测其中是否存在传统的 CD11C 阳性、CD11B 阳性、B220 阴性以及浆细胞样 DC（pDC）CD11C 阳性、CD11B 阴性、B220 阳性细胞群，总数可达 4 至 6 × 10⁷ 个。骨髓细胞通常来源于一只 6 至 8 周龄的野生型 C57BL/6 小鼠的股骨和胫骨，一只 C57BL/6 小鼠通常可获得约 5 × 10⁴ 个 CLP（common lymphoid progenitors，共同淋巴样前体细胞）。在通过流式细胞术分选后，如上所述，与 AC6 饲养层细胞共培养第 3 至 4 天时，开始出现成坑样区域形成细胞（cobblestone area-forming cells），其上悬浮着呈圆形的浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid DC）。到第8天时，浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid DC）的数量在第12至14天左右达到峰值，此时细胞在完全发育后开始进入凋亡阶段，其数量随之逐渐减少。传统型树突状细胞（conventional DC）集落在第6至8天出现较晚，呈贴壁生长，具有较大的梭形形态。流式细胞术分析显示，共培养体系中91%的细胞为CD11c阳性、CD11b阴性、B220阳性浆细胞样树突状细胞，6%为CD11c阳性、CD11b阳性、B220阴性传统型树突状细胞，表明通过该方法，浆细胞样树突状细胞的数量较原始CLP群体扩增了约100倍。在进行该实验操作时，重要的是在分化后添加CLP之前，确保a c六孔细胞状态良好且C密度正确。该技术为DC生物学领域的研究人员克服了使用少量前体细胞研究DC发育的局限性铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用C六孔BEAT系统在体外由CLP诱导生成PC细胞。

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免疫学与感染

在体外产生的常见淋巴祖使用AC-6馈线系统的小鼠浆细胞样树突细胞

本视频展示了从小鼠骨髓中分化髓系树突状细胞的操作流程。视频中演示了小鼠胫骨和股骨的分离以及骨髓的处理过程。同时展示了细胞在分化前后形态学特征的图片，以及使用CpG诱导成熟后细胞表型和IL-12分泌情况的图示。...

从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

树突状细胞在次级淋巴器官中进行抗原提呈，对于启动T细胞介导的适应性免疫应答至关重要。本文中，我们展示了小鼠骨髓来源树突状细胞的培养、活化及用于双光子成像的标记方法。...

用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

本视频介绍了一种从小鼠成年小鼠骨髓中生成树突状细胞的实验方案——树突状细胞是激活T细胞的关键抗原呈递细胞。...

骨髓来源树突状细胞的制备：一种从小鼠骨髓生成树突状细胞的方法

来源：Cruz-Adalia, A., et al. T细胞通过树突状细胞的转感染捕获细菌。J. Vis. Exp.

通过免疫突触形成的体外细菌转感染T细胞

从共同淋巴样前体细胞体外生成浆细胞样树突状细胞

本方案描述了利用FACS介导的细胞分离、水动力基因转移以及Peyer氏斑中免疫细胞亚群的流式分析等技术，评估浆细胞样树突状细胞由共同树突状细胞前体在Peyer氏斑中分化过程的实验步骤。...

采用造血祖细胞过继转移法评估派伊尔集合淋巴结中鼠源浆细胞样树突状细胞的发育

不同的树突状细胞亚群作为稀有群体存在于淋巴器官中，因此难以分离出足够数量和高纯度的细胞用于免疫学实验。本文介绍一种高效、高产量的方法，用于分离目前所知的所有小鼠脾脏树突状细胞主要亚群。...

一种高效且高得率的小鼠树突状细胞亚群分离方法

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外...

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

本文介绍了一种用于开发和表征耐受性树突状细胞（TolDCs）并评估其免疫治疗效用的实验方案。...

小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本文介绍了一种体内增强肠道归巢调节性T细胞诱导的实验方案。在该方案中，树突状细胞被改造为能够局部从头合成高浓度的活性维生素D（1,25-二羟基维生素D或1,25[OH]2D）和活性维生素A（视黄酸或RA）。...

体内增强肠道归巢性调节性T细胞的诱导

学习使用AC-6饲养层系统和Flt3配体从小鼠常见淋巴祖细胞体外高效生成浆细胞样树突状细胞的方法。该技术可利用少量祖细胞获得大量pDC，为自身免疫疾病研究提供重要工具。

体外利用AC-6饲养系统从共同淋巴样前体细胞生成小鼠浆细胞样树突状细胞

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