利用仙台病毒在无饲养层条件下由人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞

本实验的总体目标是在无饲养层条件下，从人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。该方法有助于回答再生医学领域中的关键问题，包括iPSC细胞如何应用于临床治疗。该技术的主要优势在于，可在不引入潜在有害因子的情况下获得iPSC细胞，从而降低致病风险。

该技术的意义在于，由于这种侵入性细胞取样方法结合了降低发育中的诱导多能干细胞暴露于未明病原体风险的优势，因而可拓展至具有临床相关性的诱导多能干细胞疗法领域。因此，该方法可为诱导多能干细胞的临床治疗应用提供重要见解，还可应用于疾病建模等其他研究领域。

通过将10毫升肝素化全血与10毫升DPBS溶液混匀，开始制备活化的人T细胞。将15毫升Fol溶液移入50毫升锥形管中。沿管内壁缓慢将稀释后的血液加入，使其在溶液上方形成分层。

注意不要扰动界面。在室温下以400 × g离心30分钟。离心后可见三层，包括下层透明层、含有单个核细胞的薄白色层以及上层乳白色血浆层。

将单个核细胞层转移至新的50毫升锥形管中，注意不要转移任何滤液。随后，加入DPBS，使总体积达到10毫升。在室温下以200 × g离心5分钟。

弃去上清液，用10毫升DPBS洗涤细胞，以200 × g离心5分钟，然后移除上清液。随后向细胞中加入1毫升KBM 5 0 2培养基，使用血细胞计数板进行细胞计数，以准备细胞培养皿。用含10微克/毫升抗人CD3抗体的PBS溶液包被6孔板的各孔。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少30分钟。

孵育后，从八孔板中移除抗体溶液，用 PBS 洗涤一次，然后以每平方厘米 2.5 × 10⁵ 个细胞的密度将单个核细胞接种于涂有包被物的六孔板中，每孔总体积为 2 毫升 KBM 502 培养基。在不更换培养基的情况下孵育细胞 3 至 7 天，此时 T 细胞应达到汇合状态。孵育 3 至 7 天后，将活化的 T 细胞连同培养基转移至 15 毫升锥形管中，在 200 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，加入 1 毫升新鲜的 KBM 502 培养基。

计数细胞，并将1.5 × 10⁶个细胞接种至含有2 mL KBM 502培养基的抗CD3抗体包被的6孔板的每个孔中。随后，在冰上解冻OC3、SOX2、KLF4和C-MYC-H以及L型仙台病毒溶液，将每种经基因工程改造的仙台病毒溶液分别加入各孔，感染复数（MOI）为10。在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。然后用移液器收集感染的细胞，并转移至15 mL锥形管中。

以200 × g离心细胞5分钟。弃去上清液，加入2毫升新鲜KBM 502培养基。将细胞重新置于六孔板的孔中，并在细胞培养箱中孵育24小时。

为了扩增细胞，首先将基底膜基质溶液在4°C下过夜解冻，取0.2毫升该溶液溶解于10毫升DMEM/F12培养基中，将5毫升基底膜基质溶液接种至100毫米培养皿中。将培养皿置于室温下至少30分钟，使基质充分包被培养皿表面，然后再接种细胞。与此同时，收集SAI病毒感染的T细胞至15升锥形管中，在200 × g条件下离心5分钟。

然后将腭组织重悬于1毫升新鲜的KBM 502培养基中，在30分钟孵育期结束后，使用血细胞计数板对细胞进行计数。从两个培养板中移除基底膜基质溶液，随后将1×10⁵个细胞和1×10⁶个细胞分别重悬于10毫升新鲜的M-T-E-S-R培养基（一种用于诱导多能干细胞的饲养细胞无血清培养基）中。将每种细胞悬液分别用移液器接种至单独的100毫米培养皿中。

将培养板放入细胞培养箱中孵育。20至30天后每隔一天更换一次培养基。应出现形似胚胎干细胞集落的克隆。

在室温下，将1毫升基底膜基质溶液加入六个6孔板的每个孔中，孵育30分钟，用于iPSC扩增。同时，在体视显微镜下观察含有iPSC集落的培养板，用20微升移液枪头刮取单个集落进行分离。将每个集落转移至96孔板的一个孔中，孔内预先加入20微升M-T-E-S-R培养基。

转移克隆后，向每个孔中加入 200 µL M-T-E-S-R 培养基，并用移液器吹打数次以打散克隆。从六孔板中移除基底膜基质溶液后，将单个克隆的细胞转移至各孔，然后加入 2 mL M-T-E-S-R 培养基，在细胞培养箱中孵育细胞，并每隔一天更换一次培养基。采用无饲养层、无血清培养基培养，由人外周 T 细胞生成诱导多能干细胞（ipsc）。免疫荧光染色显示，细胞表达典型的多能性标志物，包括 Nanog、TFC3（即 nano T three four）、SSEA-4、TRA-1-60 和 TRA-1-81。

在这些衍生的IPSE细胞系中进行此操作时，必须注意执行所有步骤，并充分考虑所有重要的无菌和生物安全事项。