结肠干细胞突变定量

该程序的总体目标是量化结肠干细胞中葡萄糖六磷酸脱氢酶或 G 六 PD 基因的表型体细胞突变。在用推定的遗传毒性药物处理动物后，首先用药物处理动物，等待适当的时间，让携带 G six PD 突变的干细胞的后代完全填充隐窝，牺牲动物，去除结肠，将其形成瑞士卷，并将组织冷冻在液氮中。第二步是使用低温恒温器在结肠载玻片上制备 7 微米厚的冷冻切片。

将组织加热到 37 摄氏度，然后在组织切片周围构建每个组织染色的孔。最后一步是将组织切片与 G six PD 染色混合物孵育，然后在光学显微镜下用 G six PD 活性染色蓝色的细胞分析切片，而具有表型突变的细胞则呈白色。最终，突变 crips 的定量用于确定突变频率。

该技术测量干细胞中葡萄糖六磷酸脱氢酶体细胞突变，这是结肠癌发生的关键细胞群。通过识别体细胞干细胞突变，可以将突变频率与治疗动物的结肠癌事件相关联。虽然这种方法可以提供对结肠中干细胞突变的见解，但它也可以应用于其他模式生物或器官系统。

如果可以确定干细胞生态位，通常不熟悉这种方法的个体将难以制备 MBT 溶液。增溶。MBT 解决方案需要仔细注意详细说明。在 2 毫升 pH 7.4 磷酸盐缓冲液中开始制备组织学染色溶液至 35 毫升最佳切割温度，或在 50 毫升试管中加入 OCT 培养基，并使用 pH 试纸剧烈摇动以混合。

确认溶液的 pH 值约为 7.4。接下来，在葡萄糖六磷酸盐和一种 DP 和氯化镁溶液中，如文本方案所示溶解在磷酸盐缓冲液中，并再次确认溶液的 pH 值保持约为 7.4。加入 M-M-P-M-S 溶液并剧烈混合。

这应该会产生透明的深红色匀浆，用箔纸包裹溶液，以尽量减少暴露在光线下。如果溶液变得浑浊，则应在油浴加热时丢弃。另外，通过将 0.4 毫升二甲基甲酰胺、0.4 毫升无水乙醇和 MBT 混合在带有 O 形圈盖的 2 毫升试管中，制备 5 毫摩尔硝基蓝到特拉唑发烟硫酸或 MBT 溶液，松散地密封试管并在油浴中剧烈沸腾，直到 MBT 溶解。

接下来，让 MBT 溶液冷却至室温，然后将其添加到 OCT 反应混合物中。随着时间的推移，溶液的颜色可能会从最初的橙色红色变为深红色或紫色。按照文本方案中的指示处理动物并准备冷冻切片后，使用两个用硅脂粘合在一起的钢垫圈构建组织染色孔，将香水安装到垫圈的底部，并切出将放置溶液的中心。

战前，将冷冻的组织在潮湿的 37 摄氏度房间中滑行 10 分钟。接下来，将孔放在载玻片上，将先前制备的 G six PD 染色混合物中约半毫升的组织切片包围到每个组织切片孔中，并孵育 45 至 50 分钟。从温暖的房间中取出载玻片，并小心地从载玻片上取下不锈钢孔。

将玻片放在长边上，沥干反应混合物，然后洗涤 30 至 60 分钟，加入 100 毫摩尔磷酸盐缓冲液。要去除 G six PD 染色液的最终痕迹，请冲洗玻片和去离子水 5 至 10 分钟，以去除残留的磷酸盐缓冲液。最后，将荧光凝胶滴加到载玻片上密封组织，并干燥 30 分钟，以获取图像以供日后分析。

将载玻片放在光学显微镜上并调整至四倍 DX 放大倍数。然后用 5.0 MP 相机拍摄染色组织切片的照片，以估计检查的隐窝总数。对于每个鼠标，从表面积最小的级别中选择一个部分，并以 10 倍放大倍率对其进行成像。

数一数突变瘸子的数量。根据以下标准，整个地穴没有蓝色。地下室的外部结构完好无损。

在相邻的 7 微米切片上观察到突变体，两名观察者将同一隐窝识别为突变体。直观地计算此部分中的隐窝数量，并乘以每个冒号筛选的级别数。在用 DNA 损伤剂 azoxymethane 处理的小鼠中观察到的突变 Crips 的例子可以在左侧看到突变隐窝的垂直或自上而下的视图。

虽然右侧是水平视图或侧视图，但要使 crypt 被声明为突变，crypt 中的所有单元格都必须保留。带有少量白色的白色隐窝是由于杯状细胞产生粘液。突变频率的计算方法是观察到的突变体数除以未筛选突变体的隐窝总数。

在对照小鼠的结肠中观察到 Crips，代表突变频率小于 10 乘以 10 到负五分之一，而嘧基甲烷处理的小鼠显示干细胞突变频率为 4.44 乘以 10 到负 4 遵循此程序。可以进行其他方法，例如对葡萄糖 x 磷酸脱氢酶突变类型的基因分析，以回答其他问题，例如化学试剂如何错误编码为突变。观看此视频后，您应该对如何测量用潜在致突变和致癌化合物处理的小鼠的体细胞干细胞突变有很好的了解。