从小鼠脾隔离和扩大不变的自然杀伤T细胞的优化方法

该程序的总体目标是在从小鼠脾脏收获的变体自然杀伤 T 或 INKT 细胞中扩增。这是通过首先分离脾单核细胞，然后通过磁性细胞分离富集 CD 5 阳性淋巴细胞群来实现的。然后通过荧光激活细胞分选进一步分离脾脏 INKT 细胞组分。

在最后一步中，将分选的 INKT 细胞固定在体外扩增。最终，扩增的 INKT 细胞的细胞因子谱可以通过 Eliza 进行评估。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为 INKT 细胞的纯化和扩增需要结合不同的技术来执行。

这个程序将是我实验室的研究生。收获脾脏后，将组织转移到 70 微米的尼龙过滤器中，然后使用 2 毫升注射器柱塞通过过滤器轻轻地将脾脏捣碎到 50 毫升锥形管中，并用 5 毫升 PBS 清洗过滤器。然后将 3 毫升煤包添加到 15 毫升管中，并将密度梯度与 5 毫升细胞悬浮液叠加。

通过离心分离细胞，并将接口转移到新的 15 ml 试管中。然后在 10 毫升冷 PBS 中洗涤细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升传真缓冲液中，以富集 CD 五个阳性脾淋巴细胞。用更多的传真缓冲液将细胞稀释度调整为每 90 μL 10 至第 7 个细胞的 1 倍，并向细胞中加入 10 μL 抗 CD 5 微珠。

在 4 摄氏度下 15 分钟后，用 4 毫升传真缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于 500 微升新鲜传真缓冲液中。根据制造商的建议，通过磁性细胞分离分离 CD 五个阳性细胞。然后在室温下将富集的 CD 5 阳性淋巴细胞以 10 倍稀释至每 20 微升含有抗 CD 16、CD 32 和 PE 偶联的 αgal 空气 CD 1D 四聚体的 6 个细胞的 inax 缓冲液中，30 分钟后在黑暗中，将细胞与目标抗体在 4 摄氏度下再孵育 30 分钟。

然后在新鲜的传真缓冲液中洗涤细胞，并用 10 微升 20 微摩尔 DPI 工作溶液每 1 乘以 10 对 6 个细胞进行 5 分钟染色。在室温下，现在在流式细胞仪上获得大约 1 倍 10 到第 4 个富集 CD 的 5 个阳性淋巴细胞事件，以电子方式门控低细胞的前向散射，以排除细胞双峰和聚集体。在前向散射中，以低种群选出 DAPI 阳性 CD、8 个阳性 CD 19 阳性细胞，并使用侧向散射和前向散射区域图。

要电子选择淋巴细胞，通过 CD 三个 ε 绘制 α gal SER CD 1D 四聚体，并如图所示电子 ga α gal ser CD 1D 四聚体阳性 CD 三个 ε 阳性 INKT 细胞。然后获得不超过 2 乘以 10 至第五个 CD 的 5 个阳性富集淋巴细胞，确定富集细胞部分中存在的 α gal SER、CD 1D 四聚体阳性 CD 三个 ε 阳性 INKT 细胞的百分比。使用这种门低分选，α alser CD 1D 四聚体阳性 CD 三个 ε 阳性 INKT 细胞放入含有 1 毫升胎牛血清的传真管中。

用 10 毫升 RPMI 1640 培养基从传真管侧面冲洗分离的 NKT 细胞。然后离心细胞，将沉淀重悬于 1 mL RPMI 1640 中，并使用 40 μL 等分试样的细胞来评估分选细胞的纯度。使用相同的门控策略。

至于设置分选参数以扩增 INKT 细胞，将细胞离心并按每毫升 5 倍 10 至第 5 个细胞重悬于补充有 IL、2、IL、12 和抗 CD 28 的 RPMI 1640 完全培养基中。然后将细胞以每孔 10 至 5 个 INKT 细胞的速度接种在 96 孔平底抗 CD 3 ε包被板中，并在 37 摄氏度下在细胞培养箱中孵育。两天后，将细胞转移到新鲜的未包被的平底 96 孔板中，在完全 RPMI 1640 中静息条件下培养。

培养基，再孵育 2 天。分选后第四天，轻轻吸取每个孔中的上清液以去除细胞并将它们合并在 15 毫升锥形管中。离心后，以每毫升 10 至 5 个细胞的 5 倍重新悬浮上颚。

在补充有 IL 7 的 RPMI 16 完全培养基中，每孔接种 1 次 10 至第五个细胞。在新的平底 96 孔板中，四天后将细胞放回培养箱中，将它们拉入新的 15 毫升锥形管中进行离心。将沉淀重悬于含有可溶性抗 CD 28 的完全 RPMI 1640 培养基中，并将细胞接种到涂有抗 CD 三个 ε 的 96 孔平底板上，一次乘以每孔 10 个第五个细胞，然后将细胞放回培养箱中再放置 3 天、4 天、11 至 18 天。

重复 IL 7 抗 CD 28 和抗 CD 3 ε 治疗，如刚刚在第 19 天所示。将细胞转移到新的 15 ml 锥形管中。将它们旋转并重悬沉淀物，以每毫升 5 倍 10 至第 5 个细胞的速度在完全 RPMI 1640.Medium 中。

然后将细胞以每孔 10 到 5 个细胞的速度一次接种在平底 96 孔板中，并让细胞在细胞培养箱中静置两天。在 IL 2、IL 12 和可溶性抗 CD 28 存在下，用板结合的抗 CD 3 ε刺激分选的 INKT 细胞，导致培养两天后 INKT 数增加约三倍。在 IL 7 存在下，INKT 细胞的后续扩增导致培养第 4 天存在的 INKT 细胞数量增加 3 到 4 倍。

值得注意的是，重复这些培养条件可以在两轮扩增后平均产生 7 乘以 10 到第七个 INKT 细胞，而在不同日期培养基的变化之间没有任何可见的细胞损失，导致在 18 天内扩增至少 70 倍。用板结合的重组鼠激活的进一步扩增的 INKT 细胞。在刺激后 48 小时，载有 α alser 的 CD 1D 产生 IL 2、IL 4、IFN γ、TNF α 和 IL 6，表明 INKT 细胞在扩增后保留产生 TH 1 和 TH 2 细胞因子的能力。

在尝试此程序时，重要的是要记住，在流式细胞术中，用载有 α 神经酰胺的 cdre 对 INKT 细胞进行正确染色对于识别 INKT 细胞至关重要。确定。