Name: 从小鼠脾隔离和扩大不变的自然杀伤T细胞的优化方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学习从小鼠脾脏分离和扩增不变自然杀伤T细胞（iNKT）的优化方法。本方案采用磁珠分选和流式细胞术，实现高效细胞富集与体外扩增，为免疫学研究提供可靠技术支撑。

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D.E. 和 M.B.D. 是根特大学一个多学科研究平台（MRP）以及炎症性疾病中未折叠蛋白根特研究组（GROUP-ID）联盟的成员。

本研究使用成年（6-8周龄）雌性C57Bl/6小鼠。小鼠的饲养和繁殖均依照根特大学动物实验中心的指南进行。所有动物实验程序均经机构动物护理与伦理委员会批准。
1. 小鼠脾脏单个核细胞（MNCs）的制备
<ol>
	<li>通过颈椎脱位处死小鼠。</li>
	<li>将小鼠背部朝下放置于解剖板上，并用镊子固定后肢和前肢。</li>
	<li>用70%（体积/体积）乙醇/H2O对皮肤表面进行消毒。</li>
	<li>沿腹部中线切开皮肤至胸部，使用无菌外科器械暴露脾脏。</li>
	<li>去除周围脂肪组织后，将脾脏放入含有1 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的24孔板中，置于室温。</li>
	<li>使用无菌手术刀解剖脾脏，并将组织块转移至置于50 ml离心管上的70 µm尼龙滤膜中。</li>
	<li>用2 ml注射器活塞轻轻研磨脾脏组织，使其通过细胞筛滤器，并用5 ml 1×PBS冲洗。</li>
	<li>在15 ml离心管中加入3 ml Ficoll-Paque，然后将5 ml细胞悬液缓慢铺于密度梯度介质上方。</li>
	<li>在室温下以400 × g离心20分钟，不启用刹车。</li>
	<li>将界面层转移至新的15 ml离心管中，加入10 ml冷的1×PBS，于4 °C以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于2 ml含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的1×PBS（FACS缓冲液）中。取10 µl细胞悬液转移至小离心管，与10 µl&#160;0.4%</li>
</ol>
2. 小鼠iNKT细胞的富集、检测与纯化
<ol>
	<li>小鼠脾脏 CD5阳性（CD5+淋巴细胞
	<ol>
		<li>（可选）染色 105 细胞与FITC标记的抗CD5抗体（4 µl，1:30稀释/106 细胞）在4 °C避光孵育30分钟，用200 µl FACS缓冲液洗涤，并重悬于500 µl FACS缓冲液中。用1× PBS配制20 µM的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）工作液，取1 µl加入105 在FACS缓冲液中孵育细胞，室温下孵育5分钟。采集104 流式细胞仪上的预富集细胞。
		<ol>
			<li>使用 FCS-H 和 FCS-W，对 FSC-W 进行电子门控lo 细胞以排除双细胞和聚集体（图1A）。然后通过电子门控去除DAPI+ FSC-W 中的（死亡）细胞lo 种群（图1B），并使用SSC-A和FSC-A通过细胞大小对淋巴细胞群体进行电子选群（图1C).</li>
			<li>使用淋巴细胞门内的细胞，绘制SSC-A与CD5的散点图，并对CD5进行电子门控+ 如图所示的淋巴细胞 图1D在流式细胞仪上获取剩余的预富集样品。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>调整细胞数量至107 每90 µl FACS缓冲液中加入10 µl抗CD5微珠。</li>
		<li>4 ºC 孵育 15 分钟，用 4 ml FACS 缓冲液洗涤一次，重悬于 500 µl 冷 FACS 缓冲液中。富集 CD5+ 根据制造商的建议，使用磁性细胞分离（MACS）柱分离淋巴细胞。</li>
		<li>（可选）染色 105 CD5-FITC抗体（4 µl，1:30稀释/106 细胞）以及DAPI，如2.1.1节所述。采集104 在流式细胞仪上检测富集的淋巴细胞，并验证2.1.1步骤中设置的电子门是否选中CD5+ 富集细胞组分中的淋巴细胞。采集105 使用流式细胞仪检测细胞，并分析CD5阳性细胞的百分比+ 如图所示，富集组分中存在的淋巴细胞 图1E-H.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过流式细胞术检测和分离小鼠 iNKT 细胞
	<ol>
		<li>重悬富集的CD5+ 浓度约为10的淋巴细胞6 每20 µl FACS缓冲液中的细胞数，缓冲液中含抗CD16/CD32（4 µl，1:50稀释/10）6 细胞）和 PE 标记的 αGalCer/CD1d 四聚体（1 µg/106 细胞）。</li>
		<li>室温避光孵育30分钟。</li>
		<li>稀释小鼠单克隆抗体（mAbs）抗-CD3ε V500（4 µl，1:20 稀释/106 细胞）、抗CD19 e450（4 µl，1:50稀释/106 细胞）和抗CD8α e450（每10 µl使用4 µl，1:50稀释）6 细胞）加入FACS缓冲液中，然后加入CD5+ 淋巴细胞，并在4 °C避光孵育30分钟。</li>
		<li>用 1 ml FACS 缓冲液重悬细胞，于 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，然后重悬于 4 ml FACS 缓冲液中，终浓度为 107 细胞/毫升</li>
		<li>通过30 µm细胞滤网过滤细胞，并将细胞置于冰上。</li>
		<li>根据制造商的建议对流式细胞仪进行细胞分选校准 14,15. 
		注意：流式细胞仪用于细胞分选前的校准需要经过培训，应由经验丰富的操作人员或受过训练的技术人员完成。</li>
		<li>每10 µl中加入10 µl浓度为20 µM的DAPI工作液6 细胞，并在室温下孵育5分钟。采集约104 富集的 CD5+ 在流式细胞仪上对淋巴细胞进行分析。在电子门控中选择FSC-Wlo 细胞以排除双细胞和细胞聚集体（图 2A）。然后通过电子门控去除DAPI+ CD8+CD19+ 细胞（倾卸通道）在FSC-W内lo 种群（图2B），并使用 SSC-A 和 FCS-A 通过电子方式选择淋巴细胞（图2C）如 2.1.1.1 所述。
		<ol>
			<li>将αGalCer/CD1d四聚体按CD3ε绘图，并对αGalCer/CD1d四聚体进行电子门控+CD3ε+ 如图所示的iNKT细胞&#160; 图2D. 获取不超过 2 x 105 CD5+ 富集淋巴细胞以确定αGalCer/CD1d四聚体阳性细胞百分比+CD3ε+ 富集细胞组分中存在的iNKT细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用2.2.7中构建的电子门，对αGalCer/CD1d四聚体进行FACS分选+CD3ε+ 使用70 µm喷嘴，在70 psi压力下通过流式细胞仪分选iNKT细胞，流速设为“1.5”。将分选后的iNKT细胞收集至含有1 ml 100% FCS的FACS管中。随后用10 ml RPMI 1640培养基冲洗FACS管壁上的细胞，于4 °C条件下以300 × g离心10分钟。</li>
		<li>将分选的iNKT细胞重悬于1 ml RPMI 1640培养基中，取40 µl上流式细胞仪检测分选iNKT细胞的纯度。选择FSC-Wlo DAPI- 淋巴细胞，如2.2.7节所述。图 2E-G以及电子门控αGalCer/CD1d四聚体+CD3ε+ 如图所示的iNKT细胞 图 2H.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠iNKT细胞的培养与扩增
第0天
<ol>
	<li>用纯化的抗CD3ε抗体（3 µg/ml）在室温下对平底96孔板进行包被，每孔加入1小时。用200 µl 1x PBS洗涤两次，再用200 µl完全RPMI 1640培养基（含10% vol/vol FCS、100 U/ml青霉素-链霉素、5.5 µM β-巯基乙醇）洗涤一次。</li>
	<li>使用0.4%台盼蓝染色法按1.11步骤计数活的分选后的iNKT细胞数量&#160;，在4 °C下以300 × g离心10分钟，然后重悬于含重组小鼠IL-2（10 ng/ml）、重组小鼠IL-12（1 ng/ml）和可溶性抗小鼠CD28抗体（5 µg/ml）的完全RPMI 1640培养基中，细胞浓度为5 × 105 个细胞/ml。将分选后的iNKT细胞以每孔105个细胞的密度接种至已包被抗CD3ε抗体的孔板中，在37 °C、CO2培养箱中培养2天。</li>
</ol>
第2天&#160;
<ol start="3">
	<li>将细胞转移至新的未包被的平底96孔板中，在37 °C、CO2培养箱中，用完全RPMI 1640培养基静置培养2天。</li>
</ol>
第4天&#160;
<ol start="4">
	<li>通过轻柔吹打将细胞从培养板上吹下，并将细胞转移至新的15 ml离心管中。在4 °C下以300 × g离心10分钟，用含重组小鼠IL-7（5 ng/ml）的完全RPMI 1640培养基重悬细胞至浓度为5 × 105 cells/ml&#160;，然后将105个细胞/孔接种于平底96孔板中，在37 °C、含CO2的培养箱中培养4天。</li>
</ol>
第8天
<ol start="5">
	<li>将细胞收集至新的离心管中，在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，然后用含可溶性抗 CD28（5 µg/ml）的完全 RPMI 1640 培养基重悬，调整细胞密度为 5 × 105 个细胞/ml。</li>
	<li>用纯化的抗 CD3ε 抗体（每孔 3 µg/ml）包被平底 96 孔板，洗涤步骤同 3.1。将 105 个细胞/孔接种至抗 CD3ε 包被的孔板中，于 CO2 培养箱中 37 °C 培养至第 11 天。</li>
</ol>
第11至18天
<ol start="7">
	<li>重复步骤 3.4 至 3.6。</li>
</ol>
第19-20天
<ol start="8">
	<li>将细胞转移至新的15 ml离心管中，在300 × g条件下离心，然后用完全RPMI 1640培养基重悬细胞，调整细胞密度为5 × 105 个细胞/ml。</li>
	<li>将细胞以每孔105个细胞的密度接种于平底96孔板中，置于37 °C、CO2培养箱中静置培养2天，待实验时使用。</li>
</ol>
4. 使用CD1d包被板法测定小鼠iNKT细胞的细胞因子产生
<ol>
	<li>在96孔平底板的每孔中加入100 µl重组小鼠CD1d（10 µg/ml溶于1×PBS），37 °C孵育1小时。</li>
	<li>用 200 µl 1×PBS 洗涤四次，每孔加入 200 µl 含 2% FCS 的 1×PBS（封闭液），37 °C 孵育 2 小时。</li>
	<li>除去封闭液，每孔加入 200 µl αGalCer（5 ng/µl），37 °C 孵育 16 小时。[αGalCer 溶液的配制：将溶于含 96 mg/ml 载体的 55 µg αGalCer 中加入 1,085 µl 1x PBS]&#160;蔗糖，10 mg/ml 脱氧胆酸钠和 5 mg/ml Tween 20</li>
	<li>孵育后，弃去αGalCer溶液，先用200 µl 1× PBS洗涤2次，再用200 µl完全RPMI 1640培养基洗涤1次。</li>
	<li>收集 体外 第21天扩增的iNKT细胞，于4 °C下以300 × g离心10分钟，弃上清后重悬于完全RPMI 1640培养基中，调整细胞浓度至0.5 × 10⁶/mL6 细胞/毫升</li>
	<li>每孔加入 200 µl iNKT 细胞重悬液，于 37 °C 的 CO₂ 培养箱中孵育 72 小时2 培养箱</li>
	<li>收集上清液，根据试剂盒说明书，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测目标细胞因子。</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells%3A+development%2C+specificity%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li>
<li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immuno%22%5BJournal%5D)">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li>
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<li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li>
<li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li>
<li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li>
<li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection%2C+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li>
<li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li>
<li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+%27real+time%27%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li>
<li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li>
</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

当前方案中的关键步骤包括CD5的分离及后续富集+ 淋巴细胞（第1节） &amp;#38; 2）、FACS 分选（第 3 节）以及 iNKT 细胞的初始铺板（第 4 节）。在第 1 节所执行的步骤中，需注意将脾细胞悬液小心地铺在密度梯度介质上方，以便离心后形成清晰的细胞界面。随后进行 CD5 富集+ 通过磁性细胞分离法富集淋巴细胞（第2节）可最大限度减少染色及FACS分选iNKT细胞（第3节）所需的试剂和时间，有助于提高分选后iNKT细胞的得率。最后，接种细胞数量应不超过105 培养的前2天，每孔接种的iNKT细胞数量应适中（第4节），因为接种密度过高可能导致细胞凋亡。
在修改和/或优化本实验方案时，需考虑若干重要因素：首先，所用动物的年龄至关重要。动物若年龄过大，或存在伴随感染，可能会影响从脾脏中分离、鉴别和通过流式细胞术分选获得足够数量细胞的能力。其次，在使用αGalCer/CD1d四聚体进行染色时，应保持细胞重悬于PBS缓冲液中的体积较小，因为过大的体积会稀释αGalCer/CD1d四聚体的染色效率，进而降低流式...

小鼠不变的自然杀伤T（iNKT）细胞是一类独特的先天性T淋巴细胞亚群，其在胸腺中由表达CD1d的皮质胸腺细胞所选择1,2。iNKT细胞表达一种T细胞受体（TCR），该受体由不变的Vα14-Jα18 TCR链与Vβ8、Vβ7或Vβ2 TCR链之一配对组成3，能够识别在CD1d分子背景下呈现的内源性及外源性脂质抗原。例如，小鼠iNKT细胞可识别一种名为异球三己糖神经酰胺（iGb3）的内源性脂质抗原并被其激活4，也可被海洋海绵中分离出的糖脂α-半乳糖神经酰胺（αGalCer）激活5,6。依赖TCR的iNKT细胞激活可促进适应性免疫应答的启动，因此研究表明iNKT细胞在多种病理过程的改善或发展中发挥功能性作用，包括风湿性疾病7和癌症8。目前，合成的iNKT细胞配体正成为有前景的新型疫苗佐剂，可能具备调控多种免疫病理状态的能力。
已有研究表明，iNKT细胞可以被诱导产生 体外 然而，在从小鼠组织分离后，许多研究采用初级抗原呈递细胞（APCs）和/或细胞系 9Vα14 TCR 转基因（Tg）小鼠 10或胸腺瘤用于生成iNKT细胞来源的杂交瘤 11,12此外，大量小鼠的使用、高剂量的试剂（如负载αGalCer的CD1d二聚体）以及漫长的培养时间，使得某些已发表的实验方案在伦理和经济上缺乏吸引力。 9,13.
在本报告中，我们描述了一种改进的用于分离和纯化特定细胞类型的实验方法。该方法结合了机械解离与酶消化技术，以提高目标细胞的得率和活力。首先，将组织样本置于预冷的缓冲液中进行清洗，去除血液和碎片。随后，使用精细剪刀将组织剪切成约1 mm³的小块，并加入含有胶原酶Ⅳ和DNA酶Ⅰ的消化液，在37 °C下振荡孵育30–45分钟。每10分钟轻柔吹打一次以促进组织解离。消化完成后，加入含10% FBS的完全培养基终止反应，并通过70 μm细胞筛过滤获取单细胞悬液。收集滤液后，以300 × g离心5分钟，弃上清。细胞沉淀用红细胞裂解液重悬以去除红细胞污染，冰上孵育5分钟，随后再次离心并用PBS洗涤两次。最终细胞沉淀重悬于适当的培养基或缓冲液中，用于后续流式细胞分析、培养或冻存。本方法适用于多种实体组织，具有操作简便、重复性好、细胞活性高等优点。 

关键词：细胞分离，酶消化，机械解离，单细胞悬液，胶原酶Ⅳ，DNA酶Ⅰ，红细胞裂解 体外 从小鼠脾脏扩增iNKT细胞。更具体而言，本方案描述了一种从小鼠脾脏富集iNKT细胞的方法，该方法可减少荧光激活细胞分选（FACS）所需的实验小鼠、试剂和时间，并提出了一种优化的策略用于扩增经分选的脾脏iNKT细胞 体外

<table><tbody><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>纯化的抗小鼠 CD3e（145-2C11）</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>纯化的抗小鼠 CD28（37.51）</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450 标记的抗小鼠 CD19（eBio1D3）</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450 标记的抗小鼠 CD8&amp;alpha;（53-6.7）</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠 CD5（53-7.3）</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>V500 标记的抗小鼠 CD3&amp;epsilon;（500A2）</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD5（Ly-1）磁珠</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>纯化的抗小鼠 CD16/32（2.4G2）</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS 柱</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝，0.4%（wt/vol）</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;]</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔 F 型底板</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 分离器</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS 柱</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>水套式 CO2 培养箱</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖工具包</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种从小鼠脾脏中分离与扩增不变的自然杀伤t细胞的优化方法

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

快速分泌细胞因子的能力是不变的自然杀伤T（iNKT）细胞谱系在受到刺激时的一种功能性特征。因此，iNKT细胞被表征为一类能够激活并调控适应性免疫应答的先天性T细胞群体。小鼠iNKT细胞培养与扩增技术的不断改进，有助于深入研究iNKT细胞生物学 体外 和 体内 模型系统。本文描述了一种优化的小鼠脾源性 iNKT 细胞分离与扩增实验方案。
从 C57Bl/6 小鼠中取出脾脏，进行解剖和过滤，所得细胞悬液铺于密度梯度介质上。经离心后，收集脾脏单个核细胞（MNCs），并分选其中 CD5 阳性（CD5+) 使用磁珠富集淋巴细胞。CD5亚群中的iNKT细胞+ 随后用负载αGalCer的CD1d四聚体对组分进行染色，并通过荧光激活细胞分选（FACS）进行纯化。分选后的iNKT细胞随后进行初始培养 体外 使用重组小鼠细胞因子与板结合的T细胞受体（TCR）刺激物联合处理，随后在小鼠重组IL-7存在条件下扩增。采用该技术，可获得约108 iNKT 细胞可在培养 18–20 天内获得，之后可用于功能检测 体外，或用于 体内 小鼠中的转移实验。

采用密度梯度法分离脾脏单个核细胞约需1小时，且无需使用裂解红细胞（RBCs）的试剂。该方法可获得较高产量的活细胞，并在组织过滤过程中去除产生的碎片。通常，脾淋巴细胞群中iNKT细胞的频率占总T淋巴细胞的1%至5%，但该比例可能因实验动物的年龄、性别和健康状况而有所差异。从3只小鼠合并的脾脏中可获得约106个iNKT细胞，且6至8周龄小鼠的脾脏中iNKT细胞的产量最高。
使用小鼠抗CD5磁珠可显著富集脾脏单个核细胞（MNC）组分中的iNKT细胞，除少量表达CD5抗原的B淋巴细胞外，采用该方法分离获得的绝大多数细胞均为CD5+淋巴细胞。例如，经CD5富集后获得的MNC中约有5-8%为CD5阴性细胞（图1H）。在进行iNKT细胞FACS分选时，联合使用αGalCer/CD1d四聚体与抗小鼠CD3ε抗体，可获得高于98%的iNKT细胞纯度；然而，应使用针对脾脏B细胞和CD8 T细胞的FACS排弃通道，以去除分选过程中可能存在的“黏连”淋巴细胞群体。此外，在CD5富集步骤中可能形成的双联体细胞也应设门排除。采用此F...

本文介绍了一种经过优化的实验方案，可用于从小鼠脾脏中大量生成小鼠不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）。该方案详细阐述了富集、分离和扩增脾脏iNKT细胞的方法。 体外 使用有限数量的动物和试剂。

一种从小鼠脾脏中分离与扩增不变的自然杀伤T细胞的优化方法

快速分泌细胞因子是不变的自然杀伤T（iNKT）细胞谱系在受到刺激时的一种功能特征。iNKT细胞……

本实验的总体目标是扩增从小鼠脾脏中分离得到的不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）。首先分离脾脏单个核细胞，然后通过磁性细胞分选法富集CD5阳性淋巴细胞群体，再通过荧光激活细胞分选法进一步分离脾脏iNKT细胞组分。最后一步中，分选得到的 iNKT 细胞将进行体外扩增培养。最终，可通过 ELISA 检测扩增后 iNKT 细胞的细胞因子谱。通常，初次操作该方法的研究者会遇到困难，因为 iNKT 细胞的纯化与扩增需要结合多种实验技术来完成。该操作将由我实验室的一名研究生完成。取出脾脏后，将其转移至70微米尼龙滤膜上，然后用一支2毫升注射器活塞轻轻将脾脏组织压过滤膜，进入一个50毫升离心管中，并用5毫升PBS冲洗滤膜。随后，在一个15毫升离心管中加入3毫升淋巴细胞分离液，并将5毫升细胞悬液缓慢叠加于密度梯度之上。通过离心分离细胞，并将界面层转移至新的15毫升离心管中。随后用10毫升预冷的PBS洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于2毫升fax缓冲液中，以富集CD5阳性脾淋巴细胞。用fax缓冲液将细胞浓度调整至每90微升含1×10⁷个细胞，然后向细胞中加入10微升抗CD5磁珠。在 4 摄氏度下孵育 15 分钟后，用 4 毫升 fax 缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于 500 微升新鲜 fax 缓冲液中。根据制造商的建议，通过磁性细胞分选法分离 CD5 阳性细胞。然后，在含有抗 CD16、CD32 和 PE 偶联的 α-GalSair CD1d 四聚体的 fax 缓冲液中，于室温避光条件下将富集的 CD5 阳性淋巴细胞稀释至每 20 微升含 1 × 10⁶ 个细胞。30 分钟后，在 4 摄氏度避光条件下，再与目标抗体孵育 30 分钟。然后用新鲜的fax缓冲液洗涤细胞，并加入10 µL浓度为20 µmol/L的工作液DPI，作用于1×10⁶个细胞，孵育5分钟。在室温下，通过流式细胞仪获取约1×10⁴个富集的CD5阳性淋巴细胞事件，电子门控设定为前向散射（FSC）低信号的细胞群体，以排除细胞双联体和聚集体。在前向散射低信号的细胞群中，进一步设门排除DAPI阳性、CD8阳性及CD19阳性细胞，并使用侧向散射（SSC）与前向散射（FSC）的面积图进行分析。通过CD3ε与α-Gal SER CD1d四聚体对淋巴细胞进行电子分选，并如图所示圈选α-Gal SER CD1d四聚体阳性、CD3ε阳性的iNKT细胞。随后，在获取不超过2×10⁵个CD5阳性富集的淋巴细胞后，确定该富集细胞组分中α-Gal SER CD1d四聚体阳性、CD3ε阳性iNKT细胞所占的百分比。使用低速分选模式，将α-Gal SER CD1d四聚体阳性、CD3ε阳性iNKT细胞分选至含有1毫升胎牛血清的离心管中，完成分选过程。用 10 毫升 RPMI 1640 培养基冲洗离心管壁上的分离 NKT 细胞。然后离心沉淀细胞，将细胞沉淀重悬于 1 毫升 RPMI 1640 培养基中，并取 40 微升细胞悬液用于评估分选细胞的纯度，采用相同的设门策略。关于设置分选参数以扩增 INKT 细胞，首先离心收集细胞，并将分离的细胞以每毫升含 5 × 10⁵ 个细胞的密度重悬于添加了 IL-2、IL-12 和抗 CD28 抗体的完全 RPMI 1640 培养基中。随后，将细胞以每孔 1 × 10⁵ 个 INKT 细胞的密度接种至经抗 CD3ε 包被的 96 孔平底板中，在细胞培养箱中 37°C 条件下孵育。两天后，将细胞转移至新的未包被的 96 孔平底板中，在完全 RPMI 1640 培养基中于静息条件下继续培养。继续培养两天。分选后的第四天，轻轻吹打每孔的上清液以悬浮细胞，并将细胞收集至15毫升锥形管中。离心后，将细胞重悬于浓度为5 × 10⁵ 个细胞/毫升的培养基中。在补充了IL-7的完全RPMI 1640培养基中，以每孔1×10⁵个细胞的密度接种。在新的平底96孔板中培养4天后，将细胞转移至新的15毫升锥形管中进行离心。将细胞沉淀重悬于含有可溶性抗CD28抗体的完全RPMI 1640培养基中，并接种至预先包被抗CD3ε抗体的平底96孔板中，每孔接种1×10⁵个细胞，然后将细胞放回培养箱继续培养3至4天，即第11至18天。在第19天重复进行如上所述的IL-7、抗CD28和抗CD3ε处理。将细胞转移至新的15毫升锥形管中。离心沉淀细胞，并将细胞沉淀重悬于完全RPMI 1640培养基中，浓度为每毫升5 × 10⁵个细胞。然后将细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于平底96孔板中，并将细胞置于细胞培养孵育箱中静置培养两天。在存在IL-2、IL-12和可溶性抗CD28的情况下，用板结合的抗CD3ε刺激分选后的iNKT细胞，可在培养两天后使iNKT细胞数量扩增约三倍。随后在IL-7存在下进一步扩增iNKT细胞，可在培养第四天时使iNKT细胞数量增加三至四倍。值得注意的是，在不同时间点更换培养基且无明显细胞损失的情况下，重复这些培养条件经过两轮扩增后，可获得平均 7 × 10⁷ 个 iNKT 细胞，即在 18 天内实现至少 70 倍的扩增。进一步扩增的 iNKT 细胞经由包被于培养板上的重组小鼠 CD1d 分子负载 α-GalCer 进行激活后，在刺激 48 小时后可产生 IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α 和 IL-6，表明扩增后的 iNKT 细胞仍保留分泌 Th1 和 Th2 型细胞因子的能力。在进行该实验操作时，必须牢记：使用负载α-半乳糖神经酰胺的CD1d四聚体对iNKT细胞进行正确染色，对于通过流式细胞术鉴定iNKT细胞至关重要。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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一种从小鼠脾脏中分离与扩增不变的自然杀伤T细胞的优化方法

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