Name: 运动性的时空制图离体准备工作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学习使用GIMM系统生成肠道运动时空图谱的方法，通过豚鼠离体肠道组织研究肠壁运动的复杂模式。该技术可应用于药物效应和营养物质相互作用研究。

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DMK 获得了美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）授予弗吉尼亚联邦大学的 IRACDA 项目资助（项目编号：K12GM093857）。本研究获得了美国国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDKD）资助 DK34153，受资助者为 John R. Grider。

本方案中使用的所有动物及安乐死操作均经弗吉尼亚联邦大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>配制 4 L Krebs 缓冲液（成分，单位为 mM：118 NaCl、4.75 KCl、1.19 KH2PO4、1.2 MgSO4、2.54 CaCl2、25 NaHCO3、11 葡萄糖）。称取每种固体试剂的适当质量，加入适量去离子水中，并使用涡旋振荡器混合，直至溶液澄清。</li>
	<li>随后，在加热至 37 °C 的同时，用碳合氧气体（95% O2、5% CO2）对溶液通气 30 分钟。</li>
	<li>在 37 °C（与器官浴中相同的温度）下测定溶液的 pH 值，必要时用 HCl 调节至 pH 7.4。在整个实验过程中，保持 Krebs 缓冲液持续通碳合氧气体，并维持温度为 37 °C。</li>
	<li>将蠕动泵的进液管和出液管插入缓冲液储液瓶中，开启蠕动泵，开始在整个管路和器官浴系统中进行缓冲液灌流。 
	注意：在向器官浴中加入组织或向灌流缓冲液中加入化学物质之前，可先将缓冲液泵回原始容器中，以减少实验所需的缓冲液总体积。之后应将流出的灌流管路置于一个空容器中，以防止流入和流出的缓冲液混合。</li>
	<li>校准浴槽循环仪加热系统的温度，使器官浴内的缓冲液在整个实验期间保持在 37.0 ± 0.5 °C。在步骤 2.8 将组织段放入浴槽前，至少再确认并根据需要调整一次 Krebs 缓冲液的 pH 值。</li>
</ol>
2. 组织的制备
<ol>
	<li>使用经当地动物护理与使用委员会批准的方法，通过密闭容器内吸入二氧化碳/窒息或其他安乐死方法处死豚鼠。</li>
	<li>在确认动物安乐死后，使用解剖剪沿纵轴切开腹壁，找到肠道。剪断附着于小肠的肠系膜，以暴露盲肠。 
	注意：为确认安乐死效果，需实施动物护理与使用委员会批准的二次操作，如双侧胸腔切开术。</li>
	<li>找到盲肠的远端，在盲肠连接处远端附近横断近端结肠。然后在第一次横断位置远端约 8 cm 处再次横断近端结肠。</li>
	<li>将结肠组织放入预热并通入含氧气体的克雷布斯溶液（见第1节）中，以进行进一步解剖。将结肠固定于解剖浴中，使用较小的剪刀尽可能去除肠系膜和脂肪组织。</li>
	<li>在加热的解剖托盘中，使用连接钝端导管的注射器，通过管腔轻柔灌注Krebs缓冲液，以清除所有管腔内容物（钝端导管有助于防止组织穿孔）。灌注过程中避免过度扩张组织片段。</li>
	<li>获取两根火焰抛光的玻璃管导管（直径3 mm），并将一段短的聚乙烯管（长约3 mm，直径约3 mm）套在进入组织腔的玻璃管部分。 
	注意：这将使缝线能够固定在组织和玻璃管周围，确保在将标本放入器官浴槽以及改变组织长度的过程中，缝线保持稳固而不滑脱。</li>
	<li>将一根导管插入组织标本的口端，用外科结在导管周围的短段 tubing 上绑紧缝线。轻轻尝试将导管向外拉，以确保结扎牢固。然后，对插入组织标本反口端的另一根导管进行相同操作。</li>
	<li>导管固定后，将整个装置（组织及导管）从解剖托盘转移至其中一个器官浴槽中。将装置放入浴槽时，确保口腔端朝向远离操作者的方向。</li>
	<li>接下来，通过以下两种推荐方法之一将玻璃管导管固定到器官浴槽中。 
	注意：固定玻璃管可防止组织段在实验过程中改变长度，或露出浴槽中克雷布斯缓冲液的液面。
	<ol>
		<li>选项A：使用黏土或塑料夹具将玻璃管的上部固定在塑料器官浴槽侧面的顶部。</li>
		<li>选项B：使用塑料夹将玻璃管固定在位于器官浴装置上方、用于固定摄像头的金属杆上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导管固定于浴槽后，将一段5厘米长的管路连接至每根导管的开放端。对于口腔端导管，将此管路连接至10毫升注射器，用于向近端结肠节段腔内注入缓冲液。对于肛门端导管，此段管路可用于引导腔内容物流出至收集容器（50毫升烧杯或储液器）。 等等。).</li>
	<li>使用连接在口腔端的注射器，缓慢将预温的Krebs缓冲液冲洗通过组织腔，以确保液体可顺利流过组织。当液体从肛门端导管流出时，表明流通通畅。在组织平衡30分钟期间，校准视频记录系统（方案第3节）。</li>
</ol>
3. 视频记录系统的校准
<ol>
	<li>使用软件校准相机高度位置、视频的亮度和对比度设置以及水平距离。 
	注意：腔内灌注装置的最佳设置与用于测定颗粒推进速度的设置不同13。</li>
	<li>单击相机对应的实验选项卡，然后在“文件”菜单中单击“校准”。</li>
	<li>当视频出现在“校准工作站”窗口中时，将相机高度调整至图像包含插入结肠腔内的导管末端的位置。</li>
	<li>然后，使用每个浴槽上附着的透明尺贴纸，校准图像中所见的水平距离。 
	注意：此校准对于后续软件计算管腔直径和收缩波速度至关重要。</li>
	<li>在同一“校准工作站”窗口中，设置两条红色垂直标线，使其在相机图像中的尺子上显示为相距10 mm。然后，在“光标距离”窗口中输入相应距离（10 mm），并单击“CAL”按钮。</li>
	<li>接下来，在“校准工作站”窗口中调节增益、亮度和快门滑块，以调整相机图像，使组织段在明亮背景上呈现为深色轮廓。 
	注意：图4展示了该校准过程的良好与不良示例。</li>
	<li>为正确调整图像，还需调节相机本身的对焦和光圈旋钮。</li>
	<li>校准现已完成。单击“保存”，在弹出窗口中单击“确定”，最后单击“EXIT”按钮。</li>
</ol>
4. 通用实验步骤
<ol>
	<li>完成相机校准程序和组织平衡30分钟后，为每个实验方案中的试验命名。试验名称可根据实验该阶段中灌注到组织段腔内的化合物名称、浓度以及液体体积来确定。</li>
	<li>然后，使用管夹夹闭从口后导管伸出的导管。 
	注意：这可以防止管腔液体在后续实验中从远口端流出，从而允许使用特定体积的液体注入管腔以诱发不同程度的扩张（图1).</li>
	<li>在近端结肠腔内注入约 0.7 ml Krebs 缓冲液，以提供足够的扩张，从而诱发豚鼠的推进性收缩 离体 制备 
	注意：该体积可能略有变化（0.1–0.2 ml），具体取决于完整血管段的总长度以及在器官浴中对血管段施加的牵拉程度。</li>
	<li>一旦肠段被管腔液体扩张，打开摄像机，随后记录预定时间段内的运动情况（例如，&#160;10 分钟。
	<ol>
		<li>具体而言，双击相应名称的试验以打开实验摄像视图，然后点击切换开关以 &#34;开启&#34; 调整位置以查看摄像机视野。然后，点击录制按钮开始录制（录制过程中录制按钮将保持红色），再次点击录制按钮以停止录制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在初始对照扩张试验结束时，松开或移除闭塞肛侧导管的夹子，以使组织段将扩张液体从管腔内推进排出。</li>
	<li>经过10分钟的重新平衡后，可在管腔液中加入多种营养物质、生物活性物质、药物或激动剂/拮抗剂，重复此操作以调节该肠段的推进性运动功能。例如， 短链脂肪酸或癸酸 10,18.
	<ol>
		<li>为帮助判断新的实验液体何时进入结肠节段，可在注射器接口附近留一个气泡，当新溶液灌注到结肠腔内时，通过观察气泡的移动可使操作者了解实验液体何时到达肠腔。</li>
		<li>继续通过远端导管开放进行管腔内灌注，直至气泡完全被推过灌注系统（可能需要2-3 ml灌注液）。然后，让组织段通过开放的远端导管排出液体，持续时间最长可达5分钟。 
		注意：此步骤完成后，管腔内将仅含有可忽略体积的液体，从而允许向管腔内灌注已知体积的液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用管夹重新闭合口端管腔导管（同步骤4.3），通过注射器注入与对照条件相同体积的扩张液体。记录实验期间的运动模式，以便后续分析并与对照Krebs条件进行比较（同步骤4.5）。</li>
	<li>重复本方案的第4.4–4.7节，使用不同的管腔化合物或同一管腔化合物的不同浓度。</li>
</ol>
5. 时空图谱（ST图谱）的构建
<ol>
	<li>完成实验记录后，双击特定试验的名称，打开分析窗口以构建 STmap。</li>
	<li>在视频播放区域中，调整分析窗口内的对比度和亮度滑块，使图像适合分析（深色组织轮廓位于浅色背景上；图4）。 
	注意：如果在实验开始前未正确进行相机校准，则此时图像只能在有限范围内进行调整。</li>
	<li>当图像对比度调整适当时，在视频图像窗口中设置红色的水平和垂直参考线，以划定用于分析的组织区域，并排除包含伪影的区域。同时，通过确定分析的起止时间点，选择记录中的相应时间段。
	<ol>
		<li>具体操作为：在分析软件中使用绿色的“A”按钮和黄色的“B”按钮，在视频中选择起始和结束时间点。将时间滑块移至待分析视频段的起点，然后点击绿色的“A”按钮；再将滑块移至该段终点，点击黄色的“B”按钮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接下来，点击“motor analysis”标签以打开 STmap 窗口，然后点击“stopwatch”按钮。点击秒表后，再点击视频中组织黑色轮廓内的十字光标，以开始生成 STmap。</li>
	<li>在组织轮廓内点击十字光标后，软件将生成并显示该视频区域的 STmap。 
	注意：生成时间可能需要几分钟，具体取决于所选分析视频的长度。</li>
	<li>点击“zoom”以查看放大的 STmap 图像及调节控件。
	<ol>
		<li>在新打开的窗口中点击“color”选项，将 STmap 显示为彩色而非灰度图像。同时，点击“Enable”选项，以便在图中特定像素上放置光标，并查看该特定组织区域管腔直径变化的曲线图。完成后点击“Exit”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过点击“File”菜单，选择“Export Data”，然后选择“Meta File”，可导出 STmap 用于论文、报告或在 ImageJ 中进一步分析。为 STmap 命名后，文件将以 .emf 格式保存，点击“Save”按钮完成保存。</li>
	<li>或者，可通过截屏方式保存 STmap 图像。此方法对于保存伪彩色版本的 STmap 是必要的。</li>
</ol>
6. ST图中收缩波速度的分析
<ol>
	<li>为分析收缩传播速度或收缩持续时间，首先通过任意文件转换程序将 STmap 的 .emf 文件转换为 ImageJ 可识别的 .tiff、.gif、.jpg 或 .bmp 格式。 
	注意：ImageJ 无法打开软件生成的 STmap 的 .emf 格式文件。
	<ol>
		<li>或者，可使用屏幕截图软件截取屏幕上 STmap 的图像，并将其保存为合适的文件格式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>然后在 ImageJ 中打开重新格式化的 STmap，接着通过打开 &#34;Plugins' 菜单并选择 'GIMMProcessor' 来启动 GIMMProcessor 插件。这将同时打开 'GIMMProcessor' 和 'Measurements Table' 窗口。</li>
	<li>在 ImageJ 窗口中点击“矩形选择工具”，然后通过在 STmap 右上角标尺的整个区域上点击并拖动来框选标尺。选定该区域后，点击插件中的“set calibration”按钮。最后，根据标尺上的数值，在校准对话框中输入相应的距离（mm）和时间（sec），然后点击“Done”。</li>
	<li>接下来，在 ImageJ 窗口中点击线条绘制工具。在 STmap 图像上，沿传播性收缩波前沿的斜率方向，通过点击并拖动的方式在收缩波中心绘制一条直线。或者，可通过绘制一条垂直线穿过非传播性收缩条带来测定收缩持续时间。</li>
	<li>当线条绘制完成后（每次只能绘制一条线），点击插件中的“take measurement”按钮，以获取该线条的水平距离、垂直距离和斜率读数；这些数值分别对应长度（mm）、时间（sec）和速度（mm/sec）。这些数据将显示在“Measurements Table”窗口中。</li>
	<li>在同一个 STmap 中重复多次线条绘制与分析操作，并将数据保存为 .gmd 文件。点击插件中的“Save”按钮并命名文件，然后再次点击“Save”以完成保存过程。这些数据之后可用于与其他实验数据进行比较，或用于在 STmap 上重新绘制线条。</li>
</ol>

Catamount Research and Development, Inc.（GIMM 系统的开发者）承担了本论文的出版费用。

基于所记录参数的性质，肠道运动已从多个角度被观察和描述。视频记录与时空图谱绘制已被证明是一种有价值的工具，可实现对肠道长段的整体运动和/或推进运动进行分析，同时也可对肠段特定位置的活动进行分析。视频记录与时空图谱绘制的方法可分为两类，其选择取决于所研究的肠段区域以及管腔内容物的性质。在管腔内容物较稀薄的肠段以及近端结肠（内容物呈半固态）中，通常通过管腔内注入液体（推注或持续灌注）来诱发运动活动。由此类视频记录生成的时空图谱旨在反映肠段整体的运动情况，如上所述。相比之下，在中段至远端结肠，由于内容物更为固态，活动通常通过插入粪便颗粒（环氧树脂包被的天然颗粒或人工颗粒）来启动，所生成的时空图谱则旨在反映颗粒在结肠中的推进过程，如JoVE期刊Hoffman et al. 13 的文章中所示。因此，实验设置与分析方法的选择至关重要，且取决于所使用的刺激类型及所研究的肠段区域。因此，生成与分析液体诱发性肠道运动时空图谱的关键步骤包括：1）在分离组织时正确去除肠系膜；2）记录前进行准确的图像校准；3）在ST图谱生成与分析过程中有效去除伪迹；4）合理设置分析系统；5）熟练掌握导管插入与肠段缝合的操作技巧，避免组织损伤。
尽管管腔直径的ST图在可视化和分析肠段区域的完整运动模式方面提高了能力，但该技术若与压力或肌肉收缩的功能性测量相结合使用，效果更佳。 2,15,20例如，某些肌肉收缩可能会轻微改变管腔直径，并在某些ST图上可见即， 肌源性涟漪）可能并不会真正引起肠道内容物的推进或混合 25这只有通过将该技术与其他功能测量方法相结合才能确定。此外，此类系统中许多组织制备物的性质（即， 封闭的管腔系统或通过泵系统进行恒定管腔灌注会导致ST图中出现伪影。因此，使用者必须了解其特定器官制备方式和实验条件如何在数据中引入伪影，并掌握在数据分析中避免或排除这些伪影的方法（例如， 由于在封闭管腔制备过程中组织无法排出系统内的液体，可能会导致肠系膜引起的垂直条纹或暗像素化现象。除了封闭系统外，还有多种方法可用于完整肠段的管腔灌注。其中一种方法是采用开放式系统，通过在制备物的肛端使用抬高的导管和/或单向阀来维持恒定的管腔内/反向压力。 8-10,30这使得液体在推进性收缩期间能够从制备物中排出。
由于该系统主要设计用于检测管腔直径的变化，因此那些对管腔直径影响较小的收缩或运动模式通常难以通过本方案清晰观察。由于ST图中像素明暗的变化基于管腔直径的改变，若记录中同时存在较强的收缩，则对直径变化较小的运动模式在此方法中往往难以良好呈现。如对涟漪样收缩的可视化与分析所述（图3），将视频中的分析线设置得更靠近组织壁，可缓解这一问题。该方法可减小ST图中显示的最大直径，从而使仅引起组织直径轻微变化的收缩得以被观察。解决此问题的另一种方法是调整所分析视频片段的时长，排除对管腔直径影响较大的收缩，以便更清晰地观察较小的收缩。但这可能导致一种潜在问题：即对管腔直径影响较小的运动模式，在ST图中可能与另一段中显著改变管腔直径的收缩模式看起来相似。这是因为图中白色像素的确定依据是给定视频中的最小直径。如果视频内直径变化较小（环形肌收缩微弱或无收缩），则对制备组织直径改变不大的微弱收缩可能与另一视频中的推进性收缩表现相似。因此，必须参考地图右上角的图注信息。若最大与最小直径之间的差异较小，则必须将ST图与生成该图的原始视频进行比对，以判断ST图中像素明暗变化的准确性。因此，结合比例尺与实际录像进行综合分析，对于正确解读ST图至关重要。
视频记录和肠道及结肠节段的时空图谱绘制已应用于包括斑马鱼在内的多种物种 26，小鼠 25,27-30大鼠 7,9,30-33，豚鼠 5,6,8,13-19,24,30,32,34,35，刷尾负鼠 12,36，兔 2,30,37,38，鸡 39，猪 40,41 和人类 42最常被研究的物种是豚鼠。这一点并不令人意外，因为豚鼠的肠神经系统已被最为全面地表征，且在历史上一直是研究最广泛的动物。 体外 关于肠道推进性运动 43时空定位图谱技术主要应用于小型动物肠道的管状节段；然而，利用改良系统对兔和猪开展的研究表明，该方法同样可应用于较大型动物。对于兔而言，其操作方法与小型动物完全相同，仅使用了更大的组织节段和器官浴装置。 30在猪的实验中，采用的方法是从麻醉的猪体内引出一段外置的小肠环，而不是将分离的组织片段浸入器官浴槽中。此外，ST图是通过互相关法生成的，而非大多数研究中使用的透射照明法。 40已将分离的血管灌注肠段制备技术用于视频记录和时空图谱分析，该方法同样适用于大鼠等较小物种 33。Kuizenga 的一项近期研究 等首次使用视频记录的运动模式ST图 离体 人类肠道片段 42；尽管STmapping方法已应用于人体测压（压力）记录的分析 体内 3,44记录到的人体组织运动模式与先前在动物模型中使用类似技术所记录的模式相似，证实了该方法可推广应用于人体组织。值得注意的是，本研究将来自视频记录的ST图与力传感器记录的肌肉收缩测量相结合。通过插入管腔内的光纤测压导管测量管腔内压力 离体 该片段还被转换为STmap，展示了STmap在可视化管腔直径变化之外的多种应用潜力。这种结合肌肉张力、管腔内压力和管壁运动的综合方法，有助于对从视频记录生成的STmap进行更深入的功能分析。
通过分析由管壁运动和管腔直径变化（亦称为 D图）生成的时空图（ST图），研究人员得以详细描述推进性蠕动波和局部节段性收缩等运动模式。尽管这些模式此前已通过其他实验方法得以识别，但当前的技术手段能够更精确地定义局部收缩运动，例如 ripple（涟漪样收缩）以及新型的逆蠕动收缩9,24,25,30,31,42。ST图的构建及对运动模式变化的分析已被应用于肠道和结肠胃肠动力研究中的关键问题，包括：区分神经源性与肌源性收缩，明确 Cajal 间质细胞的作用6,9,11,12,16,24,26,27,29-31,33,37-40,42；理解环行肌与纵行肌层之间的复杂相互作用2,7,8,11,12,32,39,40；探究管腔内营养物质10,18,19、微生物菌株34以及黏度12,36对各种运动模式的影响；以及阐明多种内源性神经激素因子和外源性药理学因子2,4-7,9,10,13-17,28,35,40在运动产生与调控中的作用。该技术的未来发展方向是将其与其他测量手段相结合，包括压力、电生理和张力/收缩力的检测。近期研究常将视频记录与时空图分析联合一种或多种上述测量方法，以提供更丰富的相关性数据2,42。此外，该系统还可用于测量其他管状及非管状器官的运动功能。例如，已有研究尝试利用该系统测量胃动力，但该技术及软件仍需进一步优化，以更准确地量化此类非管状器官的运动功能45。毫无疑问，未来单独使用时空图技术或将其与传统分析方法结合，将推动对胃肠动力机制更深入、更全面的理解。

150年来，人们已开发出多种记录和分析肠道运动的方法 1。这些范围从最初的 体内 威廉·博蒙特和沃尔特·坎农的观察与描述，到近期对肌肉张力、管腔内压力和/或膜电位的多部位记录的测量与解读方法即， 连接电位 2-6这些后述方法能够提供整体运动模式的快照，但受限于记录位点的数量，以及对记录位点之间区域的数据插值的有效性。
近年来，视频记录和时空图谱（STmap）技术的发展使得研究人员能够观察和分析离体完整结肠和肠道节段中的复杂运动模式。ex vivo 肠道节段的最初研究方法最早于20世纪90年代末提出7,8，依赖研究人员自行设计的软件来分析视频记录；目前已有多个研究团队为此目的开发或改进了专用软件2,8-12。尽管许多团队开发了各自的软件包或插件，但它们均通过分析组织节段的不同直径，并将这些直径数据转换为灰度图像进行呈现。一种 commercially available 的记录与分析系统——胃肠道运动监测系统（GastroIntestinal Motility Monitoring system, GIMM）——提供了一种即用型解决方案，既可用于通过测定粪便颗粒移动速度来分析豚鼠远端结肠的推进性运动13，也可用于在完整肠段中结合液体刺激分析推进性和混合性运动模式4,5,14-19。后一种方法依赖于生成并分析STmap，本文即对此方法进行详细描述。该方法的目标是提升对肠道中多种运动模式进行定性与定量分析的能力。尽管已有其他研究团队利用自研软件通过STmap进行运动分析，但本文是首次系统阐述如何使用GIMM系统通过生成STmap来分析肠道运动模式。在本论文中，我们提供了详细的分步操作指南，涵盖：肠道组织的视频记录前准备、视频记录参数的正确设置以最大程度提高对组织直径变化的检测能力、STmap的生成，以及如何利用GIMM系统和ImageJ软件对STmap进行解读与分析。
本文所述方法专门用于分析含有影响肠道运动模式化合物的液体或半固体物质在管腔内的灌流。关于粪便颗粒推进的分析方法，Mawe 及同事在一篇论文中已有描述。 13该通用方法可应用于其他管状平滑肌器官，例如：小肠、血管、尿道、输尿管 等。 尽管该方法本身无法提供压力或肌张力变化的数据，但可与其他研究团队已展示的方法类似，结合使用压力传感器、力传感器或电生理学测量，以更全面地揭示运动模式。 2,15,20,21.

<table><tbody><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>用于Krebs缓冲液。</td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>用于Krebs缓冲液。</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher</td><td>P285</td><td>用于Krebs缓冲液。</td></tr><tr><td>硫酸镁 (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>用于Krebs缓冲液。</td></tr><tr><td>氯化钙 (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>用于Krebs缓冲液。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠 (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td>用于Krebs缓冲液。</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>用于Krebs缓冲液。</td></tr><tr><td>混合气体（95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖托盘/培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dunkin Hartley 豚鼠</td><td>Charles River</td><td>品系 051</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td>可免费在线获取。</td></tr><tr><td>胃肠道运动监测仪 (GIMM)</td><td>Catamount Inc., St. Albans, Vermont</td><td></td><td>包含以下所列组件。</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td></td><td></td><td>随GIMM提供。</td></tr><tr><td>浴槽相机</td><td></td><td></td><td>随GIMM提供。</td></tr><tr><td>浴槽透射背光灯</td><td></td><td></td><td>随GIMM提供。</td></tr><tr><td>器官浴槽</td><td></td><td></td><td>随GIMM提供。</td></tr><tr><td>背光强度控制器</td><td></td><td></td><td>随GIMM提供。</td></tr><tr><td>GIMM处理器ImageJ插件</td><td></td><td></td><td>随GIMM提供。</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td></td><td></td><td>随GIMM提供。</td></tr><tr><td>管路连接器</td><td></td><td></td><td>随GIMM提供。</td></tr><tr><td>蠕动泵用Masterflex管</td><td></td><td></td><td>随GIMM提供。</td></tr><tr><td>加热浴/水循环器</td><td></td><td></td><td>随GIMM提供。</td></tr></tbody></table>

运动性的时空图谱绘制 离体 肠道的制备

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

已采用多种方法来记录和评估胃肠道运动功能，包括记录肌肉张力、腔内压力以及膜电位的变化。这些方法均依赖于同时测量胃肠道不同部位的活动情况，并据此推断整体的运动模式。近年来，视频记录与时空图谱（STmap）技术的发展使得观察和分析复杂的运动模式成为可能 离体 结肠和肠道的完整节段。记录并数字化后，视频资料可转换为时空图（STmaps），其中管腔直径被转化为灰度或彩色图像［称为直径图（Dmaps）］。STmaps可提供关于蠕动方向的数据即， 静止、蠕动、逆蠕动）、收缩运动模式的速度、持续时间、频率和强度。该方法的优势包括：可分析同一肠段不同区域中不同运动模式之间的相互作用或同步发育，可视化运动模式随时间的变化，以及分析一个区域的活动如何影响另一区域的活动。视频记录可使用不同的时间尺度和分析参数进行重放，从而对不同的时空图（STmaps）和运动模式进行更详细的分析。本方案特别详细描述了管腔内液体扩张及影响运动产生的管腔内刺激的作用。使用管腔受体激动剂和拮抗剂可提供关于特定运动模式如何启动，以及一种模式如何转化为另一种模式的机制性信息。该技术的局限性在于仅能测量引起管腔直径变化的运动，无法提供管腔内压力变化或肌肉张力的数据，且可能因实验设置而产生伪影；尽管分析方法可在一定程度上校正这些问题。与以往技术相比，视频记录结合时空图分析的方法能够更全面地理解胃肠道运动功能。

将时空图（STmaps）理解为直径图（Dmaps）
尽管该技术生成的图谱具有时空特性，但所可视化的是组织管腔直径在空间和时间上的变化。ST图在x轴上表示沿组织段的水平距离（单位：mm），y轴表示时间（单位：秒），起始时间位于上方，结束时间位于下方。右上角为图例，显示最小和最大管腔直径，以及x轴和y轴的刻度信息（图1-4）。因此，灰度图像中不同像素明暗对应不同的管腔直径：较暗的像素代表较大的直径，较亮的像素代表较小的直径。因此，环形肌的收缩波由于管腔直径减小，表现为像素较亮的区域（图1 黑色箭头）。相反，由于环形肌松弛或大量液体通过引起的管腔扩张，会导致管腔直径增大，在ST图/D图中表现为较暗的像素（图1C 白色箭头）。关于ST图形成原理及其意义的进一步讨论，可参见Lammers研究组发表的论文11。
管腔扩张诱导的推进性收缩
在图1中，使用0.5、1.0、1.5和2.0 ml的Krebs缓冲液分别对豚鼠近端结肠进行扩张，每次体积维持5分钟。所有≥1.0 ml的体积均能诱发传播性收缩，在ST图中表现为细的白色条带（图1）。肠腔扩张可引发传播性收缩。如图1所示，随着腔内体积增加，肠腔直径增大，ST图中对应直径的像素变暗，形成整体更暗的背景。当扩张达到一定程度时，启动了蠕动反射（1.0 ml；图1），在口腔端引发推进性收缩波，使肠腔直径减小，并向肠段肛门端传播（在图1和图4中显示为白色条带）。代表收缩的白色条带前方常出现一条暗带，代表蠕动波前方的肛门侧松弛（图1C白色箭头）。这些白色和暗色像素分别对应于蠕动反射的升支收缩和降支松弛成分22,23。在图1的A图中，0.0 ml时无推进波，0.5 ml扩张时无推进波，1.0 ml扩张时有3个推进波，1.5 ml扩张时有6个推进波，2.0 ml扩张时有5个推进波。
营养诱导的静止/混合性收缩
传播性收缩波并不是ST图中可观察到的唯一运动模式。混合型运动模式（如分节运动）也可在ST图及其对应的图像中观察到（图2A）。该模式与传播性收缩不同。在混合模式中，多个微小且静止的收缩同时出现在不同区域（在ST图中表现为同一水平线上多个互不接触的小白色方块）。尽管每个分节性收缩都是静止的，不会像传播性收缩那样从口侧向肛侧移动，但ST图能够长时间呈现复杂的收缩模式，从而可视化收缩随时间缓慢向肛侧推进的过程（图2A 黑色箭头所示）。通过使用ImageJ及其配套插件，在白色收缩方块处绘制一条垂直线，还可确定每次单个收缩的持续时间（图2A）。在此由结肠内灌注短链脂肪酸所生成的ST图中，平均静止收缩持续时间约为2秒（范围：1.9至2.1秒）。尽管组织段上残留的肠系膜可能在分析中产生伪影，但由肠系膜引起的垂直线伪影（图1B、图2B）可用于判断纵行肌的运动。在图1B和图2B中，黑色垂直线的水平移动是由于纵行肌的收缩与舒张所致。这种纵行肌的侧向运动可在ST图中表现为由肠系膜伪影产生的垂直条带的水平移动（图1B、2B）。
ST图的ImageJ及插件分析
通过使用 ImageJ 和 GIMMProcessor 插件，可以测定传播波的传播速度（图3）以及收缩持续时间（图2）。在图3中，顺行波和逆行波的传播速度均约为 0.25 mm/sec（范围：0.21 至 0.35 mm/sec）。如上方视频图像中 ST 图上方所示，分析线（视频图像上形成矩形框的红线）被精确地设置在组织片段的一侧边缘，而非围绕整个片段。这是软件中指南线功能的一个重要应用。在后续的讨论部分将进一步分析，精确设置这些指南线对于视频的正确分析至关重要。该方法可生成 ST 图，用于可视化肌源性涟漪样收缩24。这类收缩起源于肌源性，不会显著改变管腔直径。此外，利用该技术还可分析涟漪收缩常见的不同传播方向（顺行或逆行）（图3）。如图2所示，收缩持续时间在组织片段的不同区域可能存在差异。
ST图的正确分析
生成ST图时可能存在一个问题是，由于实验方法的原因可能导致伪影的产生。例如，若肠系膜残留在组织外侧，会增加该组织段的直径读数，从而在ST图上形成一条垂直的黑线（图1、2B）。肠系膜的存在还会通过增大最大管腔测量值而人为拓宽灰度图，导致标尺对比度测量值降低。因此，最好在不穿孔组织的前提下，尽可能彻底地去除肠系膜。另一种可能的ST图伪影是由于管腔液体中存在气泡而形成的垂直白线，这些气泡无法与黑色背景形成对比（图4B）。这些气泡可能使分析软件误判管腔直径变小，或在ST图的运动模式上叠加白色/亮色区域。因此，在分析前对组织段的正确设置以及对视频记录进行恰当的对比度调节，对于成功构建ST图至关重要（图4）。图4展示了正确与不正确的对比度设置示例。需要注意的是，实验前的相机校准和实验后的分析窗口中的视频调节，对于生成和分析高质量的ST图均极为关键。图像校准不当可能导致生成的ST图数据无法使用（图4A）。
<img alt="肠系膜收缩示意图；液体扩张，三个阶段的收缩；研究研究。" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 近端结肠中的传播性收缩波。（A） 采用膨胀-反应曲线（在豚鼠近端结肠中进行）确定引发该肠段传播性收缩波所需的适当管腔内液体体积（白色水平带）。黑色箭头表示全程传播性收缩波的示例。白色箭头表示因肠系膜去除不完全而产生的条纹状伪影。（B） 通过与A图类似但持续时间较短的实验生成ST图，从而获得传播性收缩的更清晰视图。在此图中，更容易观察到收缩波从口侧向肛侧方向推进，并识别出位于白色条带前方、表现为暗区的前导性肛侧松弛现象，相较于A图更为明显。该图还提供了肠系膜伪影的另一种观察视角。红色框标示了C图中进一步放大的ST图区域。（C） 本图展示了与B图相同视频和ST图的更近距离视图。标有“液体扩张”的白色箭头指向因传播波肛侧管腔液体扩张所致的暗像素区域，这些区域对应于环行肌收缩肛侧的环行肌松弛区。请注意，由于A图的时间尺度较长，传播性收缩在图中呈现为完全水平的线条；而在B图和C图中，时间尺度依次缩短，因此收缩波呈现出可测量的斜率，该斜率可被报告为收缩波传播的速度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="超声成像，波动纤毛的灰度阴影图，流体运动分析。" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过时空图（STmap）确定收缩持续时间。（A） 豚鼠近端结肠在腔内灌注短链脂肪酸（丁酸盐）后表现出混合/节段性运动模式。通过收缩期绘制的垂直红线可用于在 Image J 软件中结合 GIMMProcessor 插件测定收缩持续时间。黑色箭头显示静止性收缩向肛侧的传播方向。（B） 小鼠回肠中的传播性收缩常表现出持续收缩的区域。该图中的垂直箭头表明，更靠近口侧的区域保持收缩状态的时间更长。在此实验装置中，标本的肛端被封闭，以防止组织收缩期间液体从封闭系统中流出。图示面板顶部的图像显示，组织整个口侧完全收缩（在STmap上呈白色），而整个肛侧因液体充盈而扩张（在STmap上呈黑色）。图B中STmap中央垂直黑色条带的横向/侧向移动反映了纵行肌层的运动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示方向性流动分析的肠道运动灰度示意图，带有箭头指示。" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 双向运动模式。 传播性蠕动波可沿正向（口腔至肛门方向）和逆向（肛门至口腔方向）移动。实心黑色箭头表示正常的正向传播，虚线黑色箭头表示逆向传播。该ST图中正向和逆向收缩的传播速度通过ImageJ分析确定，约为0.25 mm/sec。图像分析线（ST图上方视频图像中形成方框的红线）设置在组织边缘附近，用于观察肌源性 ripple 收缩，这类收缩幅度低、深度浅，通常呈正向、逆向或双向排列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="内镜超声灰阶图像；伪影对比，非增强伪影，示意图。" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 正确图像对比度对生成ST图的重要性。（A）显示对比度不正确的图像及其对应的ST图，而图B显示对比度正确的图像及其对应的ST图。在（A）中，由正确对比度图像（B）产生的水平白色条带并不明显，并且由于原始图像为灰阶图像，出现了多个伪影（白色阴影）。在由正确对比度图像生成的ST图（B）中，灰阶图像的白色阴影伪影消失，传播的收缩波更加清晰。此外，在每次收缩波过程中，可在ST图的肛端观察到代表收缩波前方舒张区域的黑色阴影。在图B中，白色箭头指示由图像中未能正确增强的区域所引起的ST图伪影。此类伪影主要由实验过程中偶尔出现在标本内的管腔内气泡所致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

近期可用的视频记录和时空图谱（STmap）技术使得可视化和量化肠道运动的传播与混合模式成为可能。本实验方案的目的是介绍如何使用胃肠道运动监测（GIMM）系统生成并分析STmap。

已采用多种方法来记录和评估胃肠道运动功能，包括：记录肌肉张力变化、管腔内压力、……

构建离体肠道全面时空图谱的总体目标是通过观察整个肠段肠壁的详细运动，研究其对管腔内容物的反应。该技术的主要优势在于，能够同时在空间和时间维度上记录并比较同一组织肠段不同区域的活动，从而识别复杂的运动模式，而不仅仅是简单的收缩或舒张。尽管该方法可用于深入了解正常的肠道运动功能，还可用于鉴定各种药物和管腔内试剂（如营养物质）对肠道运动模式的影响。通常，初次接触该方法的人可能会遇到困难，因为最初时空图可能较难解读。但随着时间推移，人们可以一眼识别出复杂的模式。首先，从已处死的豚鼠中取出结肠或肠道。用温热的克雷布斯液固定。在解剖托盘中，通过管腔轻轻灌注克雷布斯缓冲液以清除所有管腔内容物。使用带有钝端导管的注射器进行灌注，并避免在灌注过程中过度扩张结肠段。接下来，将两段长约三毫米的聚乙烯导管分别连接到两根直径为三毫米的火焰抛光玻璃管导管上。在加热的解剖托盘中，将一根导管插入组织标本的口腔端，并在导管周围、紧邻导管的小段导管后方用外科结绑扎缝线。轻轻尝试将导管向外拉，以确保结扎紧密。一小段聚乙烯导管可防止缝线滑脱。使用另一根导管在组织的远口端重复此操作。然后从组织标本上去除肠系膜。固定两根导管后，将标本从解剖托盘转移至其中一个GIMM器官浴槽中，并使组织的口端朝向远离操作者的方向。接着，使用雕塑用黏土将玻璃管导管固定在浴槽上，方法是将玻璃管末端黏附在浴槽侧壁，或使用塑料夹将导管固定在浴槽上方用于固定摄像头的支柱上。然后，将一段5厘米长的管路连接至每根导管的开放端。对于口腔导管，将短段导管连接至带有鲁尔锁扣接头的较长导管上。然后将5 mL注射器连接至鲁尔锁扣接头。此装置将用于向组织样本中注入缓冲液。对于远口端导管，使用管路将管腔流出液引入收集容器中。然后，使用连接的注射器缓慢用预热的克雷布斯缓冲液冲洗组织，以确保液体从远口端导管流出，表明灌流良好。在组织平衡30分钟的同时，开始校准视频记录系统。使用 GIMM 软件校准相机的高度位置、视频的亮度和对比度设置以及水平距离。单击实验选项卡以选择需要校准的相机，然后在文件菜单中单击“校准”。当视频出现在校准工作站窗口中后，调整摄像头高度，使画面包含插入结肠腔内的导管末端。然后使用贴在每个浴槽上的透明尺贴纸，在屏幕图像中标定水平距离。在同一校准工作站窗口中，设置红色垂直参考线，使其相距10毫米。然后在距离光标窗口中输入此距离，并点击 Cal 按钮。接下来，在校准工作站窗口中调节增益、亮度和快门滑块，使组织片段在明亮背景上呈现为深色轮廓。随后调节相机上的焦距和光圈旋钮，以进一步优化图像质量。为完成图像校准，请在弹出窗口中点击“Save”，然后点击“Yes”。最后，点击“Exit”。在半小时的平衡期结束后，开始实验。首先为实验命名。接着，用塑料夹闭合从肛门端导管伸出的管腔。然后向近端结肠腔内注入约 7 毫升的 Krebs 缓冲液。目的是提供足够的扩张以引发推进性收缩。当肠段被管腔内液体扩张后，开始视频录制。在软件中，双击命名的试验以打开实验摄像视图，然后将切换开关置于开启位置，以查看摄像视野。采集预定时长的视频数据。在完成首次受控扩张试验后，松开或移除夹具，使组织段将扩张液体从管腔中排出。让组织重新平衡 10 至 20 分钟，然后使用处理方案重复该操作。单个组织制备样本可接受多达五次、每次10分钟的处理，且每次测试之间需有适当的休息间隔。注意观察黏膜脱落现象，这表明组织已发生降解。为分析记录结果，可双击特定试验的名称，以打开分析窗口并构建ST图谱。在视频播放区域内，调节对比度和亮度滑块，使图像适合分析。在浅色背景上创建黑色的组织轮廓。接下来，在视频图像窗口内设置水平和垂直的红色参考线，以划定用于分析的组织区域，并去除包含伪影的区域。然后设置分析时间。当时间滑块处于正确位置时，单击绿色 A 按钮以选择起始点，单击黄色 B 按钮以选择终止点。接下来，选择“运动分析”选项卡以打开 ST 图谱窗口，然后单击秒表按钮。通过点击组织黑色轮廓内的十字准星光标，开始生成空间转录组（ST）图谱。图谱生成可能需要几分钟时间才能完成。ST图谱构建完成后，选择缩放功能以放大图像。然后选择颜色选项，以彩色而非灰度显示图像。接着选择启用，以激活光标用于选择待分析的像素。对于所选像素对应的组织，其管腔直径随时间的变化将被分析，并以颗粒直径轨迹的形式显示在ST图右侧。分析完成后，选择“退出”。随后通过依次选择“文件”和“导出数据”，然后选择“图元文件”，将ST图导出用于其他用途。输入文件名，单击“保存”，将其保存为emf文件。该技术生成的图像显示了组织管腔直径在距离和时间上的变化。水平距离位于 X 轴，时间位于 Y 轴，起始时间在顶部，结束时间在底部。右上角为图例，显示最小和最大管腔直径，以及 X 轴和 Y 轴的刻度信息。因此，灰度图像中不同的像素灰度对应不同的管腔直径。较暗的像素对应较大的直径，较亮的像素对应较小的直径。由于管腔直径减小，环形肌的收缩波会表现为像素较亮的区域。相比之下，由于环形肌松弛或大量液体通过引起的管腔扩张则显示为较暗的像素。除了传播性收缩波外，还可观察到一种称为分节运动的混合性运动模式。这种运动表现为在不同区域同时发生的小范围、静止性收缩。随着时间推移，这些微小收缩会向反口端肛门方向移动。组织上残留的肠系膜可能引起伪影，表现为暗色的垂直线。这些垂直伪影的水平移动可用于确定纵行肌运动的时间。观看本视频后，您应能够充分了解如何制备用于视频录制的肠段，以及如何将肠动力活动以时空图的形式进行后续呈现。通过该实验流程，可在管腔灌流液中添加不同的营养物质，以确定天然成分如何诱导特定的肠动力模式，从而促进消化与吸收。此外，可通过使用神经体液因子受体的特异性药理学激动剂或拮抗剂，来探究肠动力启动与传播的潜在机制。该技术可能有助于产生可用于确定治疗运动功能障碍有效化合物的数据。

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