运动性的时空图谱绘制 离体 肠道的制备

构建离体肠道全面时空图谱的总体目标是通过观察整个肠段肠壁的详细运动，研究其对管腔内容物的反应。该技术的主要优势在于，能够同时在空间和时间维度上记录并比较同一组织肠段不同区域的活动，从而识别复杂的运动模式，而不仅仅是简单的收缩或舒张。尽管该方法可用于深入了解正常的肠道运动功能，还可用于鉴定各种药物和管腔内试剂（如营养物质）对肠道运动模式的影响。

通常，初次接触该方法的人可能会遇到困难，因为最初时空图可能较难解读。但随着时间推移，人们可以一眼识别出复杂的模式。首先，从已处死的豚鼠中取出结肠或肠道。

用温热的克雷布斯液固定。在解剖托盘中，通过管腔轻轻灌注克雷布斯缓冲液以清除所有管腔内容物。使用带有钝端导管的注射器进行灌注，并避免在灌注过程中过度扩张结肠段。

接下来，将两段长约三毫米的聚乙烯导管分别连接到两根直径为三毫米的火焰抛光玻璃管导管上。在加热的解剖托盘中，将一根导管插入组织标本的口腔端，并在导管周围、紧邻导管的小段导管后方用外科结绑扎缝线。轻轻尝试将导管向外拉，以确保结扎紧密。

一小段聚乙烯导管可防止缝线滑脱。使用另一根导管在组织的远口端重复此操作。然后从组织标本上去除肠系膜。

固定两根导管后，将标本从解剖托盘转移至其中一个GIMM器官浴槽中，并使组织的口端朝向远离操作者的方向。接着，使用雕塑用黏土将玻璃管导管固定在浴槽上，方法是将玻璃管末端黏附在浴槽侧壁，或使用塑料夹将导管固定在浴槽上方用于固定摄像头的支柱上。然后，将一段5厘米长的管路连接至每根导管的开放端。

对于口腔导管，将短段导管连接至带有鲁尔锁扣接头的较长导管上。然后将5 mL注射器连接至鲁尔锁扣接头。此装置将用于向组织样本中注入缓冲液。

对于远口端导管，使用管路将管腔流出液引入收集容器中。然后，使用连接的注射器缓慢用预热的克雷布斯缓冲液冲洗组织，以确保液体从远口端导管流出，表明灌流良好。在组织平衡30分钟的同时，开始校准视频记录系统。

使用 GIMM 软件校准相机的高度位置、视频的亮度和对比度设置以及水平距离。单击实验选项卡以选择需要校准的相机，然后在文件菜单中单击“校准”。

当视频出现在校准工作站窗口中后，调整摄像头高度，使画面包含插入结肠腔内的导管末端。然后使用贴在每个浴槽上的透明尺贴纸，在屏幕图像中标定水平距离。在同一校准工作站窗口中，设置红色垂直参考线，使其相距10毫米。

然后在距离光标窗口中输入此距离，并点击 Cal 按钮。接下来，在校准工作站窗口中调节增益、亮度和快门滑块，使组织片段在明亮背景上呈现为深色轮廓。随后调节相机上的焦距和光圈旋钮，以进一步优化图像质量。

为完成图像校准，请在弹出窗口中点击“Save”，然后点击“Yes”。最后，点击“Exit”。在半小时的平衡期结束后，开始实验。

首先为实验命名。接着，用塑料夹闭合从肛门端导管伸出的管腔。然后向近端结肠腔内注入约 7 毫升的 Krebs 缓冲液。

目的是提供足够的扩张以引发推进性收缩。当肠段被管腔内液体扩张后，开始视频录制。在软件中，双击命名的试验以打开实验摄像视图，然后将切换开关置于开启位置，以查看摄像视野。

采集预定时长的视频数据。在完成首次受控扩张试验后，松开或移除夹具，使组织段将扩张液体从管腔中排出。让组织重新平衡 10 至 20 分钟，然后使用处理方案重复该操作。

单个组织制备样本可接受多达五次、每次10分钟的处理，且每次测试之间需有适当的休息间隔。注意观察黏膜脱落现象，这表明组织已发生降解。为分析记录结果，可双击特定试验的名称，以打开分析窗口并构建ST图谱。

在视频播放区域内，调节对比度和亮度滑块，使图像适合分析。在浅色背景上创建黑色的组织轮廓。接下来，在视频图像窗口内设置水平和垂直的红色参考线，以划定用于分析的组织区域，并去除包含伪影的区域。

然后设置分析时间。当时间滑块处于正确位置时，单击绿色 A 按钮以选择起始点，单击黄色 B 按钮以选择终止点。接下来，选择“运动分析”选项卡以打开 ST 图谱窗口，然后单击秒表按钮。

通过点击组织黑色轮廓内的十字准星光标，开始生成空间转录组（ST）图谱。图谱生成可能需要几分钟时间才能完成。ST图谱构建完成后，选择缩放功能以放大图像。

然后选择颜色选项，以彩色而非灰度显示图像。接着选择启用，以激活光标用于选择待分析的像素。对于所选像素对应的组织，其管腔直径随时间的变化将被分析，并以颗粒直径轨迹的形式显示在ST图右侧。

分析完成后，选择“退出”。随后通过依次选择“文件”和“导出数据”，然后选择“图元文件”，将ST图导出用于其他用途。输入文件名，单击“保存”，将其保存为emf文件。

该技术生成的图像显示了组织管腔直径在距离和时间上的变化。水平距离位于 X 轴，时间位于 Y 轴，起始时间在顶部，结束时间在底部。右上角为图例，显示最小和最大管腔直径，以及 X 轴和 Y 轴的刻度信息。

因此，灰度图像中不同的像素灰度对应不同的管腔直径。较暗的像素对应较大的直径，较亮的像素对应较小的直径。由于管腔直径减小，环形肌的收缩波会表现为像素较亮的区域。

相比之下，由于环形肌松弛或大量液体通过引起的管腔扩张则显示为较暗的像素。除了传播性收缩波外，还可观察到一种称为分节运动的混合性运动模式。这种运动表现为在不同区域同时发生的小范围、静止性收缩。

随着时间推移，这些微小收缩会向反口端肛门方向移动。组织上残留的肠系膜可能引起伪影，表现为暗色的垂直线。这些垂直伪影的水平移动可用于确定纵行肌运动的时间。

观看本视频后，您应能够充分了解如何制备用于视频录制的肠段，以及如何将肠动力活动以时空图的形式进行后续呈现。通过该实验流程，可在管腔灌流液中添加不同的营养物质，以确定天然成分如何诱导特定的肠动力模式，从而促进消化与吸收。此外，可通过使用神经体液因子受体的特异性药理学激动剂或拮抗剂，来探究肠动力启动与传播的潜在机制。

该技术可能有助于产生可用于确定治疗运动功能障碍有效化合物的数据。