头固定小鼠中由胡须信号引发的眼睑条件反射经典条件化

本实验方案的总体目标是利用小鼠的遗传学进展以及对触须系统的研究，探究眨眼条件反射的神经生物学基础，这是一种可用于研究学习与记忆的可转化范式。该方法可通过在条件反射过程中刺激特定触须，同时在基因修饰小鼠中进行钙成像和电生理记录，从而帮助回答学习与记忆中的机制性问题。该技术的主要优势在于，能够在允许小鼠在圆柱形跑步机上以自身节奏自由行走的同时，固定其头部并最大程度减少应激反应。

该技术的应用前景涉及对记忆障碍的潜在治疗，包括与正常衰老和阿尔茨海默病相关的记忆障碍。文本方案中分别介绍了圆筒装置和胡须刺激系统的准备。本节介绍头件的制备。

头件条带是根据已不再商业生产的Amphenol 221系列尼龙条带建模而成的3D打印七孔条带。从3D打印部件上，对条带的第一个孔进行攻丝，适配0-80规格、一英寸长的机用螺钉，并在第一个孔之后留出一个孔不使用。接下来，使用台钳将五个镀金插针插入剩余的五个孔中。

将针穿过塑料上的较小孔洞。接下来，使用热剥线器剥离半厘米的聚酰亚胺涂层。然后，将裸露的一端焊接到其中一个带有开口的针脚上。

将焊好的导线剪至六到七毫米之间，并剥离导线约两毫米的绝缘层。接下来，重复此过程，总共将四根导线连接到五个引脚上。前两根导线用于记录眼睑肌电图（EMG）反应，后两根导线则用于向眼周区域传递电刺激。

在第五个引脚上焊接一段未绝缘的五厘米长不锈钢丝，作为电气接地。完成所有连接后，使用万用表逐一检查每个连接点，以确保其电气连通性。实验开始前，需确认动物已处于完全麻醉状态，可通过脚趾夹捏反应来验证。

注射盐酸布托啡诺作为镇痛剂。然后在动物角膜上涂抹少量眼用软膏，并剃除其头部顶部的毛发。接着，将动物头部固定于立体定位仪上，并使用聚维酮碘和酒精交替擦拭三次，对头皮进行消毒。

使用10号或15号手术刀片，在头皮正中线上做一切口，从眼睛前方开始，延伸至枕骨后方。用六个微型夹子将皮肤瓣向两侧牵开，尽可能暴露颅骨，包括侧面和后部。接着，用手术刀刮除颅骨表面的骨膜。

然后用3%过氧化氢清洗颅骨顶部三次。待颅骨干燥后，使用34号倒锥形钻头钻两个孔，注意不要损伤脑组织。一个孔置于前囟前方，另一个孔置于人字缝前方，若对右眼进行处理，则该孔位于中线左侧，反之亦然。

应小心钻孔以适配螺丝，并需尽最大努力避免损伤脑组织。在孔中安装用于电连接的螺丝，每旋转一圈可使螺丝下降 0.28 毫米，因此旋转两整圈即足够。

接下来，在颅骨上制作多个小凹槽，以增加用于粘合剂的表面积。从已完成的头件开始，将地线以8字形缠绕在两枚螺钉周围。地线应留有一定余量，以便正确安置头件。

现在，涂抹冷固粘接水泥。充分覆盖颅骨和螺钉，并让水泥自然干燥。待水泥完全干燥后，将头件垂直放置，使螺钉朝上突出于颅骨表面。

使用框架臂上附带的固定器固定头件。该固定器必须具有五个镀金插孔，以插入头件的插针。将两根EMG导线置于眼眶上方的眼轮匝肌上。

然后，放置两根刺激电极。将裸露的电极末端置于眼球后方2至4毫米处的皮下。注意电极末端不要相互接触。

如果导线过长，可能会划伤动物的眼睛，则应将其剪短或弯回。需确保暴露一部分裸露的导线。现在，用更多一些的粘固剂将导线的基部固定在颅骨上，并使其干燥。

使用之前所用体积约一半的量。操作时，取下微型夹子并重新调整皮肤位置。让皮肤自然复位，以避免皮肤张力导致眼睑变形，影响眨眼动作，从而破坏实验结果。

待皮肤稳定后，取下头件固定器，并用牙科水泥封闭暴露区域。注意避免将水泥滴到眼睛或头件的针脚上。然后用蘸有牙科水泥溶剂的棉签，根据需要涂抹并塑形部分固化的水泥，使其表面平滑。

待水泥完全干燥后，将动物从立体定位仪上取下，并置于温暖的表面上使其恢复，然后放回其饲养笼中。在小鼠至少恢复五天后，开始进行适应性训练。固定小鼠时，可短暂地抓住其尾巴，将其轻轻夹在肩部后方以进行限制。

然后从腹部和躯干下方将小鼠提起。接着，将连接器安装到头件上，并拧紧锁定螺钉。随后，轻轻将小鼠放置在圆筒上，保持其静止不动，同时使用两个螺钉将连接器固定在圆筒上方的横杆上。

然后释放小鼠。在前两次实验中，让小鼠在圆筒中适应的时长与条件化实验阶段相同。在适应期间，记录小鼠自发的眨眼频率。

此外，在不施加电刺激的情况下，预先让小鼠接触胡须振动刺激器。将压电系统靠近条件化侧，将梳齿滑过单根胡须。每次实验均选择相同的胡须。

然后按照文中所述进行经典条件反射训练。将8至10周龄的雄性C57 Black 6J小鼠置于固定头部的圆柱形跑步机上，进行痕迹性眨眼条件反射训练。记录每次试验的肌电图（EMG）数据。

肌电图信号经过整流，并以10毫秒的时间常数进行积分，然后对所有试验进行平均。在10次训练过程中，条件反应的变化显示，反应的振幅逐渐增大，反应潜伏期逐渐缩短。这种变化在伪条件小鼠的反应中未观察到，因为这些小鼠接受的刺激是随机呈现的。

在条件刺激（CS）呈现后反应峰值时间的直方图中，也可以观察到适时且因此得到良好习得的条件反应的演变过程。观看本视频后，您应充分了解如何制备头件、通过手术将头件植入小鼠头部，以及如何将小鼠放置于圆柱形跑步机上，以进行头部固定的眼睑条件反射实验。随着训练的进行，您的小鼠应在连续数日内表现出良好的学习曲线。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在一小时内完成。在进行此操作时，重要的是要始终密切注意动物是否出现任何痛苦迹象，并应采取适当措施以尽量减少动物的应激反应。