头固定小鼠中由胡须信号引发的眼睑条件反射经典条件化

本方案的总体目标是利用小鼠的遗传学进展以及对鼠须系统的研究，探究眨眼条件反射的神经生物学基础，该范式可用于学习与记忆研究的跨物种转化。该方法通过在条件反射过程中对遗传修饰小鼠的特定鼠须进行刺激，同时结合钙成像和电生理记录，有助于回答学习与记忆中的机制性问题。该技术的主要优势在于能够在最小化小鼠应激反应的同时固定其头部，使小鼠可在圆柱形跑步机上以自定速度自由行走。

该技术的应用前景涉及对记忆障碍的潜在治疗，包括与正常衰老和阿尔茨海默病相关的记忆障碍。圆筒装置和胡须刺激系统的制备在文本方案中分别进行了介绍。本节介绍头件的制备。

头件条带是一个3D打印的七孔条带，其模型源自Amphenol 221系列尼龙条带，而该尼龙条带目前已不再商业化生产。从3D打印件上，将第一个孔攻丝为适用于0-80规格、一英寸长的机械螺钉，并在第一个孔之后留出一个孔不使用。接下来，使用台钳将五个镀金插针插入剩余的五个孔中。

将针穿过塑料上的较小孔洞。接着，使用热剥线器剥离半厘米的聚酰亚胺涂层。然后，将裸露的一端焊接到针上带有开口的位置。

将焊好的导线剪至六到七毫米之间，并剥离约两毫米的绝缘层。接下来，重复此操作，总共将四根导线连接到五个引脚上。前两根导线用于记录眼睑肌电图（EMG）反应，后两根导线则用于向眼周区域传递电刺激。

将一根未绝缘的五厘米长不锈钢丝焊接到第五个引脚上，作为接地电极。完成所有连接后，使用万用表逐一检查各连接点，以确保其电路导通。实验开始前，需确认动物已完全麻醉，可通过夹捏脚趾无反应来判断。

注射盐酸丁丙诺啡作为镇痛剂。然后在动物角膜上涂抹少量眼用软膏，并剃除动物头部顶部的毛发。接着，将动物头部固定于立体定位仪上，并使用聚维酮碘和酒精交替擦拭三次，对头皮进行消毒。

使用10号或15号手术刀片，沿头皮正中线做切口，暴露从眼部前方至顶间骨后方的颅骨。用六个微型夹子将皮瓣向两侧牵开，尽可能暴露颅骨的侧面和后部。接着，用手术刀刮除颅骨表面的骨膜。

然后用 3% 过氧化氢清洗颅骨顶部三次。待颅骨干燥后，使用 34 号倒锥钻头钻两个孔，注意不要损伤脑组织。一个孔位于前囟前方，另一个孔位于人字缝前方，若为右眼建立条件反射，则钻孔位于中线左侧，反之亦然。

应小心钻孔以适配螺丝，需格外注意避免损伤脑组织。在孔中放置用于电连接的螺丝。每旋转一圈，螺丝下降 0.28 毫米，因此旋转两整圈即足够。

接下来，在颅骨上制作多个小凹槽，以增加用于粘固剂的表面积。从已完成的头件开始，将地线以“8”字形缠绕在两枚螺钉周围。地线应留出一定余量，以便正确放置头件。

现在，涂抹冷固粘接水泥。充分涂覆颅骨和螺钉，并让水泥自然干燥。水泥干燥后，将头件垂直放置，使螺钉朝上突出于颅骨表面。

使用框架上臂部连接的支架固定头件。该支架必须具有五个镀金插孔，以容纳头件的插针。将两根肌电图导线置于眼眶上方的眼轮匝肌上。

然后，放置两根刺激电极导线。将裸露的末端置于眼后方2至4毫米处的皮下，注意两根导线的末端不要相互接触。

如果导线过长，可能划伤动物的眼睛，则应将其剪短或弯回。需保留部分裸露的导线。现在，用更多一些的固位水泥将导线基部粘结到颅骨上，并使其干燥。

使用之前所用体积约一半的量。接下来，取下微型夹子并重新调整皮肤位置。让皮肤自然回缩贴合，以避免皮肤张力导致眼睑变形，影响眨眼动作，从而破坏实验结果。

待皮肤稳定后，取下头件固定器，并用牙科水泥封闭暴露区域。注意避免将水泥滴到眼睛或头件的针脚上。然后用蘸有牙科水泥溶剂的棉签，根据需要对部分固化的水泥进行修整和塑形。

待水泥完全干燥后，将动物从立体定位仪上取下，并置于温暖的表面上使其恢复，然后放回其饲养笼中。在小鼠至少恢复五天后，开始进行适应性训练。固定小鼠时，可短暂抓住其尾巴，将其轻轻夹在肩部后方以进行限制。

然后从腹部和躯干下方将小鼠提起。接着，将连接器安装到头件上，并拧紧锁定螺钉。然后，轻轻将小鼠放置在圆筒上，并保持其静止，同时使用两个螺钉将连接器固定在圆筒上方的横杆上。

然后释放小鼠。在前两次实验中，让小鼠在圆筒中适应，适应时间与条件化实验的时间长度相同。在适应期间，记录小鼠的自发眨眼频率。

此外，在不施加电刺激的情况下，预先让小鼠接触胡须振动刺激器。将压电系统靠近条件化侧，将梳齿轻轻套过单根胡须。每次实验均选择相同的胡须。

然后按照文中所述进行经典条件反射训练。将8至10周龄的雄性C57 Black 6J小鼠置于固定头部的圆柱形跑步机上进行痕迹眼睑条件反射训练。记录每次试验的肌电图（EMG）数据。

肌电图信号经过整流，并以10毫秒的时间常数进行积分，然后对所有试验进行平均。在10次训练过程中，条件反应的演变显示，反应的振幅逐渐增大，反应潜伏期逐渐缩短。这种演变在伪条件小鼠的反应中未观察到，其中刺激以随机顺序呈现。

在条件刺激（CS）呈现后，反应达到峰值的时间直方图中，也可以观察到经过良好时机控制因而充分习得的条件反应的演变过程。观看本视频后，您应能很好地掌握如何制备头件、在外科手术中将头件植入小鼠头部，以及将小鼠放置于圆柱形跑步机上，以进行头部固定状态下的眨眼条件反射训练。随着训练的进行，您的小鼠应在多日实验中表现出良好的学习曲线。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在一小时内完成。在实施该操作过程中，重要的是要始终密切观察动物是否出现任何不适反应，并采取适当措施以最大限度地减少动物的应激。