Name: 在Micropost阵列方便，准确机械力分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 了解微柱阵列技术用于机械生物学研究，通过标准光学显微镜可视化细胞与基质相互作用力。该方法可高通量分析人骨肉瘤细胞的力学特性，助力癌症转移机制研究。

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本工作由瑞士委员会技术与创新（CTI）资助项目 14796-PFLS-LSCTI 支持。MicroPost 阵列由 MicroDuits GmbH 公司慷慨提供。

1. 在微柱阵列上培养细胞
注意：所有步骤均须在生物安全柜中进行，以确保无菌。此处提供的体积适用于 T25 细胞培养瓶。细胞培养基配方和细胞接种密度已针对骨癌细胞系 HuO9 和 M132 进行优化。
<ol>
	<li>准备将细胞接种到微柱阵列上的细胞培养物。
	<ol>
		<li>将培养瓶置于标准光学显微镜下，检查细胞培养质量。通过估算培养瓶底部被细胞覆盖的比例来判断细胞是否呈现正常的生长状态和形态。70%–80%的覆盖率表明细胞生长状态良好。注意观察悬浮细胞的数量，因其代表死亡细胞和/或过度生长的培养物。</li>
		<li>通过移除培养基并用4 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后加入0.8 ml 1×胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），在室温下孵育直至细胞脱落，通常需要2–4分钟。在显微镜下观察该过程，并可轻敲培养瓶以促进细胞脱落。</li>
		<li>加入5 ml细胞培养基（含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（Pen/Strep）的DMEM/F12培养基）以终止反应，并冲洗残留于瓶底的细胞。随后反复吹打数次，使细胞悬浮液均匀混合。吹打时应确保覆盖培养瓶原有的生长区域，以实现有效脱落。</li>
		<li>将细胞悬液转移至15 ml离心管中，使用台式离心机以0.5 × g离心3分钟。</li>
		<li>弃去上清液，加入5 ml培养基，通过反复吹打5次重悬细胞沉淀。操作过程中应避免产生气泡。</li>
		<li>使用细胞计数板和光学显微镜测定细胞密度。在细胞计数板中检查细胞悬液是否存在细胞团块，确保后续实验使用的是单细胞悬液。若细胞易形成团块，应再次反复吹打以分散细胞。</li>
		<li>用适量培养基稀释细胞悬液，使其浓度达到25,000个细胞/ml。将封闭的离心管反复倒置数次，充分混匀。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于细胞接种的微柱阵列。 
	关键提示：切勿直接将液体滴加至微柱阵列表面，以免损坏微柱结构，尤其是可能引入有害气泡。此外，务必确保微柱阵列始终处于湿润状态，避免因毛细作用力导致微柱塌陷。
	<ol>
		<li>使用镊子将带有微柱阵列的玻璃基底正面朝上放置于12孔板的一个孔中，加入1 ml乙醇（99%）润湿，室温孵育20–30秒。</li>
		<li>通过在孔壁一侧加入约1 ml无菌去离子水（DI水），并用移液器或抽吸装置吸出约1 ml液体，逐步稀释乙醇。重复此步骤至少3次。</li>
		<li>以相同方式用PBS缓冲液替换DI水：加入并吸出约1 ml PBS缓冲液，重复3次。</li>
		<li>以相同方式用培养基替换PBS缓冲液：加入并吸出约1 ml培养基，重复3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1 ml细胞溶液（含25,000个细胞）滴加至每个已准备好的微柱阵列表面。盖好多孔板，转移至培养箱（CO2 5%，37 °C）中培养，使细胞在微柱表面贴附并生长6&#160;–7小时。</li>
	<li>定期使用光学显微镜观察细胞贴附过程，确认大多数细胞已铺展并分布在多个微柱上。</li>
</ol>
2. 固定 &amp;#38; 细胞染色
注意：此处提供的所有步骤和体积均针对12孔板中的单个孔。建议每次处理12个孔中的不超过4个孔，以避免在吸除液体后孔内干燥，导致微柱塌陷。
<ol>
	<li>从孔中吸出培养基，并用 1 ml PBS 缓冲液轻柔洗涤细胞 2 次。洗涤时需施加轻柔的力量，以去除在孵育过程中积聚在微柱阵列表面的细胞碎片，并使死亡细胞脱落。</li>
	<li>用 0.5 ml 3.7% 缓冲甲醛溶液固定细胞 5 分钟。</li>
	<li>通过用 1 ml 无菌去离子水洗涤微柱阵列 2 次，替换掉甲醛溶液。</li>
	<li>用染色液（含 0.05% 考马斯亮蓝，溶剂为 50% 水、40% 乙醇和 10% 乙酸）染色约 90 秒。用 1&#160;ml 无菌去离子水洗涤 2 次，去除多余的染色液。向微柱阵列中加入 1 ml 去离子水。</li>
	<li>使用光学显微镜检查染色结果。若细胞体过浅难以观察，需重复染色步骤。</li>
	<li>将带有染色细胞的微柱阵列置于 4 °C 冰箱中保存，并确保始终浸没在水中。</li>
</ol>
3. 细胞成像
注意：步骤 4 仅适用于不带无限远校正光学系统的显微镜。
<ol>
	<li>向带有薄玻璃底的培养皿中加入 2 ml 去离子水，用于高分辨率成像。</li>
	<li>使用镊子将微柱阵列转移至成像培养皿中，确保微柱朝上。</li>
	<li>将成像用培养皿置于光学显微镜的可移动载物台上。</li>
	<li>旋转用于成像的物镜上的补偿环，直至刻度上的数值表示光路中所有材料的总厚度，以补偿玻璃基底、硅胶弹性体和上方液体之间折射率的不匹配。这将使微柱核心呈现明亮的外观。</li>
	<li>将照明侧的虹膜光圈关闭至50%，并从光路中移除所有相差环，以启用普通的明场模式。</li>
	<li>将微柱阵列调整至微柱在观察视野中呈水平直线排列。定义一个起始点（例如， 左上角）并逐步移动培养皿，跨过载物台扫描微柱阵列，同时采集多张图像。</li>
	<li>使用20倍或40倍物镜，并将相机分辨率设置为最高，拍摄所有图像。确保图像中心包含一个单独的细胞。</li>
	<li>沿 z 轴方向扫描基底，直至显微镜下微柱顶端清晰对焦。使用显微镜的微调焦旋钮，继续向微柱底部对焦方向转动约 2–3 µm。</li>
	<li>通过一次改变一个成像参数，对一个阵列区域拍摄一系列测试图像，建立标准成像流程。例如， 曝光时间，光圈设置，光源设置 等等。）使用MechProfiler分析图像，并确定适用于快速且可靠分析的合适参数集。</li>
</ol>
4. 使用开源软件“MechProfiler”进行图像分析
注意：所有软件功能均可使用指向设备通过鼠标左键激活。然而，经过训练的操作员将使用设计在键盘左半部分的记录快捷键，以实现高效的双手图像处理。
<ol>
	<li>启动图像分析软件MechProfiler，通过点击“Open”打开一系列需要分析的图像。</li>
	<li>将所有参数插入软件开发者提供的“设置”部分。确定必须自定义配置的参数（即， 轮廓阈值和最小距离）根据软件手册中详细描述的步骤进行设置。</li>
	<li>使用“裁剪”功能（按住鼠标左键并拖动）将图像逐个裁剪至目标区域。在绘制的矩形框内双击以完成此操作。</li>
	<li>逐个点击“绘制细胞轮廓”，使用十字光标绘制每个可见的细胞边界，确保包含该细胞所附着的所有微柱。</li>
	<li>单击“丢弃微柱”以移除不需要的微柱，并使用十字光标进行绘制。圈选所有属于图像区域外细胞的微柱，或因其他原因发生偏转但并非由目标细胞引起的微柱。</li>
	<li>单击鼠标启动“Find Centroids”软件子程序。调节“Find Centroids”按钮旁边的滤波器设置，直至所有微柱均被识别，识别结果以微柱中心出现红色十字为准。若滤波器设置过低，部分微柱将被忽略；若设置过高，则单个微柱可能被标记多个位置。在一次分析过程中，滤波器设置应保持恒定。</li>
	<li>使用“手动编辑”功能对具有多个或遗漏微柱位置的质心进行修正。使用鼠标十字光标点击并拖动以选中待处理的微柱。在矩形区域内双击，并在放大的图像区域中放置缺失的红色标记，该窗口将自动关闭。若该微柱位于所绘制的细胞轮廓之外（参见步骤4.5），则在继续操作前将其舍弃。</li>
	<li>通过单击鼠标激活“生成网格”功能，找到理想的微柱阵列。确保其位置与绘制的细胞轮廓内由蓝色环显示的真实微柱头部位置相对应。</li>
	<li>根据需要，使用鼠标点击相应的“手动编辑”功能，校正细胞区域内错位的网格标记。使用十字准线点击并拖动以选中相关微柱。在弹出的矩形区域内双击，在放大的图像区域中放置缺失的蓝色标记，该窗口将自动关闭。</li>
	<li>单击“计算偏转”按钮，根据微柱在图像区域内的实际位置与生成的理想网格之间的差异，获得计算所得偏转值的直方图。</li>
	<li>通过单击“Save”保存完整的分析结果，包括数值表格。</li>
	<li>继续图像分析，可通过点击“Reset View”以分析另一图像区域，或用鼠标点击“Next Image”，也可直接使用键盘右侧光标键便捷完成此操作。</li>
</ol>
5. 数据分析——力学表征
<ol>
	<li>使用办公电子表格程序打开包含已分析图像的文件夹中的“results.xls”文件。该文件包含所有计算结果的数据，包括所有微柱偏转值以及功等标准导出参数即， 被分析细胞的底物形变能</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, R. I., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biomechanical+gradients+for+directed+bone+marrow+stromal+cell+differentiation+toward+tendon+and+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone.</a> Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).</li>
<li>Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+and+biophysics+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomechanics and biophysics of cancer cells.</a> Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).</li>
<li>Bartalena, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+assessing+adherent+single-cell+stiffness+in+tension%3A+design+and+testing+of+a+substrate-based+live+cell+functional+imaging+device%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device.</a> Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).</li>
<li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+An+approach+to+isolate+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li>
<li>Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+Temperature+Operable+Autonomously+Moving+Bio-Microrobot+Powered+by+Insect+Dorsal+Vessel+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue.</a> PloS ONE. 7 (7), (2012).</li>
<li>Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+retraction+of+bundled+type+IV+pili+enables+nanonewton+force+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biology%22%5BJournal%5D)">Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation.</a> Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).</li>
<li>Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Chemo-Mechanical+Effects+of+an+Anti-Cancer+Drug+Emodin+on+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).</li>
<li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Cellular+Traction+Forces+by+Micropillar+Arrays%3A+Contribution+of+Substrate+Warping+to+Pillar+Deflection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection.</a> Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li>
<li>Lemmon, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface%3A+Enhanced+Analysis+for+Microfabricated+Post+Array+Detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Chem+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).</li>
<li>Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+subcellular+measurement+of+cell+stiffness+using+a+microengineered+stretchable+micropost+array+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol-UK%22%5BJournal%5D)">Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane.</a> Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).</li>
<li>Roure, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+mapping+in+epithelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Force mapping in epithelial cell migration.</a> PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).</li>
<li>Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+role+of+material+surface+topography+and+wettability+on+cell-material+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions.</a> Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).</li>
<li>Badique, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+nuclear+deformation+on+micropillared+surfaces+by+substrate+geometry+and+cytoskeleton+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization.</a> Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).</li>
<li>Sniadecki, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+microposts+as+an+approach+to+apply+forces+to+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells.</a> PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).</li>
<li>Weng, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silicone-based+stretchable+micropost+array+membrane+for+monitoring+live-cell+subcellular+cytoskeletal+response%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response.</a> Lab Chip. 12, 731-740 (2012).</li>
<li>Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Post-Array-Detectors+%28mPADs%29%3A+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> J Vis Exp. (8), e311(2007).</li>
<li>Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+stem+cell+mechanobiology+on+microfabricated+elastomeric+substrates+with+geometrically+modulated+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity.</a> Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).</li>
<li>Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Micropatterning in Cell Biology.</a> Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).</li>
</ol>

第一作者（NG）是MicroDuits GmbH的联合创始人，该公司是本研究中所用微柱阵列的商业供应商。其他作者均无与此工作相关的潜在利益冲突。

本研究旨在通过显著降低技术与实践门槛，推动牵引力显微镜领域的发展。这些障碍主要来自两个方面。首先是必须克服的诸多非平凡技术挑战，以实现微柱阵列的可重复制造与实验部署。其次同样具有挑战性的是，需要对单细胞受力进行可靠且半自动化的分析——需注意，典型的实验可能需要分析数百甚至数千个细胞。上述技术的开发旨在使无驻场工程专业知识的细胞生物学实验室也能便捷地开展基于微柱的牵引力显微镜研究。本文介绍的传感器与分析方法可使非专业人员能够快速而准确地分析单个细胞所施加的力。

除了需要进入配备至少一台中档明场显微镜的细胞生物学实验室外，所述方法几乎不需要其他复杂的技术设备。即使用户经验有限，也能开展有效的牵引力显微镜实验，尽管该技术功能强大且用途广泛。然而，在本实验方案中有三个关键方面必须加以注意。首先，必须确保微柱阵列始终被液体覆盖，以避免因毛细作用力导致微柱塌陷。其次，需要优化微柱图像的成像参数，最佳做法是在同一阵列位置上连续采集多幅图像，同时调整曝光时间、光圈大小和补偿环位置。找到微柱顶端的正确焦平面至关重要，考虑到传感器阵列的轴向尺寸极小，这一点需要一定的操作经验。第三，用户...

力敏型细胞实验可用于研究贴壁细胞，其应用范围广泛，反映了力学因素在细胞生物学中的核心作用。这些应用通常聚焦于驱动亚细胞过程或整个细胞行为的潜在机制。一方面，外部环境因素（如细胞外基质的成分或基质刚度）可显著影响细胞的力学和生物学响应1。在使用多种药理活性化合物后，也可观察到类似现象，其效应通常通过细胞培养模型进行表征2。另一方面，基因型特性（如由自发或实验诱导的基因突变引起的变化）可导致细胞表型发生显著改变，这些改变常与细胞骨架结构和功能的异常相关3。上述例子仅仅是细胞力学表型分析相关研究主题中的一小部分，而这些主题均已成功地利用微柱阵列进行过有效研究。
截至目前，已有约200篇文章发表，描述了细胞与微柱之间的相互作用。这些研究既探讨了微柱弯曲原理的理论方面，也提供了其制造过程中的实际操作指导。首篇描述细胞与柔性微柱阵列相互作用的文章由Tan及其同事于2003年发表4。与传统的牵引力显微镜技术（TFM）不同，后者使用连续的软基底来估算纳米牛顿量级的细胞收缩力，而Tan 等则提出了一种方法，采用多个由硅酮弹性体制成的紧密排列的垂直微梁结构。该技术的主要优势源于两个关键特征：首先，为了改变细胞所感知的基底刚度，只需调整微柱的几何尺寸，同时保持基底材料组成不变，从而避免了表面拓扑结构和化学性质的差异；其次，微柱可作为独立的弹簧单元，能够以单个黏着斑级别的力和空间分辨率进行离散化分析，从而降低了传统TFM类似分析中固有的复杂性。
如今，微柱阵列的应用范围已远不止于少数单细胞的力图谱绘制。例如，Akiyama 报道了利用天蛾幼虫的分离背血管组织作为微柱阵列的驱动器，以开发由昆虫肌肉驱动的自主型微型机器人5。
然而，大多数已发表的微柱应用研究集中于感染或癌症等医学领域。例如，已有研究利用微柱阵列来分析淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoea）菌落中成束的IV型菌毛所产生的力学特性，这种力学作用与增强感染的信号级联反应相关6。此外，其他研究者也采用微柱技术研究经细胞骨架靶向药物处理后的乳腺癌细胞7。
微柱的偏转通常采用经典悬臂梁理论进行描述，假设细胞仅附着在微柱的最顶端，并承受末端载荷。此处引起偏转量 δ 的施加力 F 取决于微柱的“弯曲刚度” k，其计算公式如下：
<img alt="静态平衡物理公式语境下的胡克定律方程 F=kδ。" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> (1)
其中E、I和L分别为杨氏模量、截面惯性矩和梁的长度。然而，该方程的结果仅能对作用力提供粗略估算，因为未考虑梁的剪切与弯曲以及基底翘曲等因素。鉴于微柱通常由聚二甲基硅氧烷（PDMS）基硅橡胶等软材料制成，这些因素必须予以考虑。Schoen 等 证明了存在一个基于微柱长径比（L/D）和相应聚合物泊松比的校正因子 v.8 由以下公式给出：
<img alt="静力平衡方程示意图，ΣFx=0；含变量的结构分析概念。" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 2"> (2)
其中 Ttilt(v) 为包含拟合参数 a = 1.3 的倾斜系数，该参数可在同一篇文章中找到：
<img alt="弹性方程，T_mr(ν)，力学中的公式，与应力-应变分析相关。" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 3"> (3)
这意味着微柱的校正刚度 kcorr 等于纯弯曲刚度 k=kbend 与校正因子 corr 的乘积，其中校正因子由以下公式给出：
<img alt="用于速率常数校正的化学动力学方程；涉及反应变量的公式。" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 4"> (4)
因此，细胞力的计算应使用经过进一步改进的公式（1）变体，其表达式如下：
<img alt="静力平衡方程：F=-kcorrδ；力与位移相关性的数学表达式。" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 5"> (5)
一旦使用微柱结构的典型尺寸参数，校正的影响就变得更加明显。例如，对于由基于PDMS的硅橡胶制成、长度为15微米、横截面为圆形且直径为5 µm的微柱，其校正因子为0.77，因此未经校正的计算会将细胞施加的力高估23%。对于长径比较小的微柱，这种偏差更为严重。
传统上，微柱图像分析也基于理想化的梁弯曲理论。2005年，率先使用微柱阵列的研究团队发布了一款适用于微柱分析的图像分析软件9。该软件需要软件许可证，用户必须对每个位置采集三幅图像：透射模式下微柱顶部和底部平面各一幅，以及染色细胞的荧光模式图像一幅。通过比较每个微柱的顶部和底部位置，该软件可确定力矢量场，并计算每根微柱受力等相关参数。目前还存在其他软件包，其分析原理在描述这些软件的相关文章中略有提及，但这些分析软件通常并未公开提供10,11。
用于绘制细胞受力图的微柱阵列可分为正交微柱排列和六边形微柱排列，其中后者的优势在于所有相邻微柱之间的间距相等。典型的微柱具有圆形横截面，其尺寸直径范围为 1.0 µm 至 10 µm，长度范围为 2 至 50 µm。4 然而，也已有具有椭圆形或方形横截面的微柱的报道。12,13
使用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的硅胶混合物作为微柱材料，可将纳米颗粒添加到混合物中。例如，加入钴纳米棒可实现微柱的磁性激活，从而为潜在的实验设计提供更多自由度。14 大多数研究团队在平坦的刚性基底（如盖玻片）或培养皿内部制备微柱阵列。然而，Mann 及其同事最近报道了一种在可拉伸膜上形成的微柱阵列。15 这种设计可在研究贴壁细胞的活细胞亚细胞动态响应（如细胞收缩力）的同时，对细胞施加拉伸力。
目前广泛使用且最为成熟的微柱阵列制备方法基于软光刻技术，如Sniadecki及其同事在深入的实验方案中所述16-18。简而言之，采用标准的洁净室工艺，利用SU8光刻胶在硅片表面加工出微结构。随后通过复制工艺，将硅橡胶浇铸于这些结构之上，从而形成模具。在第二步中，这些模具被用于在选定的基底上再次使用硅橡胶复制原始的微结构。然而，尽管相关应用的研究论文数量众多且持续增长，但对于微加工领域的专家而言，建立一套稳定的微柱制备工艺仍需耗费大量时间；该过程中有许多步骤需要针对特定的实验室环境和微柱布局进行优化与调整，才能达到可接受的质量水平。
商用微柱阵列现已以即用型（“即取即用”）形式提供，具有稳定且高质量的特点。因此，它们可作为现场生产所需复杂且耗时的制造工艺的替代方案。本文使用一种市售的微柱阵列，通过单幅明场显微图像来绘制细胞力学力分布图。更重要的是，本文介绍并记录了一款功能完整的开源软件MechProfiler，该软件可作为本论文的补充材料下载。该软件的持续维护版本也可在http://www.orthobiomech.ethz.ch获取。
将现成的检测方法与兼容的开源分析软件相结合，显著降低了开展精确牵引力显微镜（TFM）实验的门槛。即使研究人员无法使用洁净室设备或不具备软件开发专业知识，也能成功分析细胞受力。该方法使用户能够专注于力敏性检测的结果，而非技术本身，从而使牵引力测量技术惠及更广泛的研究群体。此外，这也是迈向微柱阵列全自动筛选的重要一步。
MechProfiler 分析软件可处理 tiff、png、bmp 和 jpg 格式的图像文件。图像可通过荧光、相差或明场光学显微镜获取。该独立程序需与免费的 Matlab 编译器运行时（可在：图 12 获取）配合使用，其底层算法支持高效的图像处理，使用户能够在约 1 分钟内完成单个或多个细胞图像的处理。此外，这些细胞可以是活细胞，也可以是“固定”后的细胞。
MechProfiler 软件能够通过利用高质量商用微柱阵列的可重复性，显著提高数据分析通量；更具体而言，可以假设阵列中每根微柱的默认“未偏转”位置位于理想网格之上（本研究中所用阵列的网格制造偏差小于 100 nm）。
简而言之，操作流程包括打开一系列图像文件进行分析，将图像裁剪至感兴趣区域，定义被细胞覆盖的柱状结构或需剔除的柱状结构，确定柱状结构的位置，计算相对于理想网格的偏转/受力情况，最后保存所有与细胞相关的数据，并支持导出，包括导出至标准办公电子表格格式。

<table><tbody><tr><td>T25 细胞培养瓶</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>1× PBS 缓冲液</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>培养基 DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>南美来源胎牛血清（FBS）</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100×</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胶原 I/纤连蛋白预包被微柱阵列</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td><td>微柱尺寸：&amp;Oslash;=6.4&amp;#160;&amp;micro;m，l=18.2 &amp;micro;m；网格间距=13 &amp;micro;m，k&lt;sub&gt;corr&lt;/sub&gt;=2.87&amp;#160;nN/&amp;micro;m</td></tr><tr><td>无水乙醇 p.A.</td><td>Merck</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Nunc</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液 10%</td><td>Sigma</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>亮蓝 G-250</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td>考马斯亮蓝</td></tr><tr><td>甲醇 ACS p.A.</td><td>Merck</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>WillCo Wells BV</td><td>GWSb-3522</td><td>直径 35 mm，孔径 22&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>T-100 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>倒置显微镜</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>相机控制器</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>Nikon</td><td></td><td>相机</td></tr></tbody></table>

微柱阵列上简便而精确的力学表征

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

集成柔性微柱的细胞培养基底可使研究人员研究细胞与其周围微环境之间的力学相互作用，尤其关注细胞与基底之间的相互作用。目前，微柱阵列技术已发展成熟，过去十年中已发表大量相关应用。然而，由于微柱制备过程耗时且技术难度较高，同时缺乏易于使用的软件来分析细胞与微柱相互作用的图像，生物学家对该技术的采用仍持保留态度。
微柱产生的力信号读取出人意料地简便。微柱的作用类似于弹簧，细胞理想情况下附着在其顶端。根据细胞大小，细胞通过一个或多个局灶性黏附点将其细胞骨架产生的力传递至微柱，从而导致微柱发生偏转。偏转程度与所施加力的方向和大小直接相关。细胞覆盖的微柱数量以及微柱偏转模式具有特征性，可据此确定每根微柱受力等数值，以及多种具有生物学意义的参数，从而实现对细胞表型的“力学特性分析”（mechano-profiling）。
本文介绍了一种便捷的机械性能分析方法，该方法结合了第一代即用型市售微柱阵列与本实验室开发的软件包，该软件现已向所有研究人员开放。作为典型应用的示例，采用明场显微镜拍摄骨癌细胞的单张图像，用于转移性细胞系模型的机械性能分析。这种商业化的牵引力传感器与开源分析软件的结合，首次使得非专业用户能够快速将微柱阵列技术应用于常规实验工作。此外，该方法具备稳健且流程化的分析过程，使用户能够以高度高效的时间利用率分析大量微柱图像。

所述技术的主要优势在于其简便性以及能够快速有效地整合到常规实验室工作中的潜力。高质量的商用传感器阵列与开源软件相结合，可提供有关机械敏感性的信息，而这些信息原本需要洁净室设施以及图像分析和软件开发方面的深入知识才能获得。图1展示了本方法的工作流程。首先将细胞接种并培养在微柱阵列上，固定并染色后，微柱阵列即可用于成像。该技术的核心部分是使用MechProfiler软件进行图像分析。用户只需在图形用户界面（GUI）的“设置”中输入所有相关参数，即可立即开始分析图像。对应的像素尺寸是指单个像素所代表的实际长度，其值取决于用户的实验装置。对于每种使用的放大倍数，需通过拍摄已知尺寸物体的图像来单独确定该参数。补充材料中的图9给出了一个示例。
图像质量是一个关键因素，因为它会显著影响分析过程。为了获得最高质量的图像，应确保使用稳定且定期维护的成像平台，如图2所示。特别是光源的对准非常重要，因为未对准会导致产生不希望的阴影，这在图像分析时可能带来问题。此外，在大多数实验室中，将光学显微镜放置在防...

本文描述了用于量化贴壁细胞与微结构基底之间机械相互作用的实验方案。这些相互作用与细胞迁移、增殖、分化和凋亡等基本细胞行为密切相关。本方案介绍了一款名为 MechProfiler 的开源图像分析软件，该软件可实现对每个微柱所受作用力的测定。

集成柔性微柱的细胞培养基底可使研究人员研究细胞与其周围微环境之间的力学相互作用……

该技术的总体目标是利用标准光学显微镜，通过可视化单个细胞与其基底相互作用所产生的力，获取分离单细胞的力学-生物学相关特性。本方法是一种适用于力学生物学的平台技术，有助于研究癌症领域的关键科学问题，例如细胞收缩在癌细胞转移过程中的作用。该技术的主要优势在于，它能够稳健地提取神经生物学信息，且对用户培训要求较低。该方法与标准光学显微镜兼容，并适用于高通量分析。第三，该方法可揭示人类骨癌细胞的力学生物学特性。它还可应用于自动细胞类型，如平滑肌细胞或心肌细胞。首先将玻璃基底放置好，使微柱阵列朝上，置于12孔板的孔中，然后间接加入一毫升99%乙醇至孔内，使基底被覆盖。确保在任何液体操作步骤中均无气泡形成，并且微柱阵列始终被一层薄液覆盖。然后在室温下孵育芯片20至30秒，再沿孔壁加入1毫升无菌去离子水。待其与乙醇混合后，从孔中吸取约1毫升乙醇溶液，并额外加入1毫升去离子水。重复此过程至少三次，以充分润湿样本。接下来，以相同方式将孔中的去离子水替换为 PBS，每次加入约一毫升，随后吸出，重复此操作三次。然后使用相同步骤将 PBS 替换为培养基。当阵列被约一毫升培养基覆盖后，用移液器将一毫升培养基中含有 25,000 个目标细胞的悬液加入含有预制微柱阵列的孔中。然后封闭多孔板并将其转移至37°C、5%二氧化碳的培养箱中。让细胞在微柱顶部贴附并生长6至7小时，期间观察贴附过程。偶尔使用光学显微镜观察，吸去孔中的培养基，随后用1毫升PBS洗涤细胞两次。用 PBS 清洗时应施加轻柔的力度，以去除孵育过程中在微柱阵列上积聚的细胞碎片，并去除死细胞。接着，加入 0.5 毫升 3.7% 缓冲甲醛溶液，固定细胞 5 分钟。然后移除甲醛溶液，并用 1 毫升无菌去离子水将微柱阵列清洗两次。每次洗涤时，将固定后的细胞浸入含有0.05%考马斯亮蓝染料的溶液中，该溶液由50%水、40%乙醇和10%乙酸组成，染色约90秒，随后用一毫升无菌去离子水冲洗两次，以去除多余的染色液。然后向微柱阵列中加入一毫升去离子水，并在光学显微镜下观察染色结果。首先，使用镊子向底部带有薄层玻璃的培养皿中加入两毫升去离子水，再将微柱阵列从12孔板转移至成像用培养皿中，确保微柱朝上。然后将成像用培养皿置于光学显微镜的可移动载物台上。如果显微镜光学系统未进行无限远校正，请调节成像物镜的补偿环，使刻度上的数值对应光学路径中所有材料的总厚度。接下来，从光路中移除所有相差环，以启用常规明场模式，然后将照明侧的孔径光阑缩小至50%。调整培养皿的位置，使阵列中的微柱在观察视野中呈水平或垂直排列。从左上角定义一个起点，逐步移动培养皿穿过载物台。使用20倍或40倍物镜拍摄大量高分辨率图像的同时，扫描微柱阵列。每个新位置处的图像中心应包含单个细胞。从微柱底部沿ZX方向向微柱顶端扫描，直至顶端清晰对焦，使用显微镜的微调旋钮进行调节。然后将焦平面从顶端位置向微柱底部方向降低两到三微米。首先，加载软件 mec 和 profiler，然后通过点击“打开”并选择图像，载入一系列需要分析的图片。接下来，进入设置部分，按照软件手册的说明输入相应参数。随后，逐一对图像进行分析。首先选择裁剪按钮，然后单击并拖动鼠标，在目标区域周围绘制一个矩形轮廓。完成后，在所绘制的矩形内部双击以结束操作。接下来，选择“绘制细胞轮廓”工具，并使用十字光标在图像中可见细胞所覆盖的所有微柱周围绘制轮廓。单击以丢弃不需要的微柱结构，并使用十字光标进行绘制。然后框选所有位于图像区域之外或因其他原因发生偏转的微柱结构，但不要包含目标细胞内的微柱。接着，单击“查找 OIDs”以启动软件子程序。调整“查找 OIDs”按钮旁边的滤镜设置，直到所有微柱均被识别，其位置中心会显示一个红色十字标记。如果出现多个或遗漏的微柱位置，请点击“手动编辑”进入手动编辑功能，使用鼠标十字准星选择相应微柱。在矩形区域内双击，在放大后的图像部分放置一个单独的红色标记，标记完成后窗口将自动关闭。通过单击鼠标激活生成网格功能，找到理想的微柱网格。确保网格位置与绘制的细胞轮廓线内蓝色环所示的真实微柱头部位置相对应。随后，根据需要校正细胞区域内任何错位的网格标记。使用鼠标点击相应的手动编辑功能，通过点击并拖动十字准线来选择微柱位置问题。在出现的矩形区域内双击，并在放大的图像区域中放置校正后的蓝色标记，该窗口将自动关闭。然后点击“计算偏移”以获得偏移值的直方图，该直方图基于图像区域内微柱位置与生成的理想网格之间的差异计算得出。最后，保存完整的分析结果，包括数值表格。可通过单击“重置视图”来分析另一幅图像区域，或单击“下一张图像”继续进行图像分析。此处展示的是对两种骨癌细胞系进行微环境分析的示例：Q oh nine细胞，其转移潜能较低，而M 132细胞则具有高度转移性，两种细胞均来自同一批次生产的培养皿中培养。通过分类力值可以发现，Q oh nine细胞在其附着点施加的力通常大于高转移性细胞。就细胞面积而言，与M 132细胞相比，huo nine细胞的单个细胞平均受力更高。此外，随着细胞铺展，每个微柱上的平均受力随之增加，直至每个微柱的平均受力达到一个更稳定的状态。除了形态学上的差异外，还可以对形态变异进行量化分析，从而获得有趣的结果。例如，与具有高度转移性的 M 132 细胞相比（这类细胞倾向于占据较少的微柱），HU oh nine 细胞在微柱覆盖方面表现出更为异质的特征。简而言之，亲本细胞系 HU oh nine 的Meno图谱显示，它们通常覆盖更大的面积，并对微柱施加略高的作用力。而转移性细胞系 M 132 和侵袭性细胞类型通常覆盖的微柱较少，且每个微柱所施加的力也较小。在执行此操作时，务必注意用移液器非常小心地操作，切勿直接将液体加在微柱阵列上。应避免引入任何气泡，因为气泡会导致微柱塌陷。观看本视频后，您应能充分了解如何结合使用微柱阵列以及我们的网格分析软件，从分离的单个细胞中提取单细胞生物学信息。祝您获得理想的实验结果。

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