基于微移液管的多功能方法用于在液滴界面双层膜中整合并刺激细菌机械敏感性离子通道

本实验的总体目标是将梅斯卡通道功能性地重构到液滴界面双层体系中，并研究这些机械敏感性通道对谐波机械刺激的响应。该方法能够在将V23T梅斯卡突变体重构至液滴界面双层体系后，研究其在谐波机械激发下的机电活性。该技术的主要优势在于结合了膜片钳技术和液滴界面双层法的技术优点，既可实现微型化，又能独立控制膜两侧的化学组成。

配制脂质体时，取20毫克以冻干粉形式购买的D-P-H-P-C合成脂质，加入10毫升氯化钾缓冲液，制备成10毫升浓度为2毫克/毫升的脂质溶液。确保脂质载体和缓冲液充分混合。当所有成分完全溶解后，溶液应呈现均匀且略显浑浊的外观。

现在将混合物在零下20摄氏度冷冻，随后完全解冻新的脂质混合物，让混合物在室温下解冻，切勿在加热环境中解冻。经过总共六次冻融循环后，使用市售的挤出器对脂质进行挤出，先将整个脂质悬浮液通过一个0.4微米的聚碳酸酯膜滤器，然后通过0.1微米膜滤器挤压六次。此过程可获得直径接近100纳米的颗粒。

制造油藏时，通过一个直径为两英寸、长1.5厘米的亚克力圆柱体的侧壁钻两个相对的孔。孔的直径应为1毫米，距离底部1厘米。然后以先前钻好的1毫米孔为中心，再钻两个直径为4毫米的孔。

每个孔的深度应为一毫米。注意不要将孔完全钻透。这些孔用于安装橡胶垫圈。

将两个内径为1毫米的橡胶垫圈放入较大的孔中并用胶固定，以防止油泄漏。然后在实验当天，使用任意多用途环氧树脂将装置粘接到一块10厘米×10厘米的薄丙烯酸板上，剪取一段7厘米长、直径为250微米的银丝，并将其末端浸入漂白剂中两小时。形成氯化银涂层：出现灰色表明已形成氯化银涂层。

使用玻璃切割器将一根长10厘米、外径1毫米、内径0.58毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管切成两段，每段5厘米长。使用带18号钝头针的一毫升注射器，将聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG-DMA）水凝胶注入毛细管中，以防止水合后的水凝胶从毛细管中膨胀溢出。毛细管两端需预留3毫米的空隙，并确保毛细管内无气泡。

将银/氯化银电极插入充满水凝胶的毛细管中。在法拉第笼内进行实验设置，法拉第笼接地并连接至膜片钳放大器的接地端；使用紫外点光源，在1瓦功率下照射2分钟，通过自由基光聚合使PEG-DMA水凝胶固化。将其中一支微移液管连接至带有公头连接器的直型微电极夹持器上。

然后将微电极夹持器连接到膜片钳放大器的前置放大头级。将头级接地时，需将一根18号绝缘铜线焊接到与头级相匹配的连接器上，再将头级安装到三轴手动显微操作器上：首先将头级安装板固定到显微操作器上，然后将头级连接至安装板。使用合适的螺丝，通过自制连接器将第二根微移液管连接至线性驱动器，然后将两者共同安装到第二个显微操作器上。

微量移液器应相对放置，对齐并保持水平。接下来，在玻璃小瓶中将0.1毫升D-P-H-P-C脂质体与0.01毫升V 23 T mescal蛋白脂质体溶液混合。使用34号微填充针头，将蛋白脂质体溶液注入两支微量移液器的尖端。

将储液池放置在直立显微镜顶部，并将微移液管穿过相对的1毫米孔。然后用十六烷填充储液池至液面，使微移液管尖端形成球形液滴。使用安装在第三个显微操作器上的第三根直径为10微米的硼硅酸盐玻璃微移液管，在微移液管尖端施加稀释的V 23 T mescal蛋白脂质体溶液，以形成液滴。

通过按需减小或增大体积来控制液滴的大小，并静置10分钟，使单层膜完全形成。随后将液滴通过层接触。组装将在一至两分钟内完成。

按照文本方案中所述设置好软件和设备后，使用 BNC 电缆将波形发生器的输出端连接到外部命令输入前端开关。向探头级发送一个 10 赫兹、500 毫伏峰峰值的三角波波形。使用显微操作器。

水平移动玻璃微移液管，使液滴相互接触直至轻微触碰，并等待双层膜变薄的发生。通过显微镜可直观观察双层膜形成过程的进展，并可通过电流测量进行监测。使用操纵器调节安装在驱动器上的液滴位置，将双层膜的直径调整至约250微米，双层膜的尺寸可通过显微镜进行目视估算。

双层膜形成并稳定后，使用信号发生器向双层膜中整合的仙人掌蛋白施加正弦信号以刺激液滴。向压电伺服控制器发送峰-峰值振幅为175微米、频率为0.2赫兹、占空比为50%的正弦波形。此处展示了一段典型实时电流记录。

测得的双层膜电容突然增加，表明双层膜变薄并形成，随后达到稳态。通过在机械刺激DIB时改变液滴位置，同时保持膜两侧的恒定直流电位，可实现对双层膜的控制。梅斯卡尔毒素V23T突变体产生可靠的活性，主要包括亚导通态，偶尔出现完全开放事件。

门控主要发生在最大压缩时，表明其与双分子层张力的增加有关，如极坐标图所示。此处强调了该技术用于检测其他类型生物分子的能力。Ethin 是一种电压门控离子通道，在施加直流跨膜电位后可增加膜的通透性。

如果操作得当，该技术可在两小时内完成。在进行此操作时，重要的是要记住避免意外折断玻璃毛细管等情形。一旦发生问题，必须重新搭建装置，并在后续操作前确保所有导线均已正确连接。

该技术为牵张激活通道领域的研究人员探索外部力如何传递至嵌入DIB（双层脂质膜）机制敏感通道门控的新方法铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过逐层方式形成液滴界面，在人工膜中整合机械敏感通道，并对这些通道进行机械刺激。