多功能，微管为基础的法团细菌机械敏感离子通道与刺激的液滴界面双层膜
November 19th, 2015
细菌机械敏感性通道可以用作生物分子器件mechanoelectrical换能器。液滴界面双层（的DIB），细胞启发积木这样的设备，代表新的平台，其中包含与刺激机械敏感通道。在这里，我们表现出成形的DIB，允许在机械刺激机械敏感性通道的研究的一个新的微管为基础的方法。
该程序的总体目标是在功能上将梅斯卡尔通道重构为液滴界面、双层系统，并检查这些机械敏感通道对谐波机械刺激的响应。该方法能够研究 V 23 T mescal 突变体在逐层重构为液滴界面后响应谐波机械激发的机械电活动。该技术的主要优点是它利用了膜片钳技术和层法液滴界面的技术优势，能够小型化以及控制膜每一侧的化学成分。
要配制脂质体，通过将 10 毫升氯化钾缓冲液添加到 20 毫克以冻干粉形式购买的 D-P-H-P-C 合成脂质中，制备 10 毫升每毫升 2 毫克脂质溶液。确保脂质载体和缓冲溶液充分混合。当所有东西都溶解时，混合物应该看起来均匀和朦胧。
将混合物在零下 20 摄氏度下冷冻，现在完全解冻新的脂质混合物，让混合物在室温下解冻，而不是在加热环境中解冻。在总共六次冻融循环后，使用市售的挤出机挤出脂质，方法是先迫使整个脂质悬浮液通过 0.4 微米聚碳酸酯膜过滤器，然后通过 0.1 微米膜过滤器六次。这个过程产生直径接近 100 纳米的颗粒。
要制造储油罐，请在直径为 2 英寸、长 1.5 厘米的亚克力圆柱体的壁上钻两个相对的孔。孔的直径应为 1 毫米，距底部 1 厘米。然后钻两个与之前钻出的 1 毫米孔同心的 4 毫米孔。
每个孔的深度应为 1 毫米。注意不要将它们完全钻穿。这些孔是为了配合橡胶垫圈而制作的。
在较大的孔中放置并粘合两个内径为 1 毫米的橡胶垫圈，以防止漏油。然后在实验当天使用任何多用途环氧树脂将机器粘在 10 厘米 x 10 厘米的薄丙烯酸板上，剪下 7 厘米长的 2 250 微米直径的银线，然后将它们的尖端浸入漂白剂中两个小时。要形成氯化银涂层，灰色表示已经形成氯化银涂层。
使用玻璃切割机将 10 厘米长的硅酸盐玻璃毛细管劈开，外径为 1 毫米，并将 58 毫米内径的毛细管分成两个 5 厘米的毛细管。使用带有 18 号钝头针头的 1 毫升注射器，用 P-E-G-D-M-A 水凝胶填充毛细血管，以防止水合水凝胶从毛细血管中膨胀出来。在尖端处保持 3 毫米的间隙，并确保毛细管中没有气泡。
将银、氯化银电极插入充满水凝胶的毛细管中。使用紫外线点以一瓦特的功率照射紫外线，通过自由基光聚合通过自由基光聚合固化 P-E-G-D-M-A 水凝胶，实验设置在接地到贴片放大器接地连接的法拉第笼下。将其中一个微量移液器连接到具有公连接器的直微量电极支架上。
然后将微电极支架连接到贴片放大器的头部tage。要将头部平台接地，请将 18 号绝缘铜线焊接到适合头部平台的连接器上，首先将头部平台安装板连接到微型机械手，然后将头部平台连接到安装板上，将头部平台安装在三轴手动微型机械手上。使用适当的螺钉，通过实验室制造的连接器将第二个微量移液器连接到线性执行器，然后将两者安装在第二个微米纵器上。
微量移液器应彼此相对、对齐并水平调平。接下来，在玻璃瓶中，将 0.1 毫升 D-P-H-P-C 脂质体与 0.01 毫升 V 23 T mescal 蛋白酶体溶液混合。使用 34 号微量填充针，用蛋白体溶液填充两个微量移液器的尖端。
将储液槽放在正置显微镜的顶部，然后将微量移液器送入相对的 1 毫米孔。然后用十六烷将储液槽填充到表面，以在微量移液管的尖端形成球形液滴。使用安装在第三个微米纵器上的第三个直径为 10 微米的硅酸盐玻璃微量移液器在微量移液器的尖端分配稀释的 V 23 T mescal protea 脂质体溶液并形成液滴。
根据需要通过减小或增加体积来控制液滴的大小，并让它们静置 10 分钟以使单层完全形成。然后逐层使液滴接触。形成将在一到两分钟内发生。
按照文本协议中的说明设置软件和设备后，使用 BNC 电缆将波形发生器的输出连接到外部命令输入前开关。将 10 赫兹、500 毫伏峰值峰值三角波形发送到头部级。使用 microm 机械手。
水平移动玻璃微量移液器，使液滴接触，直到它们稍微接触并等待双层变薄。双层形成过程的进展可以通过显微镜直观地看到，并且可以通过电流测量进行监测。通过使用机械手控制安装在致动器上的液滴的位置，将双层尺寸调整为直径约 250 微米，可以通过显微镜直观地估计双层尺寸。
一旦双层形成并稳定，使用函数发生器发送正弦信号来刺激双层中掺入的 mescal 蛋白，从而刺激液滴。将峰峰值幅度为 175 微米、频率为 0.2 赫兹、占空比为 50% 的正弦波形发送到 Pieto 电动服务器控制器。此处显示了非典型实时电流记录。
测得的双层电容突然增加，表明双层在达到稳态之前发生变薄和形成。当 DIB 受到机械刺激时，可以通过改变液滴位置来控制双层，同时保持整个膜上的恒定直流电位。梅斯卡尔的 V 23 T 突变体产生可靠的活性，主要包括亚导电状态和偶尔的完全开放事件。
门控主要发生在峰值压缩时，表明它与双层张力的增加有关，如极坐标图所示。在这里，这里强调了该技术用于测试其他类型生物分子的能力。Ethin 是一种电压门控离子通道，在应用 DC 跨膜电位 One master 时增加膜通透性。
如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住不要意外打破玻璃毛细管或其他情况。您必须重新启动设置并确保在开发后连接所有电线。
这项技术为拉伸激活通道领域的研究人员探索将外力传递到 DIB 嵌入式机构敏感通道的门口的新方法铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何分层形成液滴界面，在人工膜中加入机械敏感通道，并机械刺激这些通道有了很好的了解。
概述
本研究提出了一种基于微液滴管的方法，用于形成液滴界面双层膜（DIBs）以研究细菌机械敏感通道。该方法允许在机械刺激下检查这些通道，提供了对其机械电活动的洞察。
研究的关键组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 生物分子工程
背景
- 细菌机械敏感通道作为机械电转导器。
- 液滴界面双层膜（DIBs）是研究这些通道的创新平台。
- 了解这些通道对机械刺激的反应对于生物分子器件的开发至关重要。
- 将膜片钳技术与DIB方法相结合增强了实验能力。
研究目的
- 在DIB系统中功能性地重建机械敏感通道。
- 检查通道对谐波机械刺激的反应。
- 利用实验中的小型化和受控化学环境的优势。
使用的方法
- 脂质溶液的制备和脂质体挤出。
- 构建用于液滴形成的油储备。
- 形成氯化银电极用于电测量。
- 微液滴管设置用于液滴操作和双层膜的形成。
主要结果
- 成功形成稳定的液滴界面双层膜。
- 展示了能够用正弦信号刺激机械敏感通道的能力。
- 通过显微镜观察双层膜的形成和稳定性。
- 在机械刺激过程中定量测量电流反应。
结论
- 基于微液滴管的方法有效用于研究机械敏感通道。
- 该方法促进了对生物分子器件中机械电活动的探索。
- 未来的应用可能包括生物分子工程和器件设计的进步。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mechanosensitive ion channels such as MscL are critical for understanding membrane tension responses and serve as foundational elements for artificial membrane-based device development. This micropipette-based droplet interface bilayer (DIB) method enables precise functional reconstitution and stimulation of bacterial channels, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in membrane protein research. The platform's control over bilayer composition and mechanical stimulation enhances predictive confidence for downstream screening and translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mechanosensitive channel function under defined mechanical stimuli.
- Supports biological de-risking by isolating channel activity in controlled artificial membranes.
- Facilitates predictive confidence in membrane protein target validation for device and therapeutic research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated DIB systems for quantitative electrophysiological assays of channel activity.
- Standardizes bilayer formation and mechanical stimulation for reproducible screening workflows.
- Enables scalable evaluation of channel mutants and alternative membrane proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns artificial membrane models with disease-relevant mechanotransduction pathways when applicable.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical device prototyping.
- Supports risk-adjusted advancement of membrane protein-based biomolecular devices.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to assay development and preclinical device research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mechanosensitive channel gating and membrane tension response.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative current measurements for comparative analysis of channel variants.
- Analytics: Provides real-time electrophysiological readouts and bilayer tension estimates for robust data analysis.
- Translational Research: Bridges artificial membrane studies with potential device and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a multifunctional platform adaptable to various ion channels and membrane proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane protein research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of bilayer-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in early-stage membrane protein projects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of membrane protein targets and device concepts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, membrane biophysics, and micropipette manipulation.
- Needs specialized instrumentation including patch amplifiers, piezoelectric actuators, and microscopy.
- Demands rigorous cross-team standardization of bilayer formation and stimulation protocols.
- Adaptable to various channel types but may require optimization for different proteins or membrane compositions.
- Practical limitations include fragility of glass capillaries and setup complexity as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
Preparation of Liposomes
2:00
Manufacture of the Oil Reservoir and Preparation of Electrodes
4:06
Setting Up the Experiment
6:22
Formation of the Lipid Bilayer
7:49
Results: Bilayer Formation and Activation of MscL Channels in Response to Harmonic Mechanical Stimuli
8:59
Conclusion
