利用细菌叶片浸润实验精细表征植物防御反应 拟南芥-丁香假单胞菌 病理系统

本实验的总体目标是通过优化的注射渗透法，对拟南芥（Arabidopsis diliana）的免疫反应进行定量表征。首先，利用注射器渗透法将细菌通过叶片自然开口——气孔——人工导入叶片内部；第二步是在病害症状出现后，获取受感染的叶片组织圆片。

接下来，通过高通量均质化方法从叶片圆片中提取细菌。最后一步是进行系列稀释，并将样品点样到细菌计数平板上以统计菌落数量。最终，可通过每个叶片圆片内的细菌生长情况来评估植物免疫反应的相对强度。

该方法有助于回答植物免疫领域的关键科学问题，例如鉴定参与抵御生物胁迫防御反应的基因。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对感染植物组织中的病原菌生长进行精确量化，从而避免因采集不同发育阶段的叶片所导致的实验误差。该方法可揭示植物对毒性细菌病原体感染的免疫应答机制，也可应用于其他系统，例如水杨酸或微生物相关分子模式所触发的免疫反应研究。

通常，初次接触该方法的研究人员在将细菌注入叶片时会难以避免组织损伤。本视频中，将由本实验室的博士后学者Hindu以及研究生shalu和yali进行操作演示。此外，本视频还将演示增强疾病敏感性的检测方法。

实验前，准备 KB（King's B）培养基平板，按方案文本所述配制一升 KB 固体培养基，并将其置于磁力搅拌器上冷却。当培养基冷却至手触不烫时，向其中加入 80% 甘油、一摩尔硫酸镁和链霉素，然后倒入两种不同规格的 KB 培养基平板中。较小的培养皿用作细菌主培养平板，较大的培养皿用作细菌计数平板。

在检测划线前两天，将培养皿置于4°C保存。从–80°C甘油保存菌种中取细菌，在KB链霉素细菌培养平板上划线，于次日在28°C培养24至48小时。

在无菌试管中加入4毫升含50微克/毫升链霉素的液体KB培养基，启动液体培养。在28°C下以250转/分钟振荡培养过夜。实验所用拟南芥植株与液体细菌培养启动当日，按照方案文本中详述的条件进行培养。

用钝头且防水的记号笔标记第五和第六片叶片的叶缘，以便在取样时易于识别受感染的组织。为促进气孔的开放并利于病原体溶液进入叶片内部，将育苗盘从底部浸泡20分钟，使植株充分吸水。

20分钟后，倒掉多余的水分。在液体培养开始的第二天，对拟南芥植株进行感染处理。

将细菌培养物转移至1.5毫升微量离心管中，在9,600 ×g条件下离心2分钟。室温下弃去上清液，用1毫升无菌10毫摩尔氯化镁重悬细菌沉淀，然后在50毫升离心管中加入9毫升10毫摩尔氯化镁稀释菌液。测定细菌的光密度后，用10毫摩尔氯化镁将菌液稀释至终浓度OD600为0.0002。

进行 EDS 感染实验时，使用一种一毫升钝头无针注射器（通常称为胰岛素注射器）进行渗透。为在渗透过程中实现更好的控制，将稀释后的细菌溶液注入注射器至 0.5 至 0.6 毫升，切勿将注射器完全装满。

将叶片的下表面置于食指指尖，然后借助拇指轻轻调整叶片的位置。将注射器垂直对准叶片表面，以确保压力均匀分布，减少对叶片的损伤。在渗透过程中，应尽量避开主脉区域。

缓慢推动活塞，使菌液浸润进入叶片。当液体进入叶肉组织时，叶片颜色会变深，以此可观察到浸润过程；需浸润整个叶片表面，即使需要多次尝试也应完成。浸润完成后，用吸水纸轻轻按压叶片，吸去多余的病原菌溶液。

目视检查感病叶片组织的损伤情况。将接种后的植株静置干燥1至2小时，然后将植株放回原有的生长条件下。用水喷湿透明罩，覆盖感病植株2小时。

然后将培养皿盖打开一条两到三英寸的缝隙，形成开口，并在整个感染实验期间保持此状态，通常为三天。在定量病原体生长前一天，预先将150毫米×15毫米的KB培养基平板干燥。

将培养板在室温下放置约24小时以干燥。在感病基因型中，感染组织出现黄化现象表明硬化开始，此时应在此类组织坏死病斑形成之前处理感染组织。每种基因型准备六个研磨管。

在每个离心管中放入一个不锈钢研磨珠，并加入 500 微升无菌的 10 毫摩尔氯化镁溶液。接着，用镊子从植株上取下被感染的叶片，随机使用单孔打孔器打取叶盘，将来自两株不同植株的两个叶盘放入每个研磨管中。密封离心管，使用高通量匀浆仪在最大速度下匀浆组织 10 分钟。

如有需要，可重复此步骤，直至组织充分匀浆，且由于感病叶片释放叶绿素，溶液变为绿色。进行匀浆时，向96孔细胞培养板前六行的每个孔中加入180 µL 10 mmol/L氯化镁溶液。取20 µL研磨后的组织悬液加入96孔板第一行的每个孔中，并通过反复吹打液体使其充分混匀。

如果组织碎片堵塞了枪头，可剪去尖端2至3毫米，以帮助准确吸取溶液体积，并为平板顶部的液滴留出足够空间；将不同基因型的组织样品交替放置在不同的行中。进行十倍梯度稀释时，取20微升组织悬液转移至第二行，重复此操作直至完成第六次稀释。使用分装的移液枪头，将96孔板中的20微升溶液转移至150毫米×15毫米的KB平板上。

从最稀释的悬液开始操作，逐步至最浓的悬液，这样在稀释过程中无需更换移液器吸头。将培养皿盖子稍打开，在室温下干燥。当观察到培养皿表面无明显液体时，盖上盖子并倒置，于室温下孵育。

将平板孵育 40 至 60 小时，直至菌落可见。确认平板上的细菌符合预期的十倍梯度下降的菌落形成单位。

在细菌过度生长且菌落融合之前进行计数。确定最低稀释度下不重叠菌落的细菌数量。通常宜选择含有 10 到 50 个菌落的稀释度进行计数，该稀释度可能因技术重复而有所不同。

为计算细菌增殖水平，使用以下公式确定每片叶圆片的菌落形成单位数，其中 R 代表行数，T 代表每个技术重复中的细菌数量。随后利用该数据绘制图表。每个数据点表示六个技术重复的平均值，并以对数刻度呈现。

气棒表示平均增强病害的95%置信区间。通过接种OD600为0.0002的接种物，评估了对P-S-M-E-S 43 26的易感性。结果显示，高度敏感的NPR1-1突变体与野生型Columbia-0植株相比，病原菌生长量约高出2.5 log，即约300倍。

注射渗透实验可经过改良用于评估免疫反应的不同层次。为评价水杨酸诱导的免疫反应，可通过外源施加水杨酸钠来激活免疫反应，并通过病原菌的生长情况对其进行量化。NPR1基因的缺失会导致对水杨酸衍生物外源施加的不敏感，因为NPR1作为水杨酸受体，是水杨酸依赖性靶基因的主要转录共调节因子。

为了表征微生物相关分子模式诱导的免疫反应，植物经两种已知诱导物预处理。用FLAG22处理的野生型Columbia-0植株，其细菌种群数量减少了一个对数单位，即减少10倍；而FLS2突变体植株则无法触发对细菌生长的抑制效应。同样，EFR突变体植株对L18预处理无反应。

观看本视频后，您应充分了解如何通过注射渗透法测定阿拉伯芥的免疫反应。在进行该实验操作时，重要的是要持续监测病害发展情况，并在坏死症状出现后对组织进行取样。假单胞菌致病菌株 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 是一种半活体营养型病原菌。

因此，采样应在进入神经营养阶段之前进行。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如定量实时 PCR 和血液 Western 分析，以回答更多问题，例如具体是哪一条免疫信号通路受到干扰。请注意，你正在操作的是活体细菌。

尽管铜绿假单胞菌（Pseudomona Senge）对人类不具致病性，但在执行本实验操作时，请务必妥善处理被污染的耗材和受感染的植物。