利用细菌叶片浸润实验精细表征植物防御反应 拟南芥-丁香假单胞菌 病理系统

本实验的总体目标是通过优化的注射渗透法，对拟南芥（Arabidopsis diliana）的免疫反应进行定量表征。首先，利用注射器渗透法将细菌通过叶片表面自然存在的气孔人工导入叶片内部；第二步是在病害症状出现后，采集受感染的叶片组织圆片。

接下来，通过高通量均质化方法从叶片圆片中提取细菌。最后一步是进行系列稀释，并将样品点样到细菌计数平板上以统计菌落数量。最终，可通过每个叶片圆片内细菌的生长情况来评估植物免疫反应的相对强度。

该方法有助于回答植物免疫领域的关键问题，例如鉴定参与抵御生物胁迫防御反应的基因。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对感染植物组织中的病原菌生长进行精确定量，并有助于避免因选取不同发育阶段的叶片取样而造成的实验误差。该方法可揭示植物对毒性细菌病原体感染的免疫应答机制，也可应用于其他系统，如水杨酸或微生物相关分子模式所触发的免疫反应研究。

通常，初次接触该方法的研究人员在将细菌注入叶片时难以避免组织损伤。本视频中，将由我实验室的博士后学者 Hindu 以及研究生 shalu 和 yali 演示以下实验步骤。此外，本视频还将演示增强型疾病敏感性检测方法。

实验前，配制 KB 培养基平板：按照方案文本所述方法制备 1 升 KB 固体培养基，并将其置于磁力搅拌器上冷却。当培养基冷却至可触温度时，向其中加入 80% 甘油、1 摩尔硫酸镁和链霉素，然后倒入两种不同规格的 KB 培养基平板中。较小的培养皿用作细菌主培养平板，较大的培养皿用作细菌计数平板。

在检测划线前两天，将平板置于4 °C保存。从–80 °C甘油保藏菌种中取细菌接种于KB链霉素细菌培养平板，于次日在28 °C培养24至48小时。

在无菌试管中加入4 mL含50 µg/mL链霉素的液体KB培养基，启动液体培养物。在28°C条件下以250 RPM转速振荡培养过夜。实验所用拟南芥植株与液体细菌培养物启动当日，按照方案文本中详述的条件进行培养。

使用钝头防水标记笔标记第五和第六片叶片的叶缘，以便在取样时易于识别受感染的组织。为增强气孔的开放并促进病原体溶液进入叶片内部，将培养皿从底部浸润 20 分钟，使植株充分吸水。

20 分钟后，倒掉多余的水。在液体培养开始的第二天，对拟南芥植株进行感染。

将菌液转移至1.5毫升微量离心管中，在9,600 G下离心2分钟。室温条件下弃去上清液，用1毫升无菌10毫摩尔氯化镁重悬菌体沉淀，再将菌悬液转移至50毫升离心管中，加入9毫升10毫摩尔氯化镁稀释。测定菌液光密度后，用10毫摩尔氯化镁将菌液稀释至终浓度OD600为0.0002。

进行EDS感染实验时，使用一种一毫升无针头钝端注射器（通常称为胰岛素注射器）进行浸润。为在浸润过程中实现更好的控制，将稀释后的细菌溶液0.5至0.6毫升注入注射器中，切勿将注射器完全注满。

将叶片的下表面置于食指指尖上方，然后借助拇指轻轻调整叶片位置。将注射器垂直对准叶片表面，以确保压力均匀分布，减少对叶片的损伤。渗透过程中应尽量避开主脉区域。

缓慢推动注射器活塞，使细菌溶液渗入叶片。当液体进入叶片叶肉组织时，叶片颜色变深即可观察到渗透情况；即使需要多次尝试，也应完成整个叶面的渗透。渗透完成后，用吸水纸轻轻按压叶片，去除多余的病原体溶液。

目视检查受感染的叶片组织是否受损。将注射后的植株静置干燥一至两小时，然后放回原始生长条件。用水喷洒透明罩并覆盖感染植株，持续两小时。

然后将培养皿盖打开一条两到三英寸的缝隙，形成开口，并在整个感染实验的剩余时间内保持此状态，通常为三天。在定量病原菌生长前一天，将 150 毫米 × 15 毫米的 KB 培养基平板预先干燥。

将培养板在室温下放置约24小时以干燥。在感病基因型中，组织感染后出现硬化（表现为感染组织变黄）但尚未形成坏死病斑时，处理感染组织。每种基因型准备6个研磨管。

在每个离心管中放入一个不锈钢研磨珠，并加入 500 微升无菌的 10 毫摩尔氯化镁溶液。接着，用镊子从植株上取下被感染的叶片，随机使用单孔打孔器打取叶盘，将来自两株不同植株的两个叶盘放入每个研磨管中。密封离心管，使用高通量匀浆器以最大速度匀浆组织 10 分钟。

如有需要，可重复此步骤，直至组织充分匀浆，且在等待过程中由于感病叶片释放叶绿素，溶液变为绿色。进行匀浆时，向96孔细胞培养板前六行的每个孔中加入180 µL 10 mmol/L氯化镁溶液。取20 µL研磨后的组织悬液加入96孔板第一行的每个孔中，并通过反复吹打液体使其充分混匀。

如果组织碎片堵塞了枪头，可剪去尖端2至3毫米，以帮助吸取正确的溶液体积，并在培养板顶部留出足够的空间，使不同基因型的组织在交替的行中分布。为制备10倍系列稀释，将20 µL组织悬液转移至第二行，并重复此操作直至第六个稀释度。使用分装的移液器吸头，将96孔板中的20 µL溶液转移至150 mm × 15 mm的KB培养板上。

从最稀释的悬液开始操作，逐步至最浓的悬液，以便在稀释过程中无需更换移液器吸头。将培养皿盖子稍打开，在室温下干燥。当培养皿表面不再有可见液体时，盖上盖子并倒置，于室温下培养。

将培养皿孵育 40 至 60 小时，直至菌落可见。确认培养皿上的细菌表现出可预测的十倍递减规律。菌落形成单位数量下降。

在细菌过度生长和菌落融合之前进行计数。确定最低稀释度下无重叠菌落的细菌数量。通常宜选择含有10至50个菌落的稀释度进行计数，该稀释度可能因技术重复而有所不同。

为计算细菌增殖水平，使用以下公式确定每片叶盘的菌落形成单位数量，其中 R 代表行数，T 代表每个技术重复中的细菌数量。随后利用该数据绘制图表。每个数据点表示六个技术重复的平均值，采用对数刻度表示。

误差线表示平均增强病害的95%置信区间。通过接种OD600为0.0002的接种物评估对P-S-M-E-S 43 26的感病性。结果显示，高度敏感的NPR1-1突变体与野生型Columbia-0植株相比，病原菌生长量约增加2.5 log，即多出约300倍。

可通过修改注射渗透实验以评估免疫反应的不同层次。为评价水杨酸诱导的免疫反应，可外源施加水杨酸钠以激活免疫反应，并通过病原菌的生长情况进行量化。NPR1 基因的缺失会导致对水杨酸依赖性靶基因的转录共调控功能丧失，而 NPR1 作为水杨酸受体发挥关键作用，因此其突变体对外源施加的水杨酸衍生物表现出不敏感性。

为了表征微生物相关分子模式诱导的免疫反应，植物经两种已知诱导物预处理。用FLAG 22处理的野生型Columbia零号植株，其细菌种群数量减少了一个数量级，即减少10倍，而FLS2突变植株则无法触发对细菌生长的抑制效应。类似地，EFR突变植株对L 18预处理不敏感。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过注射器渗透法检测阿拉伯芥的免疫反应。在进行该实验时，重要的是要记住，在出现病斑后，需持续监测病害发展并取样组织。假单胞菌致病变种（Pseudomonas pathovar）S. phos 3, 2 6 是一种半活体营养型病原菌。

因此，采样应在进入神经营养阶段之前进行。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如实时定量PCR和血液Western分析，以回答更多问题，例如具体哪条免疫信号通路受到干扰。请勿忘记，您正在处理的是活体细菌。

尽管铜绿假单胞菌（Pseudomona Senge）对人类不具致病性，但在执行本实验操作时，请务必妥善处理受污染的耗材和感染的植物。