Name: 细菌性叶渗透试验使用的植物防御反应精细表征拟南芥，丁香假单胞菌病害系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 学习使用优化的注射渗透法在拟南芥叶片中定量分析丁香假单胞菌的生长，从而精确表征植物免疫反应的强度。该方法可应用于植物免疫学及作物抗病性研究。

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感谢Shahid Mukhtar博士对文稿的批评指正，以及Xinnian Dong博士提供的样本数据分析文件。本工作由美国国家科学基金会职业奖（NSF-CAREER，项目号IOS-1350244）和阿拉巴马大学伯明翰分校生物系资助。

以下文本描述了在拟南芥中进行优化的Psm ES4326 注射式渗入实验的逐步操作方案。该实验的主要步骤以简化的流程图表示（图1）。
1. 植物生长条件
<ol>
	<li>播种
	<ol>
		<li>准备2个花盆（直径4英寸&#160;，高3.75英寸&#160;），松散地装入土壤，并通过从底部浸泡过夜（O/N）的方式浇水，之后排去多余水分。</li>
		<li>使用折叠的70 mm称量纸或其他纸张，将50–100粒拟南芥种子（野生型Col-0或npr1-1突变体）播种于每个花盆中。</li>
		<li>用喷水后的透明罩盖住花盆，使相对湿度升至80–90%（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将花盆置于4 °C条件下孵育72小时，以完成充分的层积处理并实现同步萌发。</li>
	<li>将花盆转移至标准生长条件（12小时光照/12小时黑暗，21 °C，光照强度100 µmol/m2/sec，相对湿度40%），以促进种子萌发。转移至生长室后应立即在透明罩上开裂出一个2–3英寸&#160;的开口，以避免水分凝结。</li>
	<li>当第一片真叶长度达到2–3 mm时，将幼苗从花盆移栽至装有土壤的72孔育苗盘中。
	<ol>
		<li>用手指或1 ml&#160;移液器吸头在育苗盘土壤表面中央压出一个深约1英寸&#160;的凹坑。</li>
		<li>小心分离单株幼苗，尽量减少根部损伤。使用镊子小心夹取根系完整的幼苗。</li>
		<li>将单株分离的幼苗连同附着的土块一起放入凹坑中，以尽量减少移栽胁迫，然后轻轻压实周围土壤以填满凹坑。将多余的幼苗和土壤丢弃至生物危害废物容器中，并按照当地生物危害废物处理指南进行处置。</li>
		<li>从上方浇水，并用喷水后的透明罩完全覆盖育苗盘以维持80–90%的湿度。保持罩盖3天，第4天早晨将罩子开裂，当天结束前完全移除。 
		注：播种也可采用另一种方法：将种子在含有1 ml&#160;0.1%琼脂的1.5 ml&#160;离心管中于4 °C下层积48小时，随后用玻璃移液管将2–3粒种子转移至装有土壤的72孔育苗盘中。育苗盘需覆盖透明罩，可在萌发后一周移除。可去除多余幼苗，使每孔仅保留一株幼苗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每隔两天将育苗盘浸入1英寸&#160;深的水中20分钟进行浇水，之后排去多余水分。 
	注：浇水的时间间隔取决于生长室的湿度，需根据用户所在植物生长设施的持续观察结果确定。每天检查植株，确保水分充足。若仅有少数区域干燥，可用喷瓶从上方对这些植株进行局部补水。</li>
	<li>在发育阶段接近或处于第3.50阶段（莲座叶大小为最终大小的50%）的植株上进行病原体侵染实验（步骤3–5），该阶段通常对应于3–5周龄，具体取决于生长条件（光周期、温度）。由于年龄相关抗性的出现，不得在花序出现后（第5阶段）进行侵染38,39。</li>
</ol>
2. 培养基与培养板的制备
<ol>
	<li>制备1 L King’s B（KB）液体培养基。在1,000 ml&#160;去离子H2O中，使用磁力搅拌子轻轻搅拌20 g蛋白胨和2 g磷酸氢二钾三水合物，直至无可见沉淀。将溶液分装至150 ml&#160;玻璃瓶中，每瓶100 ml&#160;，并在液体程序下高压灭菌20分钟。</li>
	<li>制备含KB固体培养基的培养皿。
	<ol>
		<li>将20 g蛋白胨、2 g磷酸氢二钾三水合物和15 g琼脂加入1,000 ml&#160;去离子H2O中，轻轻搅拌，随后进行高压灭菌。</li>
		<li>将培养基置于磁力搅拌器上冷却至触感不烫，以减少后续冷凝并避免抗生素降解。向冷却后的培养基中加入18 ml&#160;无菌80%甘油和5 ml&#160;无菌1 M MgSO4 。由于Psm ES4326具有链霉素抗性，向冷却的培养基中加入链霉素，使其终浓度为50 µg ml−1。</li>
		<li>倾注平板。准备两种不同规格的KB培养基平板：100 mm × 15 mm和150 mm × 15 mm的培养皿。较小的培养皿用于主要细菌培养，较大的培养皿用于细菌计数。 
		注：对于细菌计数平板，可使用矩形平板以降低耗材成本，因为与传统的圆形平板相比，每块平板可进行两倍数量的处理组设置。
		<ol>
			<li>在感染实验前预先倾注平板。KB培养基平板可在4 °C保存2至3个月，因为硫酸链霉素的抗生素活性会随时间逐渐降低40。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 增强的疾病易感性（EDS）
<ol>
	<li>第1天 - 在平板上划线接种细菌
	<ol>
		<li>EDS 检测前两天，划线 Psm 从-80 °C甘油菌种中接种ES4326至KB-Strep细菌培养平板，28 °C培养24–48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天 - 启动液体培养并给植物浇水
	<ol>
		<li>在无菌试管中加入 4 ml 液体培养基启动液体培养&#160;含 50 µg/ml 的液体 KB 培养基−1 链霉素，250 rpm、28 °C 振荡过夜。 
		注意：进行EDS感染实验时，建议每种基因型使用6株植物。进行STI和MTI实验时，建议每种基因型每种处理使用6株植物。对于细菌接种液，建议使用新鲜的液体培养物，其在λ处的光密度应为600 nm 介于 0.3 和 0.6 之间。</li>
		<li>用钝头防水记号笔标记第5和第6片叶片的叶柄，以便在取样时易于识别感染组织图1为了促进气孔开放并利于病原菌溶液进入叶片，从底部浸泡育苗盘20分钟以充分浇水，然后排去多余水分。 
		注意：也可用透明罩盖住育苗盘，并将其浸泡在水中 2–4 小时，以促进气孔开放。</li>
		<li>第3天 - 病原体稀释与注射器浸润 
		注意：在上午时段进行病原体接种最有利于病原体增殖，并在易感基因型上产生最显著的病症表现。应尽可能保持接种时间一致，以消除昼夜节律和日周期基因调控的影响。41,42，有助于减少实验重复之间的差异。
		<ol>
			<li>在微量离心机中将细菌培养物离心成团&#160;在室温下以 9,600 x g 离心 2 分钟，弃上清液。用 1 ml 重悬菌体沉淀&#160;无菌 10 mM MgCl2. 
			注意：镁离子可增强细胞的运动性和黏附性 P. syringae43. 或者，使用 MgSO₄4 在相同浓度下，无菌水可作为镁盐溶液的可接受替代品。</li>
			<li>用9 ml稀释细菌悬液&#160;10 mM MgCl溶液2 在50 ml&#160;离心管中用分光光度计在波长600 nm处测定细菌的光密度（OD）。用10 mM MgCl₂稀释细菌2 至最终 OD600 nmEDS 感染实验的 p 值 = 0.0002。</li>
			<li>用1 ml的溶液浸润叶片&#160;钝端无针注射器（通常称为胰岛素注射器），内含稀释的细菌溶液。</li>
			<li>不要将注射器完全装满，注入0.5–0.6 ml即可&#160;以便在渗透过程中实现更佳的控制。</li>
			<li>将叶片下表面置于食指指尖上方，然后借助拇指轻轻调整叶片位置。将注射器垂直对准叶片表面，以确保压力均匀分布。在渗透过程中应尽量避开主脉区域，以减少叶片损伤。</li>
			<li>缓慢推动注射器活塞，使细菌溶液渗入叶片叶肉；当液体进入叶肉组织时，叶片颜色会变深，由此可观察到渗透过程。应尽量浸润整个叶片表面。若单次操作无法完成，可选择其他位置进行再次渗透，重复上述操作，直至整个叶片表面均被浸润。</li>
			<li>完成后，用吸水纸轻轻按压叶片，去除多余的病原菌溶液。目视检查被感染的叶片组织是否有损伤。 
			注意：浸润完成后，不应看到圆形注射器压痕。</li>
			<li>将浸润后的植株在返回原始生长条件前干燥1-2小时。随后，用水喷洒透明罩盖并覆盖感染植株2小时，然后将罩盖略微打开，形成2-3英寸的缝隙&#160;打开并使其在后续的感染实验过程中始终保持开启状态。 
			注意：由于 P. syringae 不是空气传播的病原体，因此在相同设施内种植的其他植物之间传播该病原体的风险不存在。然而，作为额外预防措施，应避免感病植株与邻近的实验植株发生物理接触。使用透明罩覆盖育苗盘会增强病原体的毒力并加速疾病发展进程。是否需要执行此步骤以及覆盖的最佳持续时间，需根据使用者所在植物生长设施的湿度条件来确定。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第5天 - 预干燥培养基平板
		<ol>
			<li>从冷藏装置中取出150 mm × 15 mm KB平板，擦干平板上已有的冷凝水。将平板置于室温下约24小时以彻底干燥。为加快干燥过程，可将平板盖子稍打开，放入超净工作台中吹风30–60分钟。 
			注意：此步骤对于下一步中在培养板表面形成圆形液滴至关重要。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第6天 - 病原体生长的定量分析 
		注意：为了确认叶片中接种的细菌量相等，尤其是在植物叶片形态发生改变的情况下，可在感染后的较早时间点进行以下病原体定量操作。
		<ol>
			<li>在感病基因型中，于感染组织出现黄化（表现为组织褪绿）后，但在坏死病斑形成之前，处理受感染的组织。图 2B). 
			注：建议的采样时间为病原体接种后三天。然而，由于病原体生长受多种环境因素影响，孵育时间可能在2½至3½天范围内有所变化，需根据用户所在植物生长设施中对感染进程的仔细观察来确定具体时间。
			<ol>
				<li>为每种基因型准备6个研磨管（图1）。加入一个不锈钢研磨珠，并加入500 µl&#160;无菌 10 mM MgCl2 加入每个试管中。</li>
				<li>将受感染的叶片从植株上取下，并使用单孔打孔器打取一片叶盘（图1). 
				注意：为尽量减少取样误差，建议在每片取样叶片的相同位置打孔。推荐从叶片顶部取叶盘样本。</li>
				<li>使用镊子将2个叶圆片（来自两株不同的植物）随机放入每支研磨管中。</li>
				<li>将管子密封，并使用高通量匀浆器在最大速度（每分钟1,600次冲程）下匀浆组织10分钟。如有需要，重复此步骤，直至组织充分匀浆，溶液因感病叶片释放叶绿素而变为绿色。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>等待匀浆期间，向96孔培养板的前6行每孔加入180 µl&#160;10 mM MgCl2 使用多通道移液器和移液槽。</li>
			<li>研磨后，转移 20 µl&#160;将研磨组织悬液加入96孔板的第一排，通过反复吹打液体进行混匀。若组织碎片堵塞枪头，可剪去枪头2-3 mm，以帮助准确吸取溶液。
			<ol>
				<li>为在培养板顶部为液滴提供足够的空间，将不同基因型的组织样本分隔在交替的行中图1）。为制备十倍梯度稀释液，转移 20 µl&#160;将液体加入第二行，并重复此步骤直至第六次稀释。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>转移 20 µl&#160;将溶液从96孔板转移至150 mm × 15 mm KB平板，使用分隔式移液器吸头（图1从最稀释的悬液开始，逐步操作至最浓的悬液。 
			注意：从最稀释到最浓的顺序操作，可无需在不同稀释度之间更换移液枪头。如果平板预先充分干燥，转移的液滴应能保持完整停留在培养基表面，直至被吸收（通常为15–30分钟）。干燥时间因室温和湿度而异。</li>
			<li>将培养板在室温下敞盖干燥。待板面无可见液体时，盖上盖子，倒置后于室温或28 °C培养箱中培养。</li>
			<li>将平板孵育 40–60 小时，直至菌落可见。确认平板上的菌落生长情况反映出菌落形成单位（cfu）呈可预期的 10 倍梯度下降。图2C）。在细菌过度生长和菌落融合之前进行计数。确定最低稀释度下不重叠菌落数量的细菌数。通常，用于计数的理想稀释度应包含 10–50 个菌落。 
			注意：技术重复样本之间可能存在差异；因此，每个重复样本的最低稀释度应单独确定。</li>
			<li>为计算细菌增殖水平，书面记录行数（R）以及每个技术重复（T）中的细菌数量。通过以下公式确定每片叶圆片的菌落形成单位数：cfu/叶圆片 = （T × 10R / 20) × 500 / 2</li>
			<li>在以下电子表格模板中输入数据以生成图表（图1）（用于电子表格数据分析模板文件，请参见表2）。每个数据点表示六个技术重复的均值（对数尺度）。误差线代表均值的95%置信区间（n = 6）。 
			注意：95% 置信区间的计算需根据技术重复次数进行调整。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 水杨酸触发的免疫（STI）
<ol>
	<li>第1天：按照步骤3.1中所述的相同程序进行操作。</li>
	<li>第2天：除了浇灌植物并启动液体细菌培养（步骤3.2）外，还需通过外施水杨酸衍生物水杨酸钠来诱导抗性21。 
	注意：纯水杨酸（SA）水溶性差，需预先调节pH值，因此不推荐用于本实验。
	<ol>
		<li>为诱导水杨酸介导的对P. syringae的防御反应，并使植物为后续侵染做好准备21,24，在病原菌侵染前16–24小时，用1 mM水杨酸钠溶液或H2O（作为对照）均匀喷雾处理植株叶片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：将病原菌悬液稀释至OD600nm=0.001，并通过注射器浸润法将菌液注入整片叶片表面（步骤3.3）。</li>
	<li>第6天：进行病原菌定量与计数时，按照EDS实验所述程序操作（步骤3.4和3.5）。将H2O处理组与水杨酸钠预处理组样品分别涂布平板并计数。对于野生型拟南芥，预期在水杨酸钠预处理植株中病原菌生长减少1–2个数量级。</li>
</ol>
5. MAMP 触发的免疫（MTI）

注意：本实验中使用拟南芥野生型Col-0以及fls2和efr突变体植株。FLS2和EFR是定位于质膜的模式识别受体（PRRs），分别能够识别flg22和elf189,10。每个PRR的缺失会导致植株对特定类型的MAMP不敏感，表现为在外部施加MAMP预处理并用Psm ES4326进行注射接种后，突变体中病原菌生长情况无明显变化。
<ol>
	<li>第1天和第2天：按照步骤3.1和3.2中所述的相同程序进行操作。</li>
	<li>第3天：MAMP预处理与病原菌接种
	<ol>
		<li>为建立MAMP触发的免疫反应，配制1 µM的鞭毛蛋白表位flg22或EF-Tu表位elf18溶液，并在病原菌接种前4小时通过注射器渗透至整片叶片表面（步骤3.3.3–3.3.6）。该处理可诱导植物产生针对P. syringae的MAMP介导的防御反应，并使植物为后续感染做好准备6,37。 
		注意：公开的微阵列数据表明，MAMP响应基因的转录重编程在flg22或elf18处理后4小时达到峰值37,44。因此，推荐MAMP预处理时间为4小时，以确保在MAMP处理的Col-0植株与fls2和efr突变体之间观察到明显的病原菌生长差异。</li>
		<li>用吸水纸吸除多余的MAMP溶液，并将植株敞口放置，以加快叶片内液体的吸收。为排除注射器压力渗透造成的机械损伤影响，对照组植株叶片中应渗透H2O。</li>
		<li>将病原菌稀释至OD600nm=0.001，并通过注射器渗透法将菌液注入经MAMP/H2O预处理的叶片整个表面（步骤3.3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第6天：进行病原菌定量与计数时，按照步骤3.4和3.5中所述程序操作。将H2O和MAMP预处理的样品分别涂布平板并计数。在野生型拟南芥中，MAMP预处理植株的病原菌生长通常减少1–2个数量级，其中flg22介导的抑制效应略强于elf18。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

随着可用耕地减少和人口增长，全球研究人员面临着作物改良的紧迫需求。作物产量会受到多种生物和非生物胁迫的显著影响。其中，病原体感染是导致作物减产的主要原因之一，仅在美国就造成了约12%的产量损失45。为解决这一问题，科研人员已在模式植物拟南芥—P. syringae 病害系统中开展了大量研究，以全面表征植物免疫反应的组分及其调控机制。本文介绍了一种优化的P. syringae ES4326&#160;注射式侵染实验方法，可用于在整株植物水平上定量评估植物免疫反应中的细微差异。
尽管已有多种病原体感染实验用于表征植物免疫反应29,35，但注射器渗入法提供了一个高度可控的系统，可将等量的病原体接种至感染组织中。在其他感染实验中，包括浸染接种和喷雾接种，病原体会被施加到整个地上部分组织，包括子叶和真叶34。已有报道指出，在浸染接种实验中，生态型Landsberg erecta（Ler）的子叶对病原体更为敏感，这可能导致数据偏差，从而对整体抗病性得出错误结...

由于植物的固着生长特性，它们 constantly 面临着大量具有不同生活方式和营养策略的病原体威胁1。从初步分类来看，活体营养型病原体通过维持寄主存活来获取营养，而死体营养型病原体则主动分泌毒素和酶以杀死寄主组织，并以死亡细胞为食1。另一类被称为半活体营养型的病原体，在侵染初期表现为活体营养阶段，当病原体积累达到一定阈值后，便转变为死体营养阶段2。为了有效抵御这些微生物，植物进化出复杂的先天免疫系统，该系统配备多种监控机制，可识别病原体侵袭并触发局部程序性细胞死亡3以及系统性获得抗性（SAR）4。目前的研究重点在于解析植物免疫系统中关键的信号组分及其相互之间的信号串扰5。

根据“之字形”模型5，植物先天免疫反应的第一层需要质膜定位的模式识别受体（PRRs）来识别微生物的入侵。PRRs能够识别微生物相关分子模式（MAMPs），并建立MAMP触发的免疫反应（MTI）6。除了诱导编码抗菌PR蛋白的基因发生转录上调7外，MTI还会引发多种抑制病原体生长的事件，包括活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的产生、胼胝质在细胞壁上的沉积，以及多个激酶信号通路的激活8。
迄今为止，已在拟南芥中鉴定出多种可触发MTI的MAMPs，包括细菌flg229（来源于鞭毛蛋白的22个氨基酸片段）、elf1810（来自细菌翻译延伸因子Tu的18个氨基酸片段）以及细胞壁结构组分肽聚糖11。为了建立成功的侵染，一些专性病原菌已进化出将毒性效应蛋白分泌至细胞内或细胞间空间的能力，从而抑制MTI并引发效应子触发的感病性（ETS）12,13。例如，毒性效应子可通过失活MTI中的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化级联反应，促进感染组织中的病害发展14-16。在寄主与病原菌的动态共进化过程中，植物也发展出反制策略，能够识别效应蛋白并削弱病原菌的毒性分子17。这种对效应子的直接或间接识别由抗病（R）蛋白介导18。其中大多数属于NB-LRR（核苷酸结合和富含亮氨酸重复序列）蛋白家族19。当R蛋白识别到无毒效应子时，会激发一种更强且更广泛的免疫反应，称为效应子触发的免疫（ETI）20。除了诱导防御相关基因的表达21和防御代谢物的产生22外，ETI通常还会引发快速的局部程序性细胞死亡，即超敏反应（HR），以限制病原菌向邻近组织扩散3。
除了局部的程序性细胞死亡23，植物还能启动一种长期且全株范围的免疫反应，称为系统获得性抗性（Systemic Acquired Resistance, SAR）4。当受到活体营养型病原菌侵染时，植物细胞会在局部和远端组织中触发内源性植物激素水杨酸（salicylic acid, SA）的生物合成及其积累，并诱导PR蛋白的表达24。通过这一过程，未受感染的叶片进入一种高度戒备状态，从而在后续遭遇多种病原菌侵染时能够更快地启动防御反应24。水杨酸及其合成类似物，如苯并-（1,2,3）-噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯（BTH）和2,6-二氯异烟酸（INA），在外部施用时能够化学诱导水杨酸（SA）触发的免疫反应（Salicylic Acid-Triggered Immunity, STI）24。非病程相关基因表达因子1（Nonexpressor of Pathogenesis-Related genes 1, NPR1）被认为是SA的受体之一，并在SA介导的局部和系统性组织防御反应中发挥主要转录调控作用21,25,26。已有确凿证据表明，NPR1是建立SAR所必需的，缺失NPR1会导致植物对Pseudomonas syringae表现出显著的感病性25。
为了全面表征植物组分在植物-病原体互作中的分子贡献，已开发出多种生物测定方法，用于检测特定的防御事件，包括活性氧爆发27、胼胝质沉积28、防御基因的表达及其蛋白产物的积累21。尽管这些单项检测能够揭示植物免疫反应的某一特定形式，但它们均无法代表整个植株水平上的完整防御反应。相反，感染后对病原体生长的定量分析可提供在个体水平上免疫反应的整体评估。因此，建立并优化一种精确且高度标准化的病原体接种检测方法，对于推动拟南芥免疫反应相关研究与发现至关重要。
Pseudomonas syringae一种革兰氏阴性细菌被鉴定为植物病原菌，能够引起包括拟南芥在内的多种植物宿主发病29作为模式植物-病原体系统，拟南芥 - P. syringae 互作已被广泛应用于解析植物防御反应的分子机制29截至目前，已有超过50个 P. syringae 根据其感染不同植物物种的能力，已鉴定出多种致病变种30 . P. syringae pv. 番茄 DC3000Pst DC300031和 P. syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES432632 是两种应用最广泛且研究最为深入的致病菌株。除了能被植物识别并触发MTI反应外， Pst DC3000 和 Psm ES4326 能够分泌毒性效应蛋白，以抑制 MTI 并触发 ETS，从而有利于病原菌的生长31,33.
为了功能解析拟南芥与之间的相互作用 P. syringae 多个&#160;基于病原体递送方式，已开发出多种病原体感染方法。对于土壤栽培的植物，可通过注射渗入法、真空渗入法、浸渍接种法和喷雾接种法递送病原体。29,34最近，已开发出幼苗淹水接种法，用于对培养在组织培养板上的拟南芥幼苗进行大规模筛选。35注射渗透法作为一种最常用的方法，通过称为气孔的天然叶片开口，将病原体手动递送至质外体。29通过该方法，等量的 P. syringae 可渗透至受感染的叶片中，且植物免疫反应的强度与病原体生长水平呈负相关。因此，定量检测病原体生长情况是评估整株植物免疫功能的最佳方法。此外，注射渗透法可区分局部与系统性组织，适用于系统性获得抗性（SAR）相关分子机制的研究。36.
在以下实验方案中，我们描述了一种优化的注射式渗入法，使用Psm ES4326侵染拟南芥突变体以筛选增强型疾病敏感性（EDS）表型。本方案将采用两种拟南芥基因型：野生型生态型Columbia-0（Col-0）植株（对照）和npr1-1功能缺失&#160;突变体 （高敏感性） ，并用毒性细菌菌株Psm ES4326进行侵染37。npr1-1突变体在NPR1蛋白的锚蛋白重复共识序列内携带一个点突变，导致高度保守的组氨酸变为酪氨酸，从而使该蛋白失去功能25。此外，本文还介绍了若干对注射式渗入法的改进，可用于定量分析免疫应答特定层次中的缺陷，包括MTI和STI。

<table><tbody><tr><td>MetroMix 360&amp;nbsp;</td><td>Grosouth</td><td>SNGMM360</td><td></td></tr><tr><td>大号花盆</td><td>Grosouth</td><td>TEKUVCC10TC</td><td></td></tr><tr><td>12 x 6 插盘</td><td>Grosouth</td><td>LM1206</td><td></td></tr><tr><td>无孔 11x21 育苗盘</td><td>Grosouth</td><td>LM1020</td><td></td></tr><tr><td>带孔 11x21 育苗盘</td><td>Grosouth</td><td>LM1020H</td><td></td></tr><tr><td>乙烯基育苗罩</td><td>Grosouth</td><td>CW-221</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0122-17-4</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾三水合物&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>151946</td><td></td></tr><tr><td>琼脂&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Bio Basic Inc</td><td>SB0494</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>150 x 15 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80150</td><td></td></tr><tr><td>矩形培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-450&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;六水合物</td><td>Bio Basic Inc</td><td>MB0328</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Bio Basic Inc</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Bio Basic Inc</td><td>MN1988</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9992493&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸巾（Kimwipe）</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td></td></tr><tr><td>研磨管&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>B1257</td><td></td></tr><tr><td>研磨管盖</td><td>Denville Scientific</td><td>B1254</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢研磨珠</td><td>Fisher Scientific</td><td>2150</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>水杨酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>s3007-1kg</td><td></td></tr><tr><td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td><td>Genescript</td><td>定制合成</td><td></td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>Genescript</td><td>定制合成</td><td></td></tr><tr><td>打孔器</td><td>Staples</td><td>146308</td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus 核酸蛋白测定仪</td><td>Eppendorf</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>PowerGen 高通量匀浆器</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-503</td><td></td></tr><tr><td>Accu spin 微型离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器 (10-100 &amp;micro;l)</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.043</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器 (30-300 &amp;micro;l)</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.060</td><td></td></tr><tr><td>移液器 (20&amp;micro;l)</td><td>Eppendorf</td><td>3120 000.038</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>3552-HR</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie 永久性记号笔</td><td>Staples</td><td>507130</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-890</td><td></td></tr></tbody></table>

利用细菌叶片浸润实验精细表征植物防御反应 拟南芥-丁香假单胞菌 病理系统

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

在缺乏特化移动免疫细胞的情况下，植物通过局部程序性细胞死亡和系统性获得抗性来抵御病原体侵袭。通过检测感染组织内病原菌的生长情况，可对特定拟南芥基因在整体植物免疫反应中的作用进行特异且定量的评估。三十多年来，半活体营养型细菌 Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326）已被广泛用作研究拟南芥免疫反应分子机制的模式病原菌。为了将病原菌导入叶片组织，已建立了多种接种方法， 例如， 注射浸润、浸渍接种、喷雾、真空浸润和淹水接种。以下方案描述了一种优化的注射浸润方法，用于递送毒力菌株 Psm 将ES4326接种至成年土壤培养的拟南芥植株叶片中，并准确筛选对该病原菌增强的感病性（EDS）。此外，本实验方案可结合多种预处理方法，以进一步解析植物防御不同层次中特定的免疫缺陷，包括水杨酸（SA）诱导的免疫（STI）和微生物相关分子模式诱导的免疫（MTI）。

我们在此描述的方案代表了一种优化的 P. syringae 通过注射浸润法定量评估拟南芥植株的免疫反应。如图所示 图1，注射器浸润法 Psm ES4326 之后进行病原体提取与定量 通过 系列稀释与菌落计数
如方案文本中第3步所述，可通过接种OD值为0.0002的菌液来评估对Psm ES4326的增强疾病敏感性（EDS）。如图3所示，高度敏感的npr1-1突变体中的病原菌生长量比野生型Col-0植株高出约2.5 log（即300倍）。根据实验条件的不同，npr1-1植株中的细菌生长量可能比Col-0高出最多达3.0 log，通常结果范围在1.5–2.5 log之间。因此，该EDS检测方法提供了较宽的差异窗口，研究人员可借此对拟南芥突变体和转基因植株进行比较，以鉴定可能参与植物免疫反应的候选基因。
除了确定EDS外，Psm ES4326 ...

病原菌生长的定量分析是表征多种Arabidopsis thaliana（以下简称：拟南芥）免疫反应的有力工具。本文所述方法提供了一种优化的注射浸润实验，用于定量测定丁香假单胞菌致病变种（Pseudomonas syringae pv. maculicola）ES4326 在成年拟南芥叶片中的增殖情况。

在缺乏特化移动免疫细胞的情况下，植物通过局部程序性细胞死亡和系统获得性抗性来防御……

本实验的总体目标是通过优化的注射渗透法，对拟南芥（Arabidopsis diliana）的免疫反应进行定量表征。首先，利用注射器渗透法将细菌通过叶片表面自然存在的气孔人工导入叶片内部；第二步是在病害症状出现后，采集受感染的叶片组织圆片。接下来，通过高通量均质化方法从叶片圆片中提取细菌。最后一步是进行系列稀释，并将样品点样到细菌计数平板上以统计菌落数量。最终，可通过每个叶片圆片内细菌的生长情况来评估植物免疫反应的相对强度。该方法有助于回答植物免疫领域的关键问题，例如鉴定参与抵御生物胁迫防御反应的基因。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对感染植物组织中的病原菌生长进行精确定量，并有助于避免因选取不同发育阶段的叶片取样而造成的实验误差。该方法可揭示植物对毒性细菌病原体感染的免疫应答机制，也可应用于其他系统，如水杨酸或微生物相关分子模式所触发的免疫反应研究。通常，初次接触该方法的研究人员在将细菌注入叶片时难以避免组织损伤。本视频中，将由我实验室的博士后学者 Hindu 以及研究生 shalu 和 yali 演示以下实验步骤。此外，本视频还将演示增强型疾病敏感性检测方法。实验前，配制 KB 培养基平板：按照方案文本所述方法制备 1 升 KB 固体培养基，并将其置于磁力搅拌器上冷却。当培养基冷却至可触温度时，向其中加入 80% 甘油、1 摩尔硫酸镁和链霉素，然后倒入两种不同规格的 KB 培养基平板中。较小的培养皿用作细菌主培养平板，较大的培养皿用作细菌计数平板。在检测划线前两天，将平板置于4 °C保存。从–80 °C甘油保藏菌种中取细菌接种于KB链霉素细菌培养平板，于次日在28 °C培养24至48小时。在无菌试管中加入4 mL含50 µg/mL链霉素的液体KB培养基，启动液体培养物。在28°C条件下以250 RPM转速振荡培养过夜。实验所用拟南芥植株与液体细菌培养物启动当日，按照方案文本中详述的条件进行培养。使用钝头防水标记笔标记第五和第六片叶片的叶缘，以便在取样时易于识别受感染的组织。为增强气孔的开放并促进病原体溶液进入叶片内部，将培养皿从底部浸润 20 分钟，使植株充分吸水。20 分钟后，倒掉多余的水。在液体培养开始的第二天，对拟南芥植株进行感染。将菌液转移至1.5毫升微量离心管中，在9,600 G下离心2分钟。室温条件下弃去上清液，用1毫升无菌10毫摩尔氯化镁重悬菌体沉淀，再将菌悬液转移至50毫升离心管中，加入9毫升10毫摩尔氯化镁稀释。测定菌液光密度后，用10毫摩尔氯化镁将菌液稀释至终浓度OD600为0.0002。进行EDS感染实验时，使用一种一毫升无针头钝端注射器（通常称为胰岛素注射器）进行浸润。为在浸润过程中实现更好的控制，将稀释后的细菌溶液0.5至0.6毫升注入注射器中，切勿将注射器完全注满。将叶片的下表面置于食指指尖上方，然后借助拇指轻轻调整叶片位置。将注射器垂直对准叶片表面，以确保压力均匀分布，减少对叶片的损伤。渗透过程中应尽量避开主脉区域。缓慢推动注射器活塞，使细菌溶液渗入叶片。当液体进入叶片叶肉组织时，叶片颜色变深即可观察到渗透情况；即使需要多次尝试，也应完成整个叶面的渗透。渗透完成后，用吸水纸轻轻按压叶片，去除多余的病原体溶液。目视检查受感染的叶片组织是否受损。将注射后的植株静置干燥一至两小时，然后放回原始生长条件。用水喷洒透明罩并覆盖感染植株，持续两小时。然后将培养皿盖打开一条两到三英寸的缝隙，形成开口，并在整个感染实验的剩余时间内保持此状态，通常为三天。在定量病原菌生长前一天，将 150 毫米 × 15 毫米的 KB 培养基平板预先干燥。将培养板在室温下放置约24小时以干燥。在感病基因型中，组织感染后出现硬化（表现为感染组织变黄）但尚未形成坏死病斑时，处理感染组织。每种基因型准备6个研磨管。在每个离心管中放入一个不锈钢研磨珠，并加入 500 微升无菌的 10 毫摩尔氯化镁溶液。接着，用镊子从植株上取下被感染的叶片，随机使用单孔打孔器打取叶盘，将来自两株不同植株的两个叶盘放入每个研磨管中。密封离心管，使用高通量匀浆器以最大速度匀浆组织 10 分钟。如有需要，可重复此步骤，直至组织充分匀浆，且在等待过程中由于感病叶片释放叶绿素，溶液变为绿色。进行匀浆时，向96孔细胞培养板前六行的每个孔中加入180 µL 10 mmol/L氯化镁溶液。取20 µL研磨后的组织悬液加入96孔板第一行的每个孔中，并通过反复吹打液体使其充分混匀。如果组织碎片堵塞了枪头，可剪去尖端2至3毫米，以帮助吸取正确的溶液体积，并在培养板顶部留出足够的空间，使不同基因型的组织在交替的行中分布。为制备10倍系列稀释，将20 µL组织悬液转移至第二行，并重复此操作直至第六个稀释度。使用分装的移液器吸头，将96孔板中的20 µL溶液转移至150 mm × 15 mm的KB培养板上。从最稀释的悬液开始操作，逐步至最浓的悬液，以便在稀释过程中无需更换移液器吸头。将培养皿盖子稍打开，在室温下干燥。当培养皿表面不再有可见液体时，盖上盖子并倒置，于室温下培养。将培养皿孵育 40 至 60 小时，直至菌落可见。确认培养皿上的细菌表现出可预测的十倍递减规律。菌落形成单位数量下降。在细菌过度生长和菌落融合之前进行计数。确定最低稀释度下无重叠菌落的细菌数量。通常宜选择含有10至50个菌落的稀释度进行计数，该稀释度可能因技术重复而有所不同。为计算细菌增殖水平，使用以下公式确定每片叶盘的菌落形成单位数量，其中 R 代表行数，T 代表每个技术重复中的细菌数量。随后利用该数据绘制图表。每个数据点表示六个技术重复的平均值，采用对数刻度表示。误差线表示平均增强病害的95%置信区间。通过接种OD600为0.0002的接种物评估对P-S-M-E-S 43 26的感病性。结果显示，高度敏感的NPR1-1突变体与野生型Columbia-0植株相比，病原菌生长量约增加2.5 log，即多出约300倍。可通过修改注射渗透实验以评估免疫反应的不同层次。为评价水杨酸诱导的免疫反应，可外源施加水杨酸钠以激活免疫反应，并通过病原菌的生长情况进行量化。NPR1 基因的缺失会导致对水杨酸依赖性靶基因的转录共调控功能丧失，而 NPR1 作为水杨酸受体发挥关键作用，因此其突变体对外源施加的水杨酸衍生物表现出不敏感性。为了表征微生物相关分子模式诱导的免疫反应，植物经两种已知诱导物预处理。用FLAG 22处理的野生型Columbia零号植株，其细菌种群数量减少了一个数量级，即减少10倍，而FLS2突变植株则无法触发对细菌生长的抑制效应。类似地，EFR突变植株对L 18预处理不敏感。观看本视频后，您应能充分理解如何通过注射器渗透法检测阿拉伯芥的免疫反应。在进行该实验时，重要的是要记住，在出现病斑后，需持续监测病害发展并取样组织。假单胞菌致病变种（Pseudomonas pathovar）S. phos 3, 2 6 是一种半活体营养型病原菌。因此，采样应在进入神经营养阶段之前进行。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如实时定量PCR和血液Western分析，以回答更多问题，例如具体哪条免疫信号通路受到干扰。请勿忘记，您正在处理的是活体细菌。尽管铜绿假单胞菌（Pseudomona Senge）对人类不具致病性，但在执行本实验操作时，请务必妥善处理受污染的耗材和感染的植物。

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