Name: 侧根诱导系统拟南芥和玉米 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习侧根诱导系统（LRIS）在拟南芥和玉米中的同步诱导方法，利用激素处理研究侧根起始的细胞学和分子机制。该系统为植物根系发育研究提供了重要的实验工具。

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作者感谢 Davy Opdenacker 提供的技术支持与摄影协助。我们非常感谢 Annick Bleys 博士对改进稿件提出的宝贵建议。本工作由比利时联邦科学政策办公室的大学间吸引计划项目 IUAP P7/29 “MARS”、FWO 基金项目 G027313N 以及科技创新署 IWT（IR）资助。

1. 拟南芥 LRIS 实验方案
注意：本文涉及 &#34;小&#34; 或 &#34;大&#34; 小规模实验。小规模实验，例如标记谱系分析和组织学染色6, 14，仅需少量样品。大规模实验，如定量实时qRT-PCR、微阵列9-11 或RNA测序需要较大量的样本，因此Vanneste等人每个样本使用了约1000株幼苗 等.11 在根段解剖后进行微阵列实验。
第1天
<ol>
	<li>灭菌 拟南芥 种子 
	注意：请选择以下种子灭菌方法之一。任一方法均适用于本实验方案的后续步骤。与液体灭菌法（1.1.1）相比，气体灭菌法（1.1.2）具有两个主要优势：在处理大量种子时耗时更短，因为无需对各个样品进行移液操作；且灭菌后的种子可保存更长时间。然而，该方法需要使用干燥器，并需谨慎操作。
	<ol>
		<li>液体灭菌
		<ol>
			<li>将所需数量的种子倒入微量离心管中。每管使用不超过 20 mg（约 800 粒种子）置于 1.5&#160;毫升&#160;管或2 ml中40 mg（约1600粒种子）&#160;微型离心管</li>
			<li>加入1 ml 70%乙醇，倒置或轻轻振荡2分钟。</li>
			<li>将70%乙醇替换为1 ml灭菌溶液，作用15分钟。（现配灭菌溶液：3.85 ml次氯酸钠（NaOCl）储备液（12%）（注意：在通风橱中操作），5 µl&#160;Tween 20，加水至10 ml。反复倒置试管数次，确保所有种子均与溶液接触。</li>
			<li>在超净工作台中，将灭菌溶液替换为1 ml无菌蒸馏水，通过反复更换1 ml新鲜无菌蒸馏水，清洗种子5次，每次5分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>气体灭菌
		<ol>
			<li>将所需数量的种子倒入一个2 ml 微型离心管中。若处理多个独立品系，应使用单独的离心管，并将打开的离心管有序放置于塑料微型离心管盒或管架中。若单个离心管中的种子数量超过500粒（12.5 mg），需将种子分装至适当数量的离心管中，以确保灭菌效果。&#160;确保相邻试管的管盖互不重叠。将盒子的盖子与底部扣合，因为盖子也需要放入干燥器中进行灭菌。</li>
			<li>将盒子连同玻璃烧杯一起放入干燥器皿中（注意：使用通风橱）。</li>
			<li>在通风橱中，将100 ml 12% NaOCl倒入烧杯中。盖上干燥器盖子，但在放置烧杯的位置留出一个小缝隙。</li>
			<li>通过小孔向烧杯中加入 3 ml 37% 盐酸（发烟）（注意：使用通风橱），并迅速关闭干燥器。由于 Cl 的产生，溶液会持续冒泡一段时间2- 气体生成。保持系统密闭过夜（或至少8小时）。</li>
			<li>打开干燥器盖子。取出盒子，并用盖子盖好，以避免运输过程中受到污染。</li>
			<li>将盒子放入超净工作台，打开盖子，室温下静置种子约1小时&#160;以允许气体释放。 
			注意：种子可在4 °C条件下，于密闭的微量离心管中干燥保存长达2周。   </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>侧根诱导在 拟南芥
	<ol>
		<li>侧根抑制（NPA处理）
		<ol>
			<li>准备培养基 体外 生长。培养基含有半倍浓度的Murashige和Skoog盐混合物15，0.1 g/L 肌醇，10 g/L 蔗糖，并用 0.5 g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲。</li>
			<li>用 1 M KOH 调节 pH 至 5.7。加入 8 g/L 植物组织琼脂，于 121 °C 高压灭菌 20 分钟。</li>
			<li>在超净工作台中，将已灭菌的培养基冷却至约 65 °C（以手能握住培养瓶为宜），然后加入 NPA 的二甲基亚砜（DMSO）储存液（终浓度为 25 mM）（注意：操作时需佩戴手套），使其终浓度达到 10 µM。</li>
			<li>加入后轻轻振荡瓶子10秒以充分混匀。每皿（12 cm × 12 cm）加入50 ml培养基。 
			注意：若进行大规模实验，使用尼龙滤网（20 µm）以确保样品易于转移。准备一个（9 cm × 9 cm）的滤网用于高压灭菌图1A）。高压灭菌后，使用无菌镊子将筛网贴附于培养基上（图1B）。使用灭菌的工具轻轻将网膜推入生长培养基中&#160;drigalsky 以确保其与培养基充分接触（图1B（注意：需在无菌条件下操作）。&#160;</li>
			<li>将种子播种于NPA平板上。 
			注意：若计划进行大规模实验，可播种2行密度较高且排列整齐的种子，每行50粒，以方便取样（参见1.2.2.3）。
			<ol>
				<li>若进行液体灭菌，使用200 µl移液器将种子接种于NPA平板上。剪去移液器吸头末端3 - 4 mm&#160;在无菌条件下（或在枪头灭菌前）用移液器枪头吸取种子。上下吹打数次以重悬种子，然后吸取约150 µl含10–20粒种子的无菌水，静置直至种子沉降至枪头底部。（注意：须在无菌条件下操作） 
				注意：当用枪头轻轻接触琼脂或网格时，附着种子的水滴将会从中释放图1C).</li>
				<li>若采用气体灭菌法，使用经高压灭菌的牙签播种。在取种子前，先将牙签轻轻插入琼脂中，以确保其表面具有黏性。然后用牙签逐个拾取种子，并将种子均匀分布在培养皿上（图1D）或者，向种子中加入无菌水，然后按照1.2.1.5.1中的描述进行播种（注意：需在无菌条件下操作）。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>用透气胶带密封培养板，置于4 °C避光环境中保存至少2天，最多一周。此步骤用于春化处理，以确保种子萌发同步且效率更高。 
			注意：或者，可在播种前将种子置于微量离心管中用蒸馏水浸润进行分层处理，此方法所需冰箱空间较少。在此情况下，需将离心管在4 °C下至少保存一周，播种后立即将培养板转移至生长培养箱中（参见1.2.1.7）。 
			第3天</li>
			<li>将培养皿转移至生长培养箱（持续光照（110 µE m⁻² s⁻¹））中培养-2 s-1)，21 °C）中培养5天（2天萌发和3天生长），保持接近垂直的位置（80至90°），以确保根在培养基表面生长而非插入培养基内。 
			第8天&#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>侧根诱导（NAA处理）
		<ol>
			<li>按照1.2.1.1和1.2.1.2中所述配制相同的生长培养基。用DMSO配制50 mM的NAA储备液（注意：使用手套）。将高压灭菌后的培养基冷却至65 °C，加入NAA溶液，使培养基中NAA的终浓度为10 µM（注意：在无菌条件下操作）。
			<ol>
				<li>加入后轻轻振荡瓶子10秒以混匀。每平方培养皿（12 cm × 12 cm）倒入50 ml培养基。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>将幼苗从含有添加了10 µM NPA的生长培养基的培养板转移至添加了10 µM NAA的培养基中。
			<ol>
				<li>将弯头镊子的尖端钩住幼苗子叶下方，轻轻将其从培养板中取出。仅转移根部完全与NPA培养基接触且 preferably 向下生长的幼苗。</li>
				<li>将根轻轻掠过含有NAA的培养基表面一小段距离。确保植物根部与培养基充分接触。必要时，用镊子轻轻将根部压在培养基表面。 
				注意：若进行大规模实验，需移除所有未与网格接触的幼苗，并用镊子夹住网格的两个上角将其提起并转移。确保网格与含NAA的培养基充分接触，可将网格在琼脂表面短距离轻轻滑动以实现良好贴合。图1E).&#160;</li>
			</ol>
			</li>
			<li>用透气封口膜密封新培养板，并将其置于培养柜中（持续光照（110 µE m⁻² s⁻¹），22 °C）-2 s-1），在诱导后于垂直位置放置至所需时间，期间温度保持在21 °C，直至取样。 
			注意：若进行大规模实验，可使用解剖刀在筛网上一次性切割根段，并通过轻轻刮擦筛网表面来取样。  </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. LRIS 玉米实验方案
<ol>
	<li>玉米籽粒的分层
	<ol>
		<li>将玉米籽粒置于4 °C避光条件下孵育至少1周。 
		注意： 本方案使用B73玉米自交系开发而成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玉米籽粒的灭菌 
	第1天 
	注意： 尽管玉米幼苗无需在无菌条件下培养，但建议对玉米籽粒进行灭菌处理，并使用无菌材料操作，以防止纸卷系统中真菌生长。
	<ol>
		<li>将所需数量的玉米籽粒放入已灭菌的玻璃烧杯中。</li>
		<li>加入100 ml消毒液（6% NaOCl水溶液）（注意：使用通风橱）。</li>
		<li>加入一个磁力搅拌子，将烧杯置于磁力搅拌器上，在室温下以低速搅拌（约250 rpm）&#160;5 分钟。</li>
		<li>用100 ml新鲜无菌水更换溶液，重复5次，每次5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>&#160;播种玉米籽粒
	<ol>
		<li>戴上手套以降低污染风险，并取一卷纸巾。</li>
		<li>撕下两段卫生纸巾，总长度为两张纸（约 92 cm × 24 cm），并将它们叠放在干净的表面上图2A).</li>
		<li>将纸张沿长度方向对折（约92厘米×12厘米）（图 2A).</li>
		<li>使用镊子将10粒种子均匀分布在纸条上，距离顶端约2 cm，沿纸条全长放置，每粒种子之间间隔8 cm，两端各留出8 cm空白区域图2B）。确保籽粒的胚根朝下并朝向纸张（图2B).</li>
		<li>轻轻滚动纸张，同时保持种子位置不变（图2B）。为便于卷纸，可选择先用无菌水喷湿滤纸。</li>
		<li>将纸卷放入直径约6 cm、高约14 cm的灭菌玻璃管中（例如， 250 ml 离心管）并置于试管架中（图2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玉米侧根诱导
	<ol>
		<li>配制50 mM NPA储备液（溶于DMSO中）（注意：使用手套）。</li>
		<li>每个试管中，取125 µl的50 mM NPA储备液加入至125 ml无菌水中，于无菌玻璃烧杯中配制50 µM NPA溶液。</li>
		<li>充分混匀后，将125 ml的50 µM NPA溶液倒入管中的纸卷上。纸卷将吸收溶液并完全浸透。 
		注意： 当使用其他尺寸的纸卷和试管时，应相应调整体积。液体应加至试管的一半高度，以确保充分吸收。</li>
		<li>将纸卷系统放入培养柜中培养三天（27 °C，持续光照，70% 相对湿度）。由于溶液会随时间蒸发，需添加额外的 50 µM NPA 溶液以确保纸卷始终保持浸润状态（图 2D). 
		第4天</li>
		<li>配制50 mM NAA储存液（溶于DMSO中）（注意：使用手套）。</li>
		<li>每个试管中，取125 µl的50 mM NAA储备液加入至125 ml无菌水中，于无菌玻璃烧杯中配制50 µM的NAA溶液。</li>
		<li>轻轻挤出纸卷中残留的大部分NPA溶液，将纸卷放入无菌水中浸泡5分钟以洗去残留溶液（注意：需佩戴手套）。轻轻挤出纸卷中的大部分水分，重复此洗涤步骤三次。</li>
		<li>充分混匀后，将50 µM NAA溶液倒入含有纸卷的试管中，确保纸卷完全浸透。</li>
		<li>将纸卷系统置于生长培养箱中（27 °C，持续光照，70%相对湿度），在诱导后培养所需时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玉米不定冠根侧根诱导 
	注意：上述LRIS可诱导主根产生侧根。然而，在玉米和其他单子叶植物中，主根及其胚根（胚性初生根）连同它们的侧根主要在幼苗发育阶段发挥作用。在植物生长的后期阶段，胚后发生的不定根从茎部产生，并进一步形成侧根，从而构建新的根系。16LRIS 还可通过在胚胎期主根的 LRIS 基础上进行少量调整，诱导这些胚后不定冠根产生侧根。
	<ol>
		<li>制作纸卷时，需将纸张叠成夹层结构，外层各使用两层手巾纸，内层各使用两层发芽纸。将已灭菌的籽粒（参见步骤2.1至2.2）置于两层发芽纸之间。与手巾纸相比，发芽纸不易被根毛和侧根穿透，便于后续打开纸卷。而外层的两层手巾纸则有助于液体的吸收。</li>
		<li>将卷材放入700 ml玻璃管中，倒入不含NPA的无菌水，确保完全浸透。</li>
		<li>将灭菌后的籽粒置于培养柜中萌发（参见步骤 2.4.9）。</li>
		<li>将幼苗培养至不定冠根开始出现（B73 品种约为 6 天）。必要时添加无菌水，确保卷纸始终处于湿润状态。</li>
		<li>转移至25 µM NPA溶液中处理4天（见步骤2.4.1至2.4.4），随后通过洗涤步骤后更换为50 µM NAA溶液，以类似方式诱导侧根起始（见步骤2.4.5至2.4.9）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxins+differentially+regulate+root+system+architecture+and+cell+cycle+protein+levels+in+maize+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings.</a> J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).</li>
<li>Beyer, E. M., Morgan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ethylene+on+uptake%2C+distribution%2C+and+metabolism+of+indoleacetic+acid-1-14C+and+-2-14C+and+naphthaleneacetic+acid-1-14C%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C.</a> Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).</li>
<li>Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mechanisms+controlling+uptake+and+accumulation+of+2%2C4-dichlorophenoxy+acetic+acid%2C+naphthalene-1-acetic+acid%2C+and+indole-3-acetic+acid+in+suspension-cultured+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells.</a> Planta. 198, 532-541 (1996).</li>
<li>Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgenomics%3A+genome-scale%2C+cell-specific+monitoring+of+multiple+gene+regulation+tiers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers.</a> Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在 拟南芥 LRIS 实验方案中，必须仅转移那些完全在含有 NPA 的培养基中生长的幼苗。这可确保在整个根系长度上抑制侧根起始。为防止转移过程中损伤幼苗，可将弯头镊的镊臂钩住幼苗子叶下方。转移时，需确保幼苗根部与含有 NAA 的琼脂培养基充分接触。可通过将根在琼脂表面短距离轻扫来实现这一点。这将确保在整个根系长度上高效且同步地诱导侧根起始。根可在光照条件下生长，且不会对根的生长及侧根诱导产生不利影响。
在玉米侧根诱导系统（LRIS）实验方案中，必须确保籽粒的胚根朝下并紧贴滤纸，以保证根系向下生长并从正确的一侧附着于滤纸上16。经过三天NPA处理后，幼苗应已从籽粒中萌发，长出短小的茎叶、一条主根和若干胚根16。&#160;在进行侧根起始诱导前，主根长度应约为2 cm。本实验方案采用B73玉米自交系建立，若使用生长速率不同的其他玉米品系，需相应调整培养时间。请确保纸卷始终保持湿润，定期补充50 µM NPA溶液以补偿随时间蒸发的液体，否则NPA处理效果可能不足，导致非预期的早期侧根发育。该系统本身可防止根部暴露于光照，但即便...

根系对植物生长至关重要，因为它能够固定植株并从土壤中吸收水分和养分。由于根系的扩展主要依赖于侧根的产生，因此侧根的起始与形成过程已被广泛研究。侧根起始于中柱特定的一类细胞亚群，称为起始细胞1。在大多数双子叶植物（如Arabidopsis thaliana）中，这些细胞位于原生木质部极2，而在单子叶植物（如玉米）中，则位于韧皮部极3。起始细胞的特征是生长素响应增强4，随后表达特定的细胞周期基因（例如&#160;CYCLIN B1;1 / CYCB1;1），接着进行第一轮不对称的垂周分裂5。经过一系列协调的垂周分裂和平周分裂后，形成侧根原基，最终发育为独立的侧根。然而，侧根起始的位置和时间难以预测，因为这些事件既不频繁也不同步，这限制了转录组学等分子研究方法在该过程研究中的应用。
为解决这一问题，已开发出一种侧根诱导系统（Lateral Root Inducible System, LRIS）6, 7在此系统中，先用以下方法处理幼苗 N-1-萘基邻苯二甲酰胺酸（NPA），可抑制生长素的运输与积累，从而阻断侧根的起始发生8随后将幼苗转移至含有合成生长素1-萘乙酸（NAA）的培养基中，整个中柱鞘层对升高的生长素水平产生响应，从而大量诱导侧根起始细胞的分裂。6因此，该系统可实现快速、同步且广泛的侧根起始，便于收集富含特定侧根发育阶段的根样品。随后，这些样品可用于测定侧根形成过程中的全基因组表达谱。LRIS 已在侧根起始研究中获得了重要成果 拟南芥 和玉米9-13但随着越来越多的基因组被测序，以及将知识应用于具有重要经济价值物种的需求日益增长，将该系统应用于其他植物物种的必要性也愈发明显。
此处为详细实验方案的 拟南芥 并提供了玉米LRIS的应用实例，通过展示如何利用从玉米LRIS获得的转录组数据，鉴定在不同植物物种中侧根起始过程中具有保守功能的功能同源基因。最后，提出了优化LRIS以适用于其他植物物种的指导方案。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;拟南芥侧根诱导系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;种子&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>拟南芥种子</td><td></td><td></td><td>生态型 Col-0</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;种子气体灭菌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 1.5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf 微量离心管 3810X，PCR 级洁净</td></tr><tr><td>微量离心管 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock 微量离心管</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Merck KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37%（发烟）分析纯 EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu</td></tr><tr><td>玻璃干燥器</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料微量离心管盒或支架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;种子漂白灭菌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>乙醇，绝对纯 100% a.r.，稀释至 70%</td></tr><tr><td>次氯酸钠 (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS 盐混合物（Murashige 和 Skoog）</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>肌醇 (myo-inositol)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-蔗糖 Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>分析纯颗粒（Na 含量 ≤ 0.002%）EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>植物组织培养琼脂</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;侧根诱导化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-萘基邻苯二甲酸 (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>10 &amp;micro;M（拟南芥）</td></tr><tr><td>1-萘乙酸 (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>10 &amp;micro;M（拟南芥）</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;制作转移用筛网&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼龙筛网</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>合成尼龙筛网 20 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;播种与幼苗处理&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>方形培养皿</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml DURAN 管</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&amp;nbsp;50 ml 离心管</td></tr><tr><td>Drigalski 涂布棒</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪切移液器吸头</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>通用 200，灭菌前剪去 5 mm 尖端</td></tr><tr><td>透气胶带&amp;nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>cat. no. 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont 镊子 a 型编号 5；Dumont 镊子 e 型编号 7</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;生长条件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生长室</td><td></td><td></td><td>21 &amp;deg;C，持续光照</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;玉米侧根诱导系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;种子&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玉米籽粒</td><td></td><td></td><td>B-73</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;籽粒漂白灭菌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器&amp;nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠 (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>无菌水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;侧根诱导化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-萘基邻苯二甲酸 (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>50 &amp;micro;M（玉米主根），25 &amp;micro;M（玉米不定根）</td></tr><tr><td>1-萘乙酸 (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>50 &amp;micro;M（玉米）</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;播种与幼苗处理&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸制手巾</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT 手巾卷 - 白色；单张尺寸 (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>种子发芽纸</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# 种子发芽纸</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont 镊子 a 型编号 5；Dumont 镊子 e 型编号 7</td></tr><tr><td>250 ml（离心）管</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>直径约 5.6 cm，高 14.7 cm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>700 ml 管</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>圆柱形带底座管，D 60&amp;nbsp; x 250</td></tr><tr><td>支架</td><td></td><td></td><td>用于玉米管，自制</td></tr><tr><td>无菌水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;生长条件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生长箱</td><td></td><td></td><td>27 &amp;deg;C，持续光照，相对湿度 70%</td></tr></tbody></table>

可诱导侧根系统 拟南芥 和玉米

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

侧根发育对根系的形成具有重要贡献，因此对植物生长至关重要。然而，侧根起始的研究较为繁琐，因其仅发生在根内少数细胞中，且发生方式难以预测。为解决这一问题，已开发出一种侧根诱导系统（Lateral Root Inducible System, LRIS）。通过连续使用生长素运输抑制剂和人工合成的生长素处理幼苗，可在主根中实现高度可控且同步的侧根起始，从而能够大量获取特定发育阶段的样本。该LRIS最初是为 拟南芥，但也可应用于其他植物。因此，该方法已针对玉米（maize）进行了调整和应用。玉米（Zea mays））。本文详细介绍了该系统在两种植物中的不同操作步骤。将此系统与比较转录组学相结合，可实现对功能同源基因的鉴定 拟南芥 其他物种中的侧根起始基因，如此处所示 CYCLIN B1;1 (CYCB1;1 玉米中的细胞周期基因。最后，讨论了在为其他植物物种开发LRIS时需要考虑的原则。

应用LRIS技术对侧根起始过程进行比较转录组学分析
LRIS 的一个应用是在不同物种中比较和关联侧根形成过程中的基因表达谱。比较转录组学方法使得鉴定在不同物种侧根发育过程中发挥作用的同源基因成为可能。侧根起始由已形成的根轴内特定细胞亚群形成新器官的过程组成，是被子植物调控根系结构所共有的主要机制。因此，该过程很可能起源于共同祖先中存在的已有通路，并在进化过程中得以保留。事实上，已在不同物种中发现了一些共同的侧根起始潜在调控因子17, 18。
使用LRIS进行采样 拟南芥 和玉米，以及转录组分析
<p class="jove_content" fo:ke...

侧根诱导系统（LRIS）可实现侧根的同步诱导，本文介绍了该系统在拟南芥（Arabidopsis thaliana）和玉米中的应用。

侧根发育对根系的形成具有重要贡献，因此对植物生长至关重要。侧根起始的研究是……

侧根诱导系统的主要目标是通过激素处理同步诱导植物侧根的起始。植物根系处于地下，通常难以研究。我们开发了一种体外培养系统，可在细胞学、组织学和分子水平上研究侧根起始的过程。通常，刚接触该方法的科研人员可能会遇到困难，因为植物未能与培养基充分接触，从而导致侧根诱导不均匀。通过直观演示该方法，有助于展示为确保均匀诱导所需注意的关键步骤。尽管该系统最初是在模式植物拟南芥中建立的，但也可应用于玉米、水稻或大麦等其他植物体系。首先，使用无菌镊子将20微米尼龙滤网贴附于添加了NPA的生长培养基上。用Drigalski刮铲轻轻按压滤网，确保其与培养基充分接触。接着，用无菌牙签轻压琼脂表面，使牙签尖端产生黏性表面。用接种针将一批经气体灭菌的种子均匀分散到已准备好的培养皿中。用透气胶带密封培养皿，并在避光条件下于 4°C 下保存至少两天，最多一周。此步骤用于春化处理，以确保种子同步且高效地萌发。在第三天，将培养皿转移至生长室，先进行两天的萌发，随后在80至90度倾斜条件下生长三天。第八天时，识别出完全与网格接触生长的根系，以及相反地，未与网格接触的根系。移除所有根系未与网格接触的幼苗。将含有幼苗的尼龙网转移至添加了10 µM NAA的培养板中。一旦放置到培养板上，如有必要，可轻轻移动尼龙网，使其与培养基表面充分接触。为了确保所有幼苗诱导的一致性，必须弃去在添加NPA的培养基上未生长至与尼龙网接触的幼苗，并在添加NAA的培养基上根据需要适当地将尼龙网与培养基表面充分接触。用透气胶带密封新培养板，并将其垂直放置于培养室中，在诱导后培养所需时间。当准备收集样品时，使用解剖刀在筛网上一次性切割根段，并通过轻轻刮取筛网表面来收集样品。接下来，我们将展示玉米侧根诱导系统的一些操作步骤。首先将所需数量的玉米籽粒放入无菌玻璃烧杯中，以对玉米籽粒进行灭菌处理。然后向烧杯中加入100毫升6%次氯酸钠水溶液，并放入一个磁力搅拌子。将烧杯置于磁力搅拌器上，在室温下以低速搅拌5分钟。轻轻移除漂白液，加入 100 毫升新鲜无菌水，冲洗籽粒 5 分钟。重复此步骤 5 次。戴上一副手套，撕下两张手用纸巾，将它们重叠放置在干净的表面上。然后，沿长度方向将纸巾对折。使用镊子将10粒种子均匀分布在纸巾上，距离顶端约两厘米，沿纸巾全长放置，每粒种子之间间隔八厘米，纸巾两端各留出八厘米空白区域。确保种子的胚根朝下并朝向纸面。轻轻将纸沿长度方向卷起，同时保持种子位置固定。如有必要，可用无菌水喷湿纸张以方便操作。将纸卷放入已灭菌的玻璃管中，并将其他玻璃管组合到试管架中。向管内的纸卷上倒入 125 毫升 50 微摩尔的 NPA 溶液。纸卷将吸收溶液并完全浸透。将纸卷系统放入培养柜中培养三天。在培养期间，根据需要添加额外的NPA溶液，以确保纸卷始终保持浸润状态。为了确保侧根起始的均一诱导，需注意检查纸卷在NPA溶液中保持湿润，但根部不应完全浸没在液体中。在NPA培养基上培养三天后，玉米幼苗已长出细小的茎和长约两到三厘米的根。第四天，轻轻挤出纸卷中残留的大部分NPA溶液，将纸卷放入无菌水中直至充分吸水饱和。约五分钟后，再次轻轻挤出纸卷中的大部分水分。重复洗涤步骤三次。最后一次漂洗后，挤出大部分水分，并将材料放回管中。向管内的纸卷上倒入50 µM的NAA溶液，直至纸卷完全浸透。然后，将滤纸卷系统置于培养柜中，在诱导后培养所需的时间。与未在NAA上生长或在NAA上生长一小时的生长素响应标记品系pDR5-GUS幼苗相比，在NAA上生长两小时的幼苗表现出生长素响应，这是触发侧根起始的早期事件之一。这些细胞分裂从约两小时开始从根尖向上延伸，并随着NAA处理时间的延长而增加。利用细胞周期标记品系 pCYCB1;1-Gus，可在开始 NAA 处理约六小时后观察到导致侧根形成的首次细胞分裂。可通过微阵列和定量 rt-PCR 检测拟南芥和玉米根部不同区域在侧根诱导过程中多种基因的表达情况。在拟南芥和玉米中，当植株生长较长时间后，诱导产生的细胞分裂将促进侧根的发育和伸长。作为该系统在玉米中应用的概念验证，以下是在不同条件下培养以供比较的幼苗。在水中培养10天的幼苗，其侧根启动不同步，并沿轴向分布稀疏。在NPA培养基上培养10天的幼苗则完全不产生侧根。在NPA上生长三天后，再进行NAA处理的幼苗，表现出大量且同步的侧根诱导现象。在本视频中，我们向您展示了如何建立一个侧根诱导系统，该系统在发现根分枝过程中的基本新机制方面已证明极为关键。我们已向您演示了该系统在拟南芥和玉米中的应用，但它也可轻松适用于其他选定的植物物种。祝你好运。

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生物学

侧根诱导系统<em&gt;拟南芥</em&gt;和玉米

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木质素下调 Zea mays 通过dsRNAi和Klason木质素分析

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一种用于绘制植物根系构型性状的简易方案

学习侧根诱导系统（LRIS）在拟南芥和玉米中的同步诱导方法，利用激素处理研究侧根起始的细胞学和分子机制。该系统为植物根系发育研究提供了重要的实验工具。

可诱导侧根系统拟南芥和玉米

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