Name: 产妇血管重构的评估在怀孕期间在小鼠子宫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解小鼠妊娠期间母体血管重构的评估方法。本技术采用立体计量学进行定量分析，并通过免疫组织化学验证血管平滑肌肌动蛋白的表达，为研究母体血管适应及其对胎儿生长的影响提供可重复的实验方案。

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作者感谢 Colucci 实验室所有成员的有益讨论。本工作由惠康信托基金 [094073/Z/10/Z]、滋养层研究中心以及英国心脏基金会资助。

本手稿中讨论的所有操作程序均符合英国政府内政部法规，并已获得剑桥伦理审查小组的批准。
1. 标本采集
<ol>
	<li>在下午使用8-12周龄的C57BL/6雌性小鼠与成年雄鼠进行定时交配（每只雄鼠最多配2只雌鼠）。在随后几天的清晨检查阴道栓的存在以判断是否交配成功。清晨发现阴道栓即记为妊娠第0.5天（gd0.5）。</li>
	<li>在妊娠第9.5天（gd9.5），通过颈椎脱位法处死动物，并打开腹腔。注意：使用CO2处死可能导致血管扩张。</li>
	<li>用牙线轻轻结扎子宫动脉（图1，虚线箭头所示）。在每侧子宫角顶端靠近卵巢处以及宫颈周围，将牙线绑在子宫动脉上。 
	注意：避免破裂血管，否则可能导致动脉塌陷。</li>
	<li>使用解剖剪迅速解剖子宫，从两侧子宫角顶端和宫颈处的三个结扎点远端完整切除整个子宫。</li>
	<li>将子宫放置在预先准备好的聚苯乙烯板上，使两个子宫角以宫颈为中心沿同一长轴向相反方向排列。轻轻拉伸，并用2-3枚25 G针固定位置。</li>
	<li>将聚苯乙烯板浸入已准备好的50 ml锥形管中，加10%甲醛溶液至50 ml，室温固定5-6小时。</li>
	<li>弃去甲醛溶液，加入50 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗5分钟。</li>
	<li>从两端子宫角结扎点近端及中央宫颈近端切除两个子宫角，修剪掉着床部位周围的多余脂肪组织，并用PBS洗涤两次，每次5分钟，以去除残留的甲醛。&#160;</li>
	<li>将样本置于70%乙醇中，4 °C保存（最长两周），待后续处理。 
	警告：乙醇高度易燃。</li>
	<li>使用自动组织处理仪，按照表1中所示参数进行处理。将子宫角单独包埋于石蜡中，使其切面垂直于子宫长轴。这可确保每个着床部位的最大面积在蜡块中央被暴露，便于分析（图2A）。 
	可选：若需随机化处理，此为进行蜡块随机化的合适时机。</li>
	<li>使用切片机从蜡块上连续切取7 µm厚的切片。每隔49 µm取一张切片，用苏木精和伊红（H&amp;#38;E，见第2.1节）染色。其余切片在室温下保存，用于SMA染色及其他后续应用。</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:99px;">溶液</td>
			<td style="width:43px;">时间</td>
			<td style="width:97px;">温度</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% 乙醇</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% 乙醇</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% 乙醇</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% 乙醇</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% 乙醇</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% 乙醇</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% 乙醇</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">二甲苯</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">二甲苯</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">二甲苯</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">石蜡</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>63 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">石蜡</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>63 °C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">石蜡</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>63 °C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">石蜡</td>
			<td>1 小时</td>
			<td>63 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：自动组织处理的设置。 子宫组织处理过程中所用设置的概述
2. 体视学评估
<ol>
	<li>苏木精-伊红（H&E）染色
	<ol>
		<li>将载玻片置于切片架中，浸入100%二甲苯溶液中10分钟，于室温下脱蜡。 
		注意：二甲苯易燃，疑似致癌物，可通过接触和吸入产生毒性。操作必须在通风橱中进行，并佩戴个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>将载玻片浸入洁净的二甲苯溶液中，继续处理10分钟。</li>
		<li>依次将载玻片浸入100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和纯化水中，每种溶液各5分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入50% Gill III号苏木精溶液（用纯化水稀释）中染色5分钟。 
		注意：苏木精经口摄入或接触眼睛有害。操作时应穿戴适当的个人防护装备。</li>
		<li>在染色槽中用流动自来水冲洗载玻片10分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入1%酸性乙醇溶液（含1% 10 M盐酸的70%乙醇溶液）中10秒，随后在染色槽中用流动自来水冲洗。</li>
		<li>将载玻片浸入伊红溶液中染色30秒，然后在染色槽中用流动自来水冲洗10分钟。</li>
		<li>在通风橱内，依次将载玻片浸入70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇溶液中，每种溶液各5分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入二甲苯溶液中10分钟。</li>
		<li>使用基于二甲苯的封片介质封片。封片后在通风橱中水平放置，彻底干燥，然后在显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血管大小及重塑状态的体视学评估
	<ol>
		<li>针对每个植入部位，确定接近正中矢状面的切片。胎儿与发育中胎盘之间的绒毛尿囊连接处可作为判断正中矢状面的良好标志。</li>
		<li>在接近正中矢状面的区域，选择间隔49 µm的3个切片进行分析。扫描所选载玻片。为避免纳入已知位于植入部位更外周区域的静脉16，分析应限制在每个植入部位中央2/4区域内（图2A）。</li>
		<li>为评估管腔大小，沿血管内侧边界绘制轮廓，并记录该形状的面积。为评估总血管大小，沿血管外壁绘制轮廓，包括内皮细胞、周细胞和血管壁内白细胞。 
		注：总血管大小与管腔大小的比值可作为血管重塑状态的替代指标。由于血管在切片平面内呈螺旋走行，同一动脉可能在一张切片中出现多个横截面。应避免对同一动脉重复测量。</li>
		<li>记录每个植入部位中管腔最大且最接近圆形的5个血管的测量数据。每个植入部位进行三重复测量（三个切片相互间隔49 µm）。这15个测量值的平均值代表最大血管的平均直径。</li>
		<li>为避免某些样本中较大血管被过度代表，应在每个植入部位测量相同数量的血管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用免疫组织化学进行定性评估
<ol>
	<li>脱蜡与复水
	<ol>
		<li>将载玻片置于耐热载玻片架中，浸入100%二甲苯溶液中10分钟（室温），以完成脱蜡。</li>
		<li>将载玻片再浸入盛有洁净二甲苯的容器中，继续处理10分钟。</li>
		<li>依次将载玻片浸入100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和纯化水中，每种溶液各5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原修复
	<ol>
		<li>用纯化水配制10 mM柠檬酸钠缓冲液，并用10 M盐酸调节pH至6.0。</li>
		<li>取一个可容纳600 ml液体的耐热容器，加入400 ml柠檬酸钠缓冲液，放入家用高压锅中，锅内加水至能淹没容器一半高度。将高压锅盖松松盖上，加热至沸腾。</li>
		<li>将载玻片架放入柠檬酸钠缓冲液中，旋紧高压锅盖。待压力上升后，持续煮沸3分钟。</li>
		<li>释放高压锅压力，取出内胆容器。让载玻片在柠檬酸钠缓冲液中于室温下冷却10分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入盛有纯化水的容器中清洗5分钟。</li>
		<li>使用疏水屏障笔在组织周围画圈。</li>
		<li>将载玻片浸入PBS溶液中清洗5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭内源性过氧化物酶及非特异性结合位点
	<ol>
		<li>在湿盒中，用3%过氧化氢（以纯化水稀释）孵育组织切片，室温孵育30分钟。 
		注意：过氧化氢对眼睛、皮肤具有强刺激性，误食亦有毒。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>倾去多余的过氧化氢溶液，将载玻片浸入Tris缓冲盐水（TBS）中清洗两次，每次2分钟。</li>
		<li>根据试剂盒说明书配制小鼠免疫球蛋白封闭试剂，并孵育组织切片。</li>
		<li>用TBS清洗载玻片两次，每次2分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>平滑肌肌动蛋白的免疫检测
	<ol>
		<li>配制抗体稀释液（试剂盒提供），室温孵育切片5分钟，或按照制造商说明书操作。</li>
		<li>用抗体稀释液将鼠抗人平滑肌肌动蛋白抗体（DAKO M0851）按1:100比例稀释；同时用抗体稀释液稀释鼠IgG2a同型对照抗体，确保两种溶液中免疫球蛋白的终浓度相等。</li>
		<li>倾去多余的抗体稀释液，分别在组织上覆盖稀释后的一抗或同型对照溶液。在湿盒中室温孵育30分钟。</li>
		<li>用TBS清洗载玻片两次，每次2分钟。</li>
		<li>稀释生物素标记的抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟，或按照制造商说明书操作。</li>
		<li>分别用TBS和PBS各清洗一次，每次2分钟。</li>
		<li>根据制造商说明书配制3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液。用DAB溶液覆盖组织，孵育时间最长不超过4分钟，并密切观察染色情况，避免显色过深。 
		注意：DAB易燃，疑似致癌物，可通过接触和吸入引起中毒。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>当染色强度达到理想水平时，将载玻片浸入纯化水中终止反应。</li>
		<li>用50% Gill III型苏木精复染20秒&#160;，然后在流水染色槽中用自来水冲洗至水流清澈。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水与封片
	<ol>
		<li>在通风橱内，依次将载玻片浸入70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇中，每种溶液各5分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入二甲苯溶液中10分钟。</li>
		<li>使用以二甲苯为基质的封片介质封片。封片后在通风橱内水平放置，彻底干燥后再于显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li>
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<li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+uterine+natural+killer+cells+are+mediated+by+interferon+gamma+production+during+murine+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy.</a> Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).</li>
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<li>Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC-dependent+inhibition+of+uterine+NK+cells+impedes+fetal+growth+and+decidual+vascular+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell-triggered+vascular+transformation%3A+maternal+care+before+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth.</a> Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).</li>
<li>Adamson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+trophoblast+cells+and+the+maternal+and+fetal+circulation+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).</li>
<li>Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model%3A+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li>
<li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li>
<li>Zhang, J. H., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Ultrasonography+to+Define+Fetal-Maternal+Relationships%3A+Moving+from+Humans+to+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Med%22%5BJournal%5D)">Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice.</a> Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案旨在提供一种可重复的方法，用于评估成功妊娠所必需的血管变化。该评估成功的关键在于组织切片的质量。准确确定植入部位的妊娠天数以及可靠地结扎子宫动脉均为至关重要的步骤。固定时间、组织处理流程等参数的改变也可能影响实验结果。为了实现无偏倚的体视学评估，重要的是在每个植入部位测量相同数量的血管。建议每个植入部位测量5条血管，并对每个植入部位设置三个重复。这15次测量的平均值代表5条最大血管的平均尺寸。
除了本文所示的无淋巴细胞 Rag2-/-IL2rg-/- 小鼠的数据外，我们发现该方案还可用于多种母体免疫功能不足的模型，包括自然杀伤细胞（NK细胞）受抑制的模型14。在滋养层细胞侵袭受损的模型中也已观察到动脉重塑缺陷18，本文所述技术可能有助于评估这些情况下的血管结构。我们已针对小鼠妊娠中期蜕膜血管重塑的研究对该方案进行了优化和验证，但该方案亦可合理地调整用于其他模式系统（例如大鼠）甚至其他器官。尽管我们发现NK细胞依赖性的血管重塑在妊娠第9.5天（gd9.5）可被稳健评估，但该方案也可修改用于其他时间点，例如妊娠第12.5天（gd12.5），此时母体血管已完全重塑。在该时间点，血管内滋养层细胞侵袭更深16，因此可能更适用于研究滋养层细胞在血管变化中的作用。若需要额外的定量读数，研究者还可增加SMA染色切片的数量，并评估每个着床部位中部分重塑血管所占的比例。
本方案的一个局限性在于组织学检查的描述性本质。然而，功能性检测方法目前才刚刚逐步出现（例如多普勒超声19）。这些技术需要专业的操作技能，且在设备购置和维护方面成本显著更高，但其优势在于能够对组织学上可观察到的改变提供纵向的活体（in vivo）功能读数。所有体视学检查可能存在的一个缺点是研究者主观判断的影响。为解决这一问题，可采用两名独立的观察者分别对所有样本进行独立分析，以避免偏差。尽管本文所述方案有助于了解有多少血液能够到达母胎界面，但将其与通过塑料铸型技术评估血管系统中任意时间点的总血量这一互补方法相结合，可能会更具优势16。
本方案的优势在于结合了两种独立的方法。首先通过体视学对血管变化进行定量评估，然后利用免疫组织化学对该结果进行定性验证。通过随机化处理样本，可进一步增强结果的可靠性。本方案所制备的样本还可轻松用于研究妊娠的其他参数，例如蜕膜化、妊娠期子宫系膜淋巴样聚集体（MLAp）的发育或特定细胞的免疫检测，从而在妊娠中期对妊娠表型进行严格评估。
动脉重塑是女性正常妊娠的关键步骤，此类改变的失败是妊娠重大综合征（GOS）的基础，即子痫前期、胎儿生长受限和死产。本文介绍了用于在模拟GOS部分病理生理特征的小鼠模型中精细评估妊娠表型的技术。

在真兽类妊娠期间，营养物质、气体和代谢废物的交换由胎盘介导。在雌性生殖道中，子宫动脉是向子宫供血的主要血管。着床后，这些动脉分支形成一种称为螺旋动脉的特化血管，螺旋动脉盘绕穿过基蜕膜，延伸至胎儿-胎盘单位。这些螺旋动脉的直径和弹性决定了可供胎盘利用的血流量和血流速度，而其周围分布有白细胞，特别是子宫自然杀伤细胞（uNK细胞）1,2。螺旋动脉经过重塑所产生的正确血流动力学变化，对妊娠成功至关重要。
尽管人类与小鼠妊娠的潜在机制在细节上有所不同，但这两个物种在重塑过程的最终结果上具有一致性，即血管扩张、高通透性，并失去其平滑肌层。在小鼠中，约在妊娠中期，由子宫自然杀伤（uNK）细胞分泌的干扰素（IFN-γ）对于诱导这些变化至关重要3-5。缺乏NK细胞或IFN-γ信号通路组分的小鼠无法完成这些血管重塑过程，并伴随胎儿生长受限6,7，这凸显了胎儿-胎盘单位获得充足血液供应的重要性。在人类早期妊娠过程中，绒毛外滋养层细胞的间质性及血管内侵袭，以及其与uNK细胞的相互作用，对于诱导血管重塑和促进胎儿生长具有重要作用8-10。uNK细胞可通过趋化因子11以及如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等细胞因子来调控人类滋养层细胞的侵袭行为12。滋养层细胞侵袭过浅与动脉重塑不足相关，并可导致子痫前期等妊娠并发症9。
本方案基于Anne Croy的开创性工作，她通过免疫组织化学和精巧的细胞转移实验，阐明了免疫系统特别是自然杀伤细胞（NK）来源的干扰素-γ（IFN-γ）在成功实现螺旋动脉血管重塑中的重要作用5,13。本文描述了一种快速且经济的方法，用于评估螺旋动脉的重塑状态。尽管本实验室通常在妊娠中期（妊娠第9.5天（gd9.5））进行评估14，但血管重塑过程发生在gd8.5至gd12.5之间15。自动切片扫描仪的出现极大地促进了从组织切片中对血管和管腔面积的定量分析，我们发现这种方法比测量血管直径更具可重复性。通过添加针对平滑肌肌动蛋白（SMA）的免疫组织化学染色，可对体视学评估所得结果进行简便验证。与所有体视学技术一样，建议至少由两名评估者以盲法方式进行评估。为此，可在连续切片过程中引入随机化步骤，确保评估切片的研究人员不知道样本所属的实验分组。
本实验方案的总体目标是提供一种可靠的工具，用于在妊娠相关并发症的小鼠模型中，针对具有明确母体和父体基因型的小鼠，精确评估螺旋动脉的重塑过程。研究结果强调了该过程对子宫自然杀伤细胞（uNK细胞）的依赖性，而这一依赖性对于胎儿正常生长发育至关重要。

<table><tbody><tr><td>8-12 周龄 C57BL/6 小鼠</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牙线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯</td><td></td><td></td><td>用于固定组织位置</td></tr><tr><td>直头解剖剪</td><td>EMS</td><td>72940</td><td></td></tr><tr><td>25 G 针头</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>300600</td><td>用于固定组织位置</td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Sigma</td><td>327204-1KG</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0250/17</td><td></td></tr><tr><td>自动组织处理仪</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>载玻片架</td><td>Sigma</td><td>Z710989</td><td></td></tr><tr><td>柯普林瓶</td><td>Sigma</td><td>S5891</td><td></td></tr><tr><td>纯水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吉氏苏木精溶液，3 号</td><td>Sigma</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y 溶液</td><td>Sigma</td><td>HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>通风橱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>基于二甲苯的封片介质</td><td>VWR</td><td>361254D</td><td></td></tr><tr><td>切片扫描仪</td><td>Hamamatsu</td><td>NanoZoomer</td><td></td></tr><tr><td>切片扫描仪软件</td><td>Hamamatsu</td><td>NDP viewer</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠二水合物</td><td>Sigma</td><td>32320</td><td>配制 10 mM 溶液并调节 pH 至 6</td></tr><tr><td>压力锅</td><td></td><td></td><td>用于抗原修复</td></tr><tr><td>加热板</td><td></td><td></td><td>用于抗原修复</td></tr><tr><td>疏水屏障笔</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1800/15</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐水</td><td>Sigma</td><td>T6664-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>小鼠组织防背景干扰试剂盒（Mouse on mouse kit）</td><td>Vector</td><td>BMK-2202</td><td>显著降低背景信号</td></tr><tr><td>小鼠抗人平滑肌肌动蛋白抗体</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td>与小鼠组织交叉反应</td></tr><tr><td>IgG2a 同型对照</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td></td></tr><tr><td>湿盒</td><td>Sigma</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-二氨基联苯胺溶液</td><td>Sigma</td><td>D4293-5SET</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1050/PB17</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠子宫妊娠期间母体血管重塑的评估

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

胎盘介导母体与胎儿之间气体和营养物质等因素的交换，并对母体循环的血液供应有特定需求。母体子宫血管需要适应这一暂时性需求，而动脉重塑过程的成功与否直接影响胎儿的生长发育。母体免疫系统的细胞，尤其是自然杀伤（NK）细胞，在此过程中发挥关键作用。本文描述了一种评估小鼠妊娠期间母体螺旋动脉重塑程度的方法。通过扫描苏木精和伊红染色的组织切片，分析血管的大小。作为补充验证方法，我们还通过免疫组织化学方法对平滑肌肌动蛋白（SMA）进行定性评估，以判断重塑过程的成功程度；正常情况下，SMA在妊娠中期会从动脉血管中膜消失。上述两种方法结合使用，可确定妊娠表型的一个重要参数。这些结果可与其他小鼠妊娠终点指标相结合，有助于深入理解妊娠相关并发症的潜在机制。

Rag2-/-IL2rg-/- 小鼠缺乏所有成熟的淋巴细胞，包括自然杀伤细胞（NK细胞）17，其子宫动脉无法像同源野生型 C57BL/6（WT）小鼠在妊娠中期左右那样发生血管结构改变5,14。由于血管重塑减少，Rag2-/-IL2rg-/- 小鼠的管腔表面积显著减小，提示整体血管尺寸较小，这一现象可在苏木精-伊红（H&amp;E）染色切片中观察到，并通过体视学方法进行定量分析（图2）。此外，这些小鼠螺旋动脉的相对管壁厚度（血管外径与管腔直径之比）更高，提示血流供应减少且血流速度增加。
这一定量评估通过SMA的免疫组织化学检测得以证实。对于野生型小鼠而言，其螺旋动脉血管中膜内的SMA在妊娠中期大部分消失是典型特征。如果NK细胞驱动的这一过程未发生，则SMA仍保留在血管中膜，并可通过免疫组织化学方法轻易检测到，表现为围绕血管周围的环状结构（图3）。
<img alt="子宫解剖示意图；标注子宫角和宫颈；用于教学；生殖系统研究。" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：妊娠9.5天小鼠子宫示意图。 图示子宫角、宫颈（蓝色）和主要子宫动脉（红色）的相对位置。图中显示了子宫角的长轴方向（箭头）以及结扎位点（虚线箭头）。免疫组织化学切片沿图示平面进行切割。
<img alt="H&amp;E 染色，组织横截面示意图；包含管腔横截面积，血管/管腔比例图。" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2">
图2：中期妊娠时动脉重塑的体视学评估。（A）在gd9.5时，野生型雌鼠底蜕膜中央2/4区域（由垂直黑色虚线标示）H&amp;E染色切片中管腔和血管总面积的评估示例。在高倍镜下的血管中，红色虚线标示血管总面积，黄色虚线标示管腔面积。标尺 = 500 µm（左），50 µm（右）。在此方位下，子宫的长轴为水平线。（B）野生型（C57BL/6）和Rag2-/-Il2rg-/-小鼠（C57BL/6背景）的管腔面积（左图）及管腔面积与血管总面积之比（右图）的定量分析。每个数据点代表15次测量的平均值（每张切片测量5次，每个着床部位取3张切片）。柱状图表示每组4次妊娠中n = 11–13个着床部位的平均值；p值来自双尾非配对Mann-Whitney检验。WT：野生型。
<img alt="组织中平滑肌肌动蛋白表达；WT与Rag2–/–Il2rg–/–样本的免疫组织化学结果比较" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：蜕膜基底层中平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学检测。 在妊娠9.5天（gd9.5）的野生型（WT，上图）和Rag2-/-IL2rg-/-小鼠（C57BL/6背景，下图）中SMA染色的代表性结果。标尺 = 100 µm。WT：野生型。

本方案描述了一种用于评估小鼠妊娠期间母体血管系统变化的技术。通过体视学方法对蜕膜螺旋动脉的重塑进行定量评估，并利用免疫组织化学方法进行定性验证。

胎盘介导母体与胎儿之间气体和营养物质等因子的交换，并对母体和胎儿血供具有特定需求……

本实验的总体目标是评估小鼠妊娠期间胎儿和胎盘正常生长所必需的母体血管变化。因此，该方法可用于细致表征妊娠期间发生的母体血管适应性改变，而这种适应性改变可能对胎儿生长具有重要意义。该技术的主要优势在于，它能够提供一种可靠且可重复的体视学读数结果，并可通过免疫组织化学方法检测残留的血管平滑肌肌动蛋白来验证结果。该方法的可视化演示至关重要，因为子宫组织的正确制备方向在妊娠过程中会发生显著变化，这是本实验成功的关键。在妊娠第9.5天，将一段牙线小心地穿过一只妊娠C57黑六小鼠靠近卵巢一侧的子宫角下方，并轻轻但牢固地结扎牙线以阻断子宫动脉。在另一侧子宫角下方及宫颈周围重复进行结扎，以防止动脉塌陷。然后迅速在子宫角尖端和宫颈处的三个结扎点远端完整切除整个子宫。将子宫放置在一块聚苯乙烯上，使两个子宫角沿宫颈向相反方向对齐于同一长轴。接着用2到3根25号针头轻轻拉伸组织，并将其固定到位。将聚苯乙烯浸入50毫升锥形管中，并用最多50毫升的10%福尔马林在室温下固定子宫组织。子宫组织非常脆弱，在固定前需小心操作，以避免损伤或撕裂。5至6小时后，更换为50毫升磷酸盐缓冲液（PBS），洗涤5分钟。然后在两端结扎点附近以及中间宫颈结扎点附近分离子宫角。修剪掉着床部位多余的脂肪组织。随后用 PBS 再次清洗子宫两次，每次五分钟，以彻底去除残留的甲醛，并将组织置于70%乙醇中，于4°C下保存，使用自动处理系统，参数设置见下表所示。将角单独包埋于石蜡中，以便沿子宫长轴垂直的平面进行切片。所有样品必须以相同的方向包埋，以确保在切片时不同着床部位具有相同的横截面形态。使用切片机获取连续的7微米厚切片后，每隔49微米用伊红-苏木精对一张切片进行染色，并将切片于室温保存，用于后续分析。为了评估每个植入部位的血管尺寸和组织重塑状态，选择靠近正中矢状面、间隔为49微米的三个切片。扫描所选切片后，将分析范围限制在每个植入部位中央的二分之一区域，以避免包含静脉。为了评估管腔大小，选择血管内壁周围的感兴趣区域，并记录该区域的面积，以获得总血管尺寸。在血管外壁周围绘制一个感兴趣区域，包括内皮细胞、寄生虫和血管壁内白细胞。最后，在避免对同一条动脉重复测量的前提下，从每个植入部位管腔最大且最圆的五条血管中，每条血管重复测量三次并记录数据，这些特征源于免疫缺陷型 Rag2 IL-2 受体 γ 链敲除小鼠所表现出的较少重塑现象。这些动物还显示出显著更小的管腔表面积，提示其血管总体尺寸较小，可通过本图所示的野生型小鼠 H&E 染色进行观察，并通过体视学方法进行定量分析。此外，这些小鼠的螺旋动脉中血管与管腔的相对比例较高，提示免疫缺陷小鼠的血液供应减少且血流速度增加。该代表性实验的定量评估通过平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学检测得以证实，野生型小鼠在妊娠中期时，螺旋动脉血管中膜的平滑肌肌动蛋白大部分已消失。然而，如果自然杀伤细胞介导的这一过程未能发生，平滑肌肌动蛋白则会保留在血管中膜中，可在血管周围观察到呈棕褐色环状染色的结构。一旦切片完全制备完成，可在数天内合理完成测量及免疫组织化学验证，从而减少所需实验动物的数量。该方案可与其他技术（如流式细胞术）结合使用，以研究母体白细胞群体或免疫功能。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估大多数妊娠期间发生的母体血管适应性变化。

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