Name: 造型卵巢癌传播在人类腹腔的器官文化的早期步骤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 探索利用原代人腹膜间皮细胞和成纤维细胞构建三维器官型培养模型的方法。该技术可模拟腹膜微环境，用于研究卵巢癌细胞粘附、侵袭和增殖行为，并测试潜在抑制剂的干预效果。

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我们感谢所有住院医师和主治医师，特别是芝加哥大学妇产科的 A.F. Haney 博士，为收集大网膜活检样本提供的帮助。同时，我们感谢 Stacey Tobin 和 Gail Isenberg 对本文稿的细致编辑。本研究由芝加哥熊人橄榄球俱乐部的慈善受益机构 Bears Care、美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）R21 NS075702 项目以及美国国家癌症研究所 R01 CA111882 项目（授予 E.L.）提供资助。

所述的所有研究方案均经过芝加哥大学机构审查委员会（IRB）的审查。在手术前已从每位患者处获得知情同意，且本研究已获芝加哥大学IRB批准。处理人体组织时，应使用II级生物安全柜和手套，以提供保护并降低细胞污染的风险。
1. 原代未转化间质细胞的分离与培养
<ol>
	<li>人体组织的采集与制备
	<ol>
		<li>获取2 cm的人体大网膜标本3，于腹部手术中取出后，立即将组织浸入室温磷酸盐缓冲液（PBS）中（图2A一块3 cm × 2 cm大小的大网膜通常可获得100万个原代人腹膜间皮细胞（HPMC）和20万个原代人成纤维细胞或正常大网膜成纤维细胞（NOF）。</li>
		<li>将组织浸泡过的 PBS 以 0.5 × g 离心 3 分钟&#160;采集后应尽快进行&#60; 2 小时，PBS）后，将组织转移至含有 20 ml 新鲜 PBS 的 50 ml 锥形管中。将组织切成 5 mm3 用手术刀在直径15 cm的无菌培养皿中切碎成小块（图2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原代人腹膜间皮细胞的分离8
	<ol>
		<li>将切碎的组织转移至50 ml锥形管中，静置1分钟，以分离HPMC&#160;使固体碎片浮至顶部（图2C &amp;#38; D）。底部液体中将含有 HPMC 和红细胞（RBC）。用移液器将管底液体转移至新的离心管中。在 0.5 × g 条件下离心 3 分钟，使液体沉淀&#160;吸除 HPMC/红细胞沉淀物上的上清液。
		<ol>
			<li>重复该过程三次：向剪碎的组织中加入 20 ml PBS，静置使组织沉淀，用移液器从底部吸取液体至 HPMC/RBC 管中，离心后弃去上清液。完成所有离心步骤并吸除上清液后，沉淀物中将含有 HPMC 和 RBC。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将沉淀中的所有细胞接种至一个75 cm²培养瓶中2 在15 ml完全培养基（DMEM，含10%胎牛血清[FBS]、1% MEM维生素[93 mg/L]、1% MEM非必需氨基酸[81.4 mg/L]、1%青霉素-链霉素[Pen-Strep，100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素]）中培养。</li>
		<li>进行二次PBS洗涤以分离更多的腹膜间皮细胞。
		<ol>
			<li>对于第二次 PBS 洗涤，将残留的固体组织在 37 °C、200 rpm 条件下振荡 10 分钟&#160;在20 ml PBS中，然后等待1分钟&#160;待组织浮至顶部后，将管底液体转移至新管中，以0.5 × g离心3分钟，吸除上清液。</li>
			<li>将二次 PBS 洗涤所得的全部 HPMC/RBC 接种至另一个 75 cm² 培养瓶中2 在15 ml完全培养基中培养锥形瓶。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为分离残留的羟丙基甲基纤维素（HPMC），将切碎的组织在37 °C、200 rpm条件下振荡10分钟&#160;在20 ml体积比为1:1的0.25%胰蛋白酶-25 mM EDTA与PBS溶液中。让组织上浮，收集管底液体至新的50 ml离心管中，以0.5 g离心3分钟。
		<ol>
			<li>吸弃上清液，并将全部 HPMC/RBC 接种至另一个 75 cm² 培养瓶中2 在15 ml完全培养基中培养锥形瓶。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 37°C 和 5% CO₂ 条件下培养接种的细胞2 在湿润环境中培养。在第3天和第5天，直接加入15 ml完全培养基喂养已贴壁细胞，无需移除旧培养基。HPMC可在传代前培养5–7天。
		<ol>
			<li>所有实验均使用低传代次数的 HPMC（传代次数不超过 2 代），以最大限度减少去分化及原始表型的改变。细胞成像应使用配备塑料差分干涉（DIC）功能的宽场显微镜，优先选用 20× 物镜，或使用带相差功能（显微镜配备相差滤光片）的 4–20× 物镜；分析免疫组织化学 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）染色时，应使用 10× 物镜在明场下进行观察。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过免疫组织化学染色确认HPMC呈立方形，并表达细胞角蛋白8和波形蛋白8 (图3A、C、E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NOF 分离8
	<ol>
		<li>在PBS中配制10 ml胶原酶III型溶液（10倍浓缩液），将100倍青链霉素溶液、胶原酶III型（1,500 units活性/ml）与透明质酸酶（714 units活性/ml）按1:1:1比例混合。</li>
		<li>将 HPMC 分离后剩余的 minced omentum 组织在 10 ml 无血清培养基（DMEM 加 1% MEM 维生素 [93 mg/L]、1% MEM 非必需氨基酸 [81.4 mg/L]、1% 青霉素-链霉素 [Pen-Strep，100 U/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素]）中重悬，加入 10 倍浓度的 III 型胶原酶溶液，于 37 °C、200 rpm 振荡消化 6 小时。消化后的组织将呈现不透明状，并可能含有少量纤维状碎片图2E).</li>
		<li>离心含有NOF细胞的溶液 悬浮于0.5 × g条件下离心3分钟&#160;在室温下，吸除上清液，将沉淀物接种于75 cm²培养瓶中2 在13 ml完全培养基中培养锥形瓶。</li>
		<li>移除旧培养基，24小时后加入15 ml新鲜完全生长培养基。NOF在传代前可培养1–3天。注意：当细胞达到汇合状态时，NOF的增殖将停止。</li>
		<li>通过免疫组织化学检测，确认原代人成纤维细胞呈扁平、长梭形，并表达波形蛋白（vimentin），但不表达细胞角蛋白8（cytokeratin 8）8 (图 3B、D、F）。为尽量减少去分化，实验中应使用低代次的NOF（理想情况下在第3代之前） 以及原始表型的修饰。使用配备塑料DIC功能的20倍物镜的宽场显微镜拍摄所有细胞的相差图像，并使用10倍物镜在明场下分析免疫组化DAB染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 器官型培养的铺板8
<ol>
	<li>用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗 75 cm² 培养瓶，随后加入 3 ml 0.25% 胰蛋白酶/25 mM EDTA，作用时间不超过 5 分钟，以释放正常成纤维细胞（NOF）。用至少三倍体积的完全生长培养基中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将消化后的细胞转移至 50 ml 圆底离心管中，在 0.5 × g 条件下离心 3 分钟。弃去上清液，加入 5 ml 完全生长培养基重悬细胞。使用细胞计数仪对从培养瓶中回收的细胞进行计数。</li>
	<li>将细胞用适量完全生长培养基稀释，按每 100 µl 接种 2,000–4,000 个 NOF 的密度接种至黑色、透明底的 96 孔板中。在接种前，向细胞悬液中加入 0.5 µg/100 µl 大鼠尾胶原 I。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿润环境中孵育至少 4 小时，或直至细胞完全贴壁。</li>
	<li>采用与步骤 2.1 和 2.2 相同的方法从培养瓶中释放人腹膜间皮细胞（HPMC）。将细胞用适量完全生长培养基稀释后，按每 50 µl 接种 10,000–20,000 个 HPMC 的密度，接种至已预先铺有胶原 I 并接种了 NOF 的 96 孔板中。接种后，将细胞在 37 °C、5% CO2 的湿润环境中孵育至少 18 小时，再开始后续实验。</li>
	<li>在完全生长培养基中培养表达绿色荧光蛋白（GFP）的 HeyA8 卵巢癌细胞。HeyA8 卵巢癌细胞通过表达携带桡足类 cGFP（pCDH-CMV-MCS-EF1）的慢病毒载体实现荧光标记。实验当日，HeyA8 卵巢癌细胞应达到 80–90% 汇合度（处于对数生长期）。采用与原代细胞步骤 2.1–2.2 相同的方法从培养板中释放细胞并进行计数。</li>
	<li>将卵巢癌细胞置于圆底离心管中，于 37 °C 的完全生长培养基中恢复 15–20 分钟&#160;，管盖保持松动状态。</li>
</ol>
3. 黏附实验8
<ol>
	<li>复苏后，将卵巢癌细胞在 0.5 × g 条件下离心 3 分钟&#160;以形成细胞沉淀，弃去上清液，并用适量无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度至 50,000 个细胞/100 µl。</li>
	<li>将含有 HPMC/NOF 类器官培养物的 96 孔板倒置，弃去旧培养基，然后向每孔加入 100 µl 无血清培养基中的癌细胞悬液。将培养板置于 37 °C、5% CO2 的湿润环境中孵育 30 分钟&#160;至 4 小时。</li>
	<li>将 96 孔板倒置以去除培养基和未贴壁细胞。使用多通道移液器在低速模式下小心轻柔地向每孔加入 100 µl PBS，再次倒置培养板。重复 PBS 洗涤一次。</li>
	<li>倒置培养板以去除 PBS，然后向每孔加入 100 µl 4% 多聚甲醛。静置 20 分钟&#160;以固定细胞。20 分钟后，倒置培养板并加入 100 µl PBS。</li>
	<li>注意：可报告各孔的总荧光强度，也可对细胞数量进行定量。如需定量，首先使用 HeyA8 细胞以 100 万个细胞/ml 的浓度设置复孔标准曲线。
	<ol>
		<li>通过离心收集 100 万个细胞，弃去培养基，加入 1 ml 4% 多聚甲醛，室温静置 20 分钟进行固定。</li>
		<li>再次离心细胞，用 1 ml PBS 重悬（重新计数以确认细胞浓度为 100 万个/ml）。将 50,000、40,000、30,000、20,000、10,000、5,000、1,000 和 0 个细胞分别接种至各孔，每种浓度设复孔，并加入 PBS 使每孔终体积为 50 µl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用荧光酶标仪对培养板进行底部读数（激发波长 = 488 nm，发射波长 = 528 nm），以高荧光孔（标准曲线上 50,000 个细胞孔）为参照进行标度。利用标准曲线计算每孔中黏附于类器官培养物上的卵巢癌细胞数量（图 4A-C）。</li>
</ol>
4. 增殖实验10
<ol>
	<li>待卵巢癌细胞恢复后（见上述步骤 2.5 和 2.6），以 0.5 × g 离心 3 分钟&#160;收集细胞，然后将细胞重悬于适量的含 1% FBS 的培养基中（DMEM 加 1% FBS、1% MEM 维生素 [93 mg/L]、1% MEM 非必需氨基酸 [81.4 mg/L]、1% 青霉素-链霉素 [Pen-Strep，100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素]），调整细胞浓度至 4,000 个细胞/150 µL。</li>
	<li>将含有 HPMC/NOF 类器官培养物的 96 孔板倒置，弃去旧培养基，每孔加入 150 µL 上述含 1% FBS 培养基的癌细胞悬液。将培养板置于 37°C、5% CO2、湿润环境中孵育 72 小时。</li>
	<li>使用荧光酶标仪每天自底部读取一次培养板荧光信号（激发波长 = 488 nm，发射波长 = 528 nm），以评估细胞的相对增殖情况。持续检测 96 小时，并在 48 小时更换培养基（图 5A-C）。更换培养基时需小心操作，避免扰动类器官结构（建议采用倒置法换液）。</li>
</ol>
5. 侵袭实验8
<ol>
	<li>在接种3D培养物之前，将7.5 µg大鼠尾胶原I加入200 µl PBS中，滴加至24孔培养板的插入式小室（孔径8 µm）内。将培养板置于4°C过夜孵育，然后在接种HPMC/NOF类器官培养物之前（见上述步骤2），立即用移液器小心吸除PBS。</li>
	<li>按照步骤3.1的方法制备卵巢癌细胞。将卵巢癌细胞接种到插入式小室上的类器官培养物时，先用移液器小心吸除小室表面多余的培养基，然后每孔加入100 µl无血清培养基中的卵巢癌细胞悬液。</li>
	<li>在插入式小室下方的孔中加入750 µl完全生长培养基，以诱导癌细胞侵袭进入类器官培养物。将培养板置于37 °C、5% CO2、湿润环境中孵育24小时。 
	注意：侵袭进入类器官培养物的卵巢癌细胞会穿过小室膜，并停留在小室的底面。</li>
	<li>孵育24小时后，用镊子夹住插入式小室，将其在盛有PBS的烧杯中短暂漂洗，然后转移至一个空的孔中。用棉签的两面彻底擦拭每个小室的上表面，持续1分钟。迅速将小室放入含有750 µl 4%多聚甲醛（每孔）的培养板中。让每个小室在多聚甲醛中固定10分钟&#160;，然后将其转移至盛有750 µl PBS的孔中。</li>
	<li>在显微镜下以2.5倍放大倍数观察已侵袭的细胞（附着并固定在小室底面的细胞）。当整个孔均处于视野范围内时，调整放大倍数至10倍，并拍摄5张图像：一张靠近孔中心，其余四张分别位于四个象限，避免拍摄过于靠近边缘的区域。每个孔均按相同模式进行成像。</li>
	<li>根据制造商提供的软件程序，统计每张图像中的细胞数量，计算每孔每个视野的平均侵袭细胞数（图6A-C），具体操作遵循其说明书。</li>
</ol>

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<li>Casey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+assay+to+measure+the+invasion+of+ovarian+carcinoma+cells+through+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).</li>
<li>Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+human+ovarian+tumor+cells+with+human+mesothelial+cells+grown+on+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix.</a> Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).</li>
<li>White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+modeling+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional modeling of ovarian cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high+throughput+screening+using+a+primary+human+three-dimensional+organotypic+culture+predicts+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy.</a> Nature Comm. , (2015).</li>
<li>Sawada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+overexpression+is+a+prognostic+factor+in+ovarian+cancer+and+an+effective+target+for+inhibition+of+peritoneal+dissemination+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion.</a> Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).</li>
<li>Kenny, H. A., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-2+functions+as+an+early+response+protein+in+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis.</a> Cell cycle. 8, 683-688 (2009).</li>
<li>Sawada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E-cadherin+promotes+ovarian+cancer+metastasis+via+alpha+5-integrin%2C+which+is+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target.</a> Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-independent+activation+of+c-Met+by+fibronectin+and+%CE%B1%285%29%CE%B2%281%29-integrin+regulates+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis.</a> Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

建立了腹膜微环境的类器官模型，以评估微环境中细胞组分和固有组分在卵巢癌扩散过程中各自的及协同的功能。文中提供了用于铺板及定制三维类器官培养体系以研究卵巢癌细胞黏附、增殖和侵袭的具体实验方案。原代人网膜间皮细胞和成纤维细胞取自患者，并在早期代次中使用，以保持其正常形态及患者间的个体差异。在该模型中，将正常网膜成纤维细胞和细胞外基质（通常为I型胶原）与原代人间皮细胞单层共同分层培养。该模型在组织学上模拟了腹膜内衬结构，使我们能够重现并研究卵巢癌转移过程中的关键事件，包括卵巢癌细胞的黏附、增殖和侵袭8,27。
此前，用于研究卵巢癌与微环境相互作用的3D模型较为有限13,14,21-25，而该3D类器官模型是首个成功重建腹膜腔间皮衬层结构的模型。人网膜组织来源于不同年龄和健康状况的患者。组织的健康状况直接影响间皮细胞和成纤维细胞的分离效果。健康组织颜色较浅，小叶较小（1–3 mm），而颜色偏橙、伴有较大脂肪小叶（&#62;5 mm）的组织则健康程度较低。当组织从手术室转移至实验室时，大部分HPMC会在初始PBS冲洗中脱落。然而，组织越健康，HPM...

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤1大多数患者在癌症已扩散至整个腹膜腔后才得以确诊。一旦癌症在腹膜腔内广泛扩散，减瘤手术和化疗通常不足以防止癌症复发和产生化疗耐药性，导致五年生存率不足30%。卵巢癌的转移主要局限于腹膜腔，其他多种癌症类型，包括胃癌、胰腺癌和结肠癌，也会转移至腹膜腔内的相同解剖部位。通常情况下，卵巢癌细胞会从原发肿瘤脱落 原位 输卵管癌或原发性卵巢肿瘤细胞以单细胞或球状体形式随腹腔液播散，并附着于大网膜、肠管及腹壁的间皮细胞表面2. 
肿瘤微环境在多种癌症的疾病进展和化疗耐药性中起着重要作用3-6。腹腔是一个独特的微环境，其大部分表面被单层间皮细胞覆盖（图1A）7。间皮层作为屏障，形成低摩擦表面，通常可防止癌细胞黏附8。在间皮层下方紧邻的是一层主要由成纤维细胞和细胞外基质（ECM）构成的结构，该结构促进癌细胞的黏附和侵袭8。卵巢癌细胞分泌多种因子，诱导间皮细胞层发生改变，从而增强卵巢癌细胞的黏附、侵袭和转移能力9,10。卵巢癌细胞通过整合素和CD44介导的机制黏附于间皮表面（图1B）11-16。
历史上，已开发出多种三维模型用于研究卵巢癌与微环境之间的相互作用。最早的一些模型聚焦于卵巢癌与细胞外基质（ECM）界面的研究17-21卵巢癌细胞-间皮细胞通讯13,14,21-24，或两者兼有25 （由我们审阅） 26). Niedbala 等发现卵巢癌细胞对细胞外基质（ECM）的黏附速度更快、结合更牢固，相较于对间皮细胞或单纯塑料表面的黏附25然而，这些模型在组织学上并不类似于腹膜微环境。因此，我们建立了一种三维类器官模型，以更全面地模拟卵巢癌的微环境。为了更深入地理解微环境在卵巢癌腹膜播散过程中所起的作用，以及癌细胞与腹膜细胞之间的相互作用，我们开发了一种三维类器官模型。 体外 腹膜腔衬里培养模型（示意图） 图1C该模型由原代人成纤维细胞和细胞外基质构成，表面覆盖一层原代人腹膜间皮细胞——每种细胞均分离自人网膜。组织学上，该模型类似于正常的腹膜或网膜内层，可提供一个用于研究肿瘤微环境、癌细胞与正常组织相互作用以及癌细胞黏附、侵袭和增殖过程的平台。8.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. 原代细胞的分离与培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3001304</td><td></td></tr><tr><td>单刃剃须刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧瓶</td><td>?</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life Technologies</td><td>16000044_3616914956</td><td></td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺的 DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM 维生素</td><td>Corning</td><td>25-020-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>摇床&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA，1× (0.25%)</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-175 培养瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>P2, P10, P20, P200 和 P1000</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Corning</td><td>带滤芯吸头 P2, P10, P20, P200 和 P1000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/设备名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注/说明&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. 三维培养接种&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>Countess</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板载玻片</td><td>Invitrogen</td><td>C10313</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液（0.4%）</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原蛋白（大鼠尾部来源）</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板，透明底，黑色</td><td>BD Biosciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/设备名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注/说明&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. 黏附实验&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>Xplorer 300</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛 PBS 溶液</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>Minimax</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/设备名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注/说明&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5. 侵袭实验&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养小室（8 µm，24 孔）</td><td>BD Biosciences</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Q-tips</td><td>cotton swabs</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200m</td><td></td></tr><tr><td>Cell Profiler</td><td>公共领域</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/设备名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注/说明&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6. 抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗整合素 &amp;alpha;V&amp;beta;3 抗体，克隆号 LM609</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1976</td><td></td></tr><tr><td>Beta 1&amp;nbsp;</td><td>Oncosynergy</td><td>OS2966</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 5 [CD49e]</td><td>ID Pharmingen</td><td>555615</td><td></td></tr><tr><td>Beta 4 [CD104]</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB 2058</td><td></td></tr></tbody></table>

模拟人类腹膜腔类器官培养中卵巢癌扩散的早期步骤

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

卵巢癌的转移模式与大多数其他上皮性肿瘤显著不同，因其极少通过血行转移。相反，原发肿瘤脱落的卵巢癌细胞随腹腔液流动，播散至腹腔内的转移部位。这些部位尤其是腹膜和大网膜，均为被间皮层覆盖的器官。为研究卵巢癌扩散的过程，我们构建了一种复杂的三维培养系统，用以重建腹腔内壁结构 体外原代人成纤维细胞和间皮细胞从人网膜组织中分离获得。随后将成纤维细胞与细胞外基质混合，并在其表面覆盖一层原代人间皮细胞，以模拟转移性卵巢癌细胞所接触的腹膜和网膜表面。如图所示，该类器官模型用于研究卵巢癌扩散的早期阶段，包括癌细胞的黏附、侵袭和增殖。该模型已在多项研究中被用于探讨微环境（细胞成分与非细胞成分）在卵巢癌早期扩散过程中的作用。此外，该模型已成功应用于高通量筛选，并用于鉴定和验证卵巢癌转移的抑制剂。

通过将原代人成纤维细胞与I型胶原蛋白混合，然后在其上接种数量为成纤维细胞5倍的间皮细胞，构建出类器官培养体系。在加入卵巢癌细胞以研究其黏附、侵袭或增殖之前，该培养体系需孵育至少18小时。每项实验均使用来自不同患者的多个（n=3–5）三维（3D）类器官培养物重复进行，并在每种条件下测试多个孔以完成黏附（n=5）、增殖（n=5）和侵袭实验（n=3）。卵巢癌细胞在4小时后黏附于三维类器官培养物（图4），在72小时后在培养物上增殖（相当于HeyA8细胞倍增时间的6倍）（图5），并在24小时后发生侵袭（图6）。HeyA8卵巢癌细胞的黏附、增殖和侵袭均依赖于整合素（图4–6）。具体而言，RGD肽以及针对α5-整合素、β1-整合素和αvβ3-整合素的阻断性抗体可抑制卵巢癌细胞在类器官培养物上的黏附，而RAD肽、对照抗体及β4-整合素抗体则无此抑制作用（图4）10</...

在此，我们介绍一种构建三维的方案 体外 由原代人腹膜间皮细胞和成纤维细胞与细胞外基质分层构建的腹膜腔内衬模型，用于研究卵巢癌细胞的黏附、侵袭和增殖。

卵巢癌的转移模式与大多数其他上皮性肿瘤明显不同，因其很少通过血行转移。

本实验的总体目标是构建一种模拟腹膜微环境的器官型模型，以增进对卵巢癌生物学特性的理解。该方法有助于解答卵巢癌研究领域中的一些关键问题，例如癌细胞与微环境之间的相互作用如何促进疾病发生发展，以及如何测试针对这些相互作用的潜在抑制剂。该技术的主要优势在于，在卵巢癌细胞共培养体系中使用了真正来源于人体的原代细胞，这些细胞可形成覆盖腹腔表面的间皮层。尽管该方法可用于研究卵巢癌，也可应用于其他在腹膜腔内播散的癌症研究，例如胃癌、胰腺癌和结肠癌。获取手术切除的人大网膜标本后，应立即将样本浸入室温的PBS中。浸入后两小时内，将大网膜转移至含有20毫升新鲜PBS的50毫升锥形管中，将剩余的PBS洗涤液（含原代人腹膜间皮细胞或HPMC以及红细胞）转移至新的50毫升锥形管中，并离心收集细胞。然后将管内内容物倒入一个10厘米的无菌培养皿中，使用两把手术刀将组织切成5立方毫米大小的组织块。为了分离原代人腹膜间皮细胞（HPMC），将大网膜组织块转移至一个50毫升的锥形管中，静置1分钟。待固体组织块上浮至顶部后，HPMC将与红细胞一起沉降至管底。使用移液器将含有间皮细胞和红细胞的 PBS 洗液转移至含有沉淀细胞的离心管中，并离心收集细胞。然后向网膜中加入 20 毫升新鲜 PBS，收集含有 HPMC 和红细胞的 PBS，重复此步骤三次，将所有收集液合并至原始的细胞沉淀中。最后一次离心后，将细胞重悬并接种于 75 平方厘米的培养瓶中，加入 15 毫升完全培养基进行培养。为了从网膜样本中进一步分离H PMC，将剩余的固体组织在20毫升PBS中以200 RPM、37摄氏度振荡。10分钟后，让样本静置1分钟，使固体组织上浮至管顶。然后从管底收集H PMC和红细胞，方法如前所述。现在，将此二次洗涤的细胞离心沉淀，并将其接种于另一个75平方厘米的培养瓶中，加入15毫升完全培养基。为分离残留的腹膜间皮细胞（HPMC），将组织再次在PBS与10毫升胰蛋白酶-EDTA混合液中振荡10分钟，随后将这些HPMC和红细胞接种至75平方厘米培养瓶中，于37°C、5% CO₂的湿润环境中培养。在第3天和第5天，每次更换15毫升新鲜完全培养基，不移除旧培养基。HPMC可通过其立方状形态以及细胞角蛋白8和波形蛋白的表达进行鉴定。为了分离正常大网膜成纤维细胞，将剩余的切碎的大网膜组织用10毫升新配制的、用无血清培养基稀释的10倍浓度III型胶原酶溶液处理，在孵育结束前震荡孵育6小时。消化后的组织将变得浑浊，溶液中含有一些纤维碎片。离心正常大网膜成纤维细胞悬液，然后用13毫升完全生长培养基进行培养。24小时后，将旧培养基更换为15毫升新鲜的完全生长培养基。正常的网膜成纤维细胞可通过其扁平细长的形态、波形蛋白（vimentin）的表达以及缺乏细胞角蛋白（cytokeratin）的表达来鉴定。为从培养物中分离正常的网膜成纤维细

modeling-early-steps-ovarian-cancer-dissemination-an-organotypic

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

造型卵巢癌传播在人类腹腔的器官文化的早期步骤

本文所述的间皮清除实验利用荧光标记的细胞和延时视频显微镜技术，对卵巢癌多细胞球状体与间皮细胞单层之间的相互作用进行可视化观察和定量测量。该实验模拟了卵巢癌转移的早期步骤。...

体外 腹膜间皮清除实验：模拟卵巢癌转移早期步骤

异质性三维 体外 卵巢癌起始与进展过程中间质-上皮相互作用的建模

在本视频中，我们演示了以下内容的开发过程  一个 体外...

在腹膜腔衬里中模拟卵巢癌转移：一种建立腹膜衬里体外三维模型的方法

在本视频中，我们建立了一种体外大网膜器官培养体系，并在其上覆盖表达绿色荧光蛋白（GFP）的卵巢癌细胞，以研究卵巢癌细胞在大网膜外植体内的定植过程。该实验方案用于分析大网膜中被称为乳斑的免疫细胞结构，这些结构可促进肿瘤转移。...

建立小鼠网膜组织外植体中荧光标记卵巢癌细胞定植乳斑的离体模型方法

卵巢癌细胞侵袭腹膜间皮衬层是一个随时间动态变化的过程。利用实时分析仪，可在延长的时间段内定量评估卵巢癌细胞在球状体-间皮细胞共培养模型中的侵袭能力，从而深入了解调控转移过程的相关因素。...

实时评估卵巢癌球体对间皮细胞的黏附与侵袭

我们概述了一种同时实施两种方法的实验方案 体内 和 离体...

体内 与 离体 研究卵巢癌转移定植腹膜脂肪中乳斑结构的方法

为了阐明卵巢癌腹膜播散的多步骤过程，本研究通过将这些肿瘤细胞进行原位接种，建立了一种小鼠实验模型，用于原发肿瘤的形成及腹膜转移的研究。<br...

小鼠原位接种卵巢癌细胞构建原发肿瘤及腹膜转移的实验模型 via 正位接种卵巢癌细胞

为了在生理相关模型中研究卵巢肿瘤的进展，将多细胞球体在微流控装置中于模拟流体流动条件下进行培养。该动态三维模型模拟了卵巢癌转移发生的腹腔内环境，包含其中的细胞和机械组分。...

模拟卵巢癌多细胞球体在动态三维腹膜微装置中的行为

本方案描述了一种癌细胞与大网膜相互作用的三维（3D）ex vivo...

一个 离体 利用人网膜建立卵巢癌腹膜转移模型

该方案详细描述了高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）小鼠模型的建立方法 体外 和 体内从小鼠输卵管类器官的建立，到通过基因改造模拟人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的遗传特征，再到将其移植至同系小鼠卵巢囊腔中 体内...

由小鼠输卵管上皮细胞建立类器官系用于高级别浆液性卵巢癌建模

探索利用原代人腹膜间皮细胞和成纤维细胞构建三维器官型培养模型的方法。该技术可模拟腹膜微环境，用于研究卵巢癌细胞粘附、侵袭和增殖行为，并测试潜在抑制剂的干预效果。

模拟人类腹膜腔类器官培养中卵巢癌扩散的早期步骤

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