溶出动态核极化仪器用NMR实时酶反应速率测量

本实验的总体目标是通过动态核极化增强核磁共振实时跟踪酶促过程。动态核极化 （DNP） 增强的液态磁共振可以帮助回答关键问题：例如，如何确定一对分子在细胞或体内的酶促转化速率，而不必以任何方式改变这对分子。在我们的实验室安装了我们的溶出 DNP 设备，洛桑 Arnaud Comment 实验室的博士 Riccardo Balzan 博士来到这里，这是我们研究向前迈出的一大步。

DNP 显著提高了我们可以在 500 兆赫兹 NMR 波谱仪上进行的实验的灵敏度。这台 DNP 设备是第一台在法国安装的设备，我想提一下，在使该设备发挥作用的过程中，我们 NMR 团队的所有成员都参与其中，我想特别提到我们的研究工程师 Gildas Bertho 和我们的会议主管 Fatiha Kateb。该技术的主要优点是它允许以几秒钟的时间分辨率直接、实时地定量底物及其内源性衍生物。

对于极化溶液，制备两毫升 1.12 摩尔的碳 13 标记的丙酮酸钠溶液，掺杂 33 毫摩尔的 TEMPO 自由基，溶于氘代水和氘代乙醇的二比一体积中，用于碳 13 观察。通过单击低温恒温器软件界面上的冷却按钮，通过冷却程序降低动态核极化或 DNP 低温恒温器温度。通过填充程序在 DNP 低温恒温器中收集液氦。

单击低温恒温器软件界面上的填充按钮。然后将 300 微升优化的偏振溶液放入 DNP 偏振器随附的样品容器中。将装有样品的样品容器轻轻浸入液氮浴中，将其冷冻。

从液氮浴中提取样品容器并将其倒置旋转，以去除冷冻程序后样品容器中可能存在的液氮。接下来，首先将样品容器插入样品架，将样品插入低温恒温器。然后将样品架放入主低温恒温器插件中，然后将微波的波导插入样品架。

通过启动一个 Kelvin 冷却程序来降低低温恒温器温度。单击低温恒温器软件界面上的一个 Kelvin 冷却按钮。打开微波源，然后单击低温恒温器软件界面上的微波打开按钮照射样品。

连接器逆时针旋转 90 度并拉动，断开 NMR 控制台检测通道的同轴电缆与波谱仪线圈的连接。将检测通道的同轴电缆插入低温恒温器 NMR 线圈的同轴连接器。然后将 NMR 控制台电缆的公连接器插入低温恒温器 NMR 线圈的母连接器中，注意方向引脚。

用力推动连接器并顺时针旋转 90 度。在低温恒温器现场使用简单的脉冲采集序列测量固态 NMR 热信号，该序列具有未校准的低翻转角脉冲，以 t 等于 5 分钟的间隔重复。设置测量后，在软件的命令行中输入 zg，然后按键盘上的 Enter。

启动极化程序后，使用与热信号测量相同的程序和条件，在固态下测量 DNP 增强型 NMR 信号。将连接器逆时针旋转 90 度并拉动，断开 NMR 控制台检测通道同轴电缆与低温恒温器 NMR 线圈的连接。然后将检测通道的同轴电缆插入光谱仪线圈的同轴连接器。

将 NMR 控制台电缆的公连接器插入波谱仪线圈的母连接器中，注意定位引脚。用力推动连接器并顺时针旋转 90 度。在反应缓冲液中新鲜制备每毫升 1 单位的兔肌肉 LDH 溶液，其中含有 20 μg/mL 牛血清白蛋白。

接下来混合 478 微升反应缓冲液、2 微升 LDH 溶液和 20 微升氘代水，以实现光谱仪磁场稳定或锁定。然后将 500 微升溶液体积放入 5 毫米 NMR 管中。将转移管连接到自动化的定制进样装置上，该装置将超极化溶液与用于转移的氦气分离。

该装置自动将 500 μL 超极化溶液输送到样品管中。溶解前，将含有 500 微升样品的 5 毫米 NMR 管置于 11.74 特斯拉 NMR 波谱仪的等中心。将 5 毫升氘水插入溶出插件锅炉中。

通过电阻丝对氘代水进行加压和加热，直到通过点击低温恒温器软件界面上的准备加热器按钮达到大约 180 至 200 摄氏度的温度。单击低温恒温器软件界面上的 SS作按钮。然后从溶出插件中取出微波导向器。

将溶出插件向下滑入样品架。溶出插件必须到达样品架的底部，并且必须用力推动，以便与样品容器形成密封连接，以避免氘水泄漏到低温恒温器中。按下硬件触发器开始溶出序列，这是气动阀作的预定定时序列。

溶出后，进样装置将 500 微升超极化溶液与置于 NMR 波谱仪中的样品混合。溶解后，通过一系列间隔 1.5 秒的 10 度翻转角脉冲采集序列测量波谱仪中样品的 NMR 超极化信号，以跟踪衬底和产品的磁化进程。设置测量后，在软件的命令行中输入 zg，然后按 Enter。

磁化完全松弛后，通过一系列间隔约 3 分钟的 90 度翻转角脉冲采集序列来测量 NMR 热信号，相当于大约 3T1。设置测量后，在软件的命令行中输入 zg，然后按 Enter 键。在这里，从重复的 10 度翻转角脉冲获得的光谱的时间进程显示了该技术的灵敏度和时间分辨率。

在丙酮酸底物和乳酸产物的峰鉴定后，通过代谢物的信号整合进行定量。通过与线性模型拟合，根据产物信号时间过程确定酶活性。为了验证测量结果，根据产品和底物的信号比，通过初始反应速率评估相同的量。

一旦掌握，如果作得当，可以在大约两个小时内完成酶活性的完整测量。观看此视频后，您应该了解如何为 NMR 生产高度极化的底物，将其注入含有酶的溶液中，并使用 DNP 增强型 NMR 跟踪酶活性。尝试此程序时，请务必用新鲜酶和共底物仔细制备酶溶液，并避免样品管中出现任何气泡。

随着液态 DNP 增强磁共振的发展，研究人员现在可以通过测量产物形成的速率来探索各种类型细胞内的底物摄取及其酶促转化。不要忘记，使用低温设备和强磁场可能非常危险。在进行这些测量时，应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护装置以防止制冷剂和验证没有磁性物体。

与传统 NMR 不同，基于溶出 DNP 的 NMR 仅限于最多几分钟的实验时间窗口，具体取决于基材和当前的生活状态。这阻碍了超越一维光谱学。溶出度 DNP NMR 需要开发，以使其达到经典多维 NMR 的多功能性水平。