Name: 溶出动态核极化仪器用NMR实时酶反应速率测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 学习利用溶出动态核极化（DNP）增强核磁共振技术实时监测酶反应过程。该方法可在不改变分子结构的情况下测定酶转化速率，显著提升500兆赫兹NMR波谱仪的实验灵敏度。

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作者感谢 J. J. van der Klink 博士在设备选型与组装方面提供的帮助，同时感谢 F. Kateb 博士和 G. Bertho 博士的有益讨论。A.C. 受瑞士国家科学基金会（项目编号 PPOOP2_157547）资助。我们感谢巴黎索邦城市大学（NMR@Com、DIM Analytics、巴黎市政府）、法国医学研究基金会（FRM ING20130526708）以及布兰库西—休伯特合作伙伴计划（Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK）提供的经费支持。我们的团队隶属于 Equipex 项目 Paris-en-Résonance 和 CACSICE。

注意：所有数据分析均使用商业软件完成。
1. 准备偏振溶液
<ol>
	<li>制备 2 ml 的 1.12 M 溶液 13C-标记的丙酮酸钠（Na+[CH3-CO-13COO]-，掺有33 mM TEMPOL自由基（4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基，极化剂）的底物溶液4 2:1 D2O/d6-乙醇用于 13C 观察。注意：由于二甲苯具有易燃性，操作时必须采取防护措施。6-乙醇</li>
	<li>验证自由基浓度在所实现的极化水平上是否处于最佳状态。
	<ol>
		<li>略微改变第1.1点溶液中的自由基浓度例如，至 30 mM 或 35 mM。</li>
		<li>通过迭代法确定固态增强倍数（见步骤3），并找出产生最大增强效果的自由基浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 偏振
<ol>
	<li>通过降温程序降低 DNP 冻存仪的温度。点击冻存仪软件界面上的“Cooldown”按钮（图 2D）。</li>
	<li>通过填充程序在 DNP 冻存仪中收集液氦。点击冻存仪软件界面上的“Filling”按钮（图 2D）。</li>
	<li>取步骤 1.1 中优化的极化溶液 300 μl，加入 DNP 极化仪配套的样品容器中。将装有样品的容器轻轻浸入液氮浴中，使其冻结。</li>
	<li>在完成冻结步骤（步骤 2.3）后，将样品容器从液氮浴中取出并倒置旋转，以去除可能残留在容器中的液氮。 
	注意：此步骤至关重要，可确保样品充分溶解（见步骤 5）。</li>
	<li>将样品插入冻存仪中。 
	注意：本步骤包含以下子步骤，必须迅速完成（即，少于 10–20 秒），以防止样品融化。
	<ol>
		<li>将样品容器插入样品 holder 中，再将样品 holder 插入冻存仪主插件中，随后将微波波导插入样品 holder 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动 1 K 冷却程序以进一步降低冻存仪温度。点击冻存仪软件界面上的“1K Cooling”按钮（图 2D）。</li>
	<li>打开微波源并对样品进行辐照。点击冻存仪软件界面上的“MW-ON”按钮（图 2D）。</li>
</ol>
3. 固体核磁共振测量
<ol>
	<li>通过将连接器逆时针旋转90°并拔出，断开NMR控制台检测通道与波谱仪线圈之间的同轴电缆。将检测通道的同轴电缆连接至低温恒温器NMR线圈的同轴连接器。将NMR控制台电缆的公头插入低温恒温器NMR线圈的母头，注意对准定位销；用力推入后顺时针旋转连接器90°。</li>
	<li>在低温恒温器位置使用简单的脉冲-采集序列测量固态下的NMR热信号，采用未校准的小翻转角脉冲，重复间隔为 T = 5 min。设置好测量参数后，在软件命令行中输入“zg”，然后按键盘上的“Enter”键。有关波谱仪操作和测量设置的更多细节，请参阅NMR波谱仪操作手册。</li>
	<li>测量DNP增强的NMR信号。在按照第2节所述启动DNP过程后，重复步骤3.2的操作。</li>
	<li>通过将连接器逆时针旋转90°并拔出，断开NMR控制台检测通道与低温恒温器NMR线圈之间的同轴电缆。将检测通道的同轴电缆连接至波谱仪线圈的同轴连接器。将NMR控制台电缆的公头插入波谱仪线圈的母头，注意对准定位销；用力推入后顺时针旋转连接器90°。</li>
</ol>
4. 优化主磁体磁场的均匀性（“调场”）
<ol>
	<li>将装有样品的试管放入分光光度计中 500 μl 先前实验中产生的混合物即，步骤6.2之后）。</li>
	<li>通过调节匀场梯度线圈中的电流，寻找氘信号的最大“锁场”信号，从而对核磁共振波谱仪进行匀场。在核磁共振控制台上按下相应的按钮，选择对应的匀场线圈。
	<ol>
		<li>旋转核磁共振（NMR）控制台上的旋钮，确定使锁场信号增强的旋转方向。持续旋转直至信号达到最大值。选择另一个匀场线圈并重复上述优化过程，直至所有匀场线圈均达到局部最大信号。更多细节请参阅核磁共振波谱仪操作手册。最后，取出用于锁场的样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 溶解
<ol>
	<li>在溶解插件的锅炉中加入 5 ml D2O。通过电阻丝对 D2O 加压并加热，直至温度 T ≈ 180–200 °C。在低温恒温器软件界面中点击“Prepare Heater”按钮（图 2D）。</li>
	<li>完成样品极化程序后（例如，经过 3 个 TDNP 时间），将低温恒温器压力略微加压至室压以上。在低温恒温器软件界面中点击“SS Operations”按钮（图 2D），然后移除溶解插件中的微波导管。</li>
	<li>将溶解插件（图 3B）向下滑入样品 holder（图 3A-c）中。溶解插件必须到达样品 holder 的底部，并牢固推入，以与样品容器形成密封连接，防止 D2O 泄漏至低温恒温器内。</li>
	<li>按下硬件触发器（图 3C-h）以启动溶解程序，该程序为一组预设时间控制的气动阀操作序列。</li>
</ol>
6. 注射
<ol>
	<li>在溶解前，将一支含有5 mm NMR样品管 500 μl 样本例如，D2O 表示 <img alt="Dynamic nuclear polarization symbol ε^ls_DNP in a physics diagram; used in spectroscopic studies." src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation13"> 在11.74 T核磁共振波谱仪的等中心位置进行测量（步骤7中的测量，或步骤8中用于步骤9酶活性测定的LDH溶液），参见步骤4。</li>
	<li>溶解后（步骤5），立即混合 500 μl 在第6.1步中，将样品置于核磁共振波谱仪内，并加入超极化溶液。
	<ol>
		<li>手动注射：在靠近核磁共振波谱仪磁体的位置放置一个玻璃烧杯，通过一根2.5米长的转移管末端收集超极化溶液，随后手动注射 500 μl 通过定制的毛细管系统将超极化溶液注入核磁共振样品管中。</li>
		<li>自动注射：在溶解过程开始前，将转移管连接至自主研发的自动化注射装置，该装置可将超极化溶液与用于转移的氦气分离。该装置可自动递送 500 μl 将超极化溶液注入样品管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 液态核磁共振测量
<ol>
	<li>溶解后，通过一系列间隔1.5秒、翻转角为10°的脉冲-采集序列，在核磁共振波谱仪中测量样品的核磁共振超极化信号，以追踪底物（A）和产物（B）的磁化过程。设置好测量参数后，在软件命令行中输入“zg”，然后按键盘上的“Enter”键。有关波谱仪操作和测量设置的更多细节，请参阅核磁共振波谱仪操作手册。</li>
	<li>当磁化完全弛豫后（即经过 i.e.，T = 10 T1），通过一系列间隔为 T = 3 T1 ≈ 3 分钟、翻转角为90°的脉冲-采集序列测量核磁共振热平衡信号。设置好测量参数后，在软件命令行中输入“zg”，然后按键盘上的“Enter”键。有关波谱仪操作和测量设置的更多细节，请参阅核磁共振波谱仪操作手册。</li>
</ol>
8. 含酶样品的制备（丙酮酸转化为乳酸反应专用）
<ol>
	<li>按以下配方配制反应缓冲液：50 mM 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1 mM 二硫苏糖醇（DTT），溶于 0.1 M 磷酸缓冲液，pH = 7.0。</li>
	<li>用反应缓冲液新鲜配制兔骨骼肌乳酸脱氢酶（LDH）溶液，浓度为 1 U/ml，并加入 20 μg/ml 牛血清白蛋白（BSA）。</li>
	<li>取 478 μl 反应缓冲液（步骤 8.1），加入 20 μl D2O 以利于核磁共振仪磁场稳定（“锁场”），再加入 2 μl LDH 溶液（步骤 7.2），混合均匀。</li>
	<li>将步骤 8.3 中配制的 500 μl 溶液转移至 5 mm 核磁管中，并将核磁管放入 500 MHz 核磁共振波谱仪中。</li>
</ol>
9. 完整的酶促反应速率测定步骤
<ol>
	<li>制备极化样品（步骤 1）并进行极化（步骤 2）。</li>
	<li>对波谱仪进行匀场（步骤 4）并制备酶学样品（步骤 8）。</li>
	<li>执行溶解（步骤 5）和注射（步骤 6）。</li>
	<li>使用间隔 1.5 秒、翻转角为 10° 的脉冲采集超极化样品的一系列信号（步骤 7）。此步骤可用于测量超极化信号的衰减以及代谢产物信号的累积。</li>
</ol>
10. 拟合
<ol>
	<li>针对步骤 9.4 中获取的每张谱图，分别识别对应于底物（A）和产物（B）的峰，并对这些峰进行积分（确定峰面积）。峰积分值可得到磁化时间过程信号（M(A,B)(t)，见公式 2）。</li>
	<li>利用公式（2）的解，通过对步骤 10.1 中积分得到的底物信号进行单指数拟合，确定 F = (RA + keff ) 的数值。</li>
	<li>利用步骤 10.2 中确定的 F = (RA + keff ) 值，通过将产物信号 MB(t) 与积分公式（2）所得函数进行拟合，确定 keff 和 RB。有关反应建模、拟合及 rf 校正的详细信息，请参见代表性结果部分（酶活性与代谢测量）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益

溶解DNP NMR实验的关键因素包括：（i）底物所达到的极化水平，这决定了实验所需的最低产物浓度以及可进行的信号采集次数；（ii）磁化寿命，需与从极化位点到检测位点的转移时间以及底物转化速率相比较。本文所述的溶解DNP装置的注射系统可在短短3–4秒内完成样品转移。尽管该转移速度不及S. Bowen和C. Hilty提出的方法迅速26，但由于低磁场下纵向弛豫较为缓慢，丙酮酸盐的极化损失仍受到限制。[1-13C]丙酮酸盐因其羧基核具有较长的T1弛豫时间，可在低至10-3 U/ml的浓度下测量乳酸脱氢酶（LDH）的通量。
采用溶解态动态核极化（DNP）获得的高信噪比表明，即使对于更低浓度的[1-13C]丙酮酸以及更低的酶促转化速率，仍具有检测灵敏度。当前达到的极化水平使得在液态核磁共振波谱仪中使用小翻转角 α = 10° 时，可获得超过200次具有显著信噪比的实验信号。这为重复时间与翻转角的进一步优化提供了空间。在固态极化建立过程中，某些分子与...

动态核极化（DNP），1,2 一种旨在增强核自旋极化的技术 即“上”自旋与“下”自旋布居数之间的不平衡（P = [N↑ - N↓] / [N↑ + N↓])，于20世纪50年代首次被引入。核自旋如 13C 可被极化至高达 P = 10-1 在有利条件下，通常在约1 K的温度和3.357 T的磁场中。3,4 21世纪初，溶解性动态核极化（dissolution DNP）技术的问世为生物应用带来了突破。该技术通过将冷冻的极化样品溶解于过热水中，同时保持低温下获得的高核极化水平，从而实现极化信号的显著增强。5 液态核磁共振信号增强了10倍3-104 与常见的热极化常温核磁共振（RT NMR）条件相比，溶解态动态核极化（dissolution DNP）因此提供了一种非侵入性测量生化反应速率的方法 原位 实时进行，允许通过核磁共振以1秒或更短的时间分辨率监测动态变化。6-10 还能够检测极低浓度的分析物。11
在非侵入性分子成像技术中，超极化核磁共振（NMR）是唯一能够实时同时检测底物及其代谢产物的技术。溶解态动态核极化（dissolution DNP）自问世以来，在从体外（in vitro）核磁共振到临床磁共振成像（MRI）12等多个科研领域均受到广泛关注，其中最具前景的应用集中在对代谢过程的原位（in situ）监测13,14。溶解态DNP的主要局限在于，经过约五倍纵向弛豫时间常数 T1 的时间后，增强的极化信号便会消失。因此，必须选用具有相对较长 T1 的核自旋分子。为了延长极化增强的时间窗口，可利用弛豫缓慢的核自旋态，即所谓的长寿命态（long-lived states, LLS）15-17。LLS对分子内偶极-偶极相互作用不敏感，因此其特征弛豫时间常数 TLLS 可远长于 T118。由此可实现数十分钟甚至长达1小时的磁化寿命19,20，LLS已被提出用于磁共振波谱（MRS）和磁共振成像（MRI）中21。
通过超极化核磁共振（NMR）研究酶促反应速率时，需仔细优化的关键点包括：（i）最大化固态下的极化度；（ii）尽量减少超极化溶液从极化仪转移至核磁共振波谱仪过程中的极化损失。本文描述了一套定制的溶解型动态核极化（DNP）装置与注射系统的改造，用于酶促反应研究。将通过广泛使用的经典超极化底物[1-13C]丙酮酸。选择它的主要原因有两点：首先，其天然的长半衰期 13C纵向弛豫时间T1 &gt;50秒，在高磁场和高于293 K的温度下）可实现对反应过程持续数分钟的监测，其次因其在癌症代谢中的核心作用。13,14 利用溶解态动态核极化核磁共振（DNP NMR）结合定制开发的注射系统，可在存在初始未标记乳酸池的条件下监测乳酸脱氢酶（LDH）催化的丙酮酸氧化反应9,22 或未添加未标记乳酸，如此处所示。已有研究表明，[1-13C]乳酸信号测量 体内 （包括细胞内）在注射超极化[1-13C]丙酮酸的主要原因在于丙酮酸与乳酸之间的快速标记交换，而非乳酸的生成。6
本文展示了将超极化[1-13C]丙酮酸注入含有乳酸脱氢酶（LDH）但初始不含乳酸的核磁共振管后，实时生成[1-13C]乳酸的过程。
系统描述 
溶解性动态核极化（DNP）装置包含两个主要部分（图1）：DNP极化器和核磁共振（NMR）波谱仪。DNP极化器的核心部件是低温恒温器，用于在抽气的液氦浴中将样品冷却至约1 K。该低温恒温器置于3.35 T的超导磁体中，其几何结构可确保极化样品位于磁体的等中心位置（图1）。在低温恒温器内部，样品（a）被核磁共振线圈（b）包围，用于测量极化建立过程，整个结构置于过模微波谐振腔（c）内。样品整体由抽气的液氦浴（d）维持在低温状态，并通过波导引入微波进行照射。整个系统由定制软件进行控制（图2D）。
实现动态核极化（DNP）及其后续溶解过程所需的硬件与低温设备目前仍是一项技术挑战。为此，研发并测试了一种新型DNP低温恒温器23,24，以评估其低温性能，并进一步优化其快速冷却能力、液氦保持时间以及运行过程中的整体最低液氦消耗量。
冷冻恒温器由两部分组成。第一部分是隔热杜瓦瓶（图2A），大致可分为上部（a）、样品空间（b）和保持高真空的外真空室（OVC）（c），外真空室内设有辐射屏蔽层。第二部分是主插件（图2B），插入隔热杜瓦瓶中，用于调控所有气流。来自外部储存杜瓦瓶并通过传输管线（a）输送的液氦，首先在分离器（b）中冷凝，该分离器是一个中间腔室，既用于保持冷冻恒温器上部低温，也用于去除传输过程中蒸发的氦气。通过缠绕在冷冻恒温器上部的一根毛细管（c）进行抽气，以降低分离器的压力；流经该毛细管的冷氦气用于冷却挡板（d）以及隔热杜瓦瓶（OVC）中的辐射屏蔽层。样品置于样品空间内并进行极化。样品空间通过另一根缠绕在主冷冻恒温器插件尾部的毛细管（e）与分离器相连。该毛细管可通过一个从外部手动操作的针阀打开或关闭。
为了实现动态核极化（DNP）过程中所需的低温，需要将液氦收集在低温恒温器的样品腔中，并将其压力降低至毫巴（mbar）范围。低温恒温器的操作通过一套较为复杂的抽气系统完成，该系统包含三组泵，由电子和机电仪器在不同位置进行监控和操作（图2C）。低温恒温器的开放式真空腔（OVC）需由第一级抽气系统抽至高真空。该系统由一台涡轮分子泵和一台作为前级泵的旋片泵（a）组成。液氦通过低温恒温器的进样管线从储存杜瓦瓶（b）转移至低温恒温器的分离器中。分离器的出口连接至第二级抽气装置，该装置由一台抽速为35 m3/hr的隔膜泵（c）组成。该管路可用于在液氦从杜瓦瓶转移以及分离器冷却过程中，排出沸腾产生的氦气。收集在分离器中的液氦随后可通过上述毛细管转移至样品腔。为了将液氦从分离器转移至样品腔，并进一步将样品腔压力降至毫巴范围，需通过一个手动蝶阀（e）将第三级抽气系统连接至低温恒温器，该系统由一台抽速为250 m3/hr的罗茨泵和一台抽速为65 m3/hr的旋片泵（d）组成。
所有真空系统的操作均由一个定制的电动气动装置（f）进行控制和调节。该装置控制着低温恒温器分离器（g）与样品腔出口（h）、第二/第三级抽气系统（c, d）、压缩氦气瓶（i）以及外部环境之间的真空管路连接。装置（f）与外部之间的连通需通过一个单向阀（j）。电动气动装置（f）、整个系统的各项参数以及溶解硬件均由一个定制的电子设备通过USB接口与普通PC连接进行控制和操作。最终，整个系统通过该电子设备由一套定制的独立软件（图2D）进行管理，相关操作通过软件界面上的按钮来启动。
为了处理样品并测量固态下的核磁共振（NMR）信号增长，需使用一系列插件（图3A）。为准备极化用的低温恒温器，将主样品插件（a）放入低温恒温器中。主样品插件内装有核磁共振线圈（b），该线圈置于一个过模的镀金微波谐振腔内。将待极化的基质溶液（极化溶液）在液氮温度下预先冷冻，并置于玻璃纤维样品支架（c）底部末端的合适样品容器中。将样品支架推入主样品插件中，使其到达磁体的等中心位置。将镀金波导管（d）插入样品支架中。该波导管可使来自外部微波源的微波以最小损耗传输至样品。
用于低温恒温器管理的定制软件可在点击相应界面按钮后自动执行多种操作，如降温（将低温恒温器温度降低至接近液氦温度）、充液（将液氦注入低温恒温器至预设液位）以及进一步的冷却步骤 T ≈ 1 K（通过抽气使液氦浴达到尽可能低的温度），加压（将低温恒温器压力略微加压至高于室压） P = 10–30 mbar，以允许在无空气污染风险的情况下打开冷冻恒温器）以及溶解（自动程序，用于溶解DNP样品并将所得的超极化溶液转移至测量位置， 即，核磁共振波谱仪）
通过在94 GHz的微波照射下（极化磁场 B0 = 3.35 T）对样品进行极化。当极化时间达到3个TDNP时，认为样品已完全极化，其中TDNP为极化建立时间。TDNP的数量级与给定磁场和温度下目标核在固态中的纵向弛豫时间相同。在本研究的所有实验中，样品的极化时间均超过5个TDNP。
极化时间结束后，样品必须溶解在室温溶液中，以便用于酶活性的测定。在溶解过程中，溶解插件锅炉（图3B）中产生的5 ml过热D2O在压缩氦气（P = 6–8 bar）推动下，流向DNP增强的样品并将其溶解。生成的超极化溶液在压缩氦气作用下，从溶解插件中经由溶解插件出口（图3C-b）和内径为2 mm的聚四氟乙烯（Teflon）转移管推出。溶解过程所需时间为300毫秒。23 样品从DNP极化器转移至核磁共振（NMR）波谱仪位置所需时间约为3秒。
溶解过程使用溶解插件（图3B）进行。该溶解插件由电子-气动组件（a）、含连接管路的碳纤维棒（b）组成，连接管路连通气动组件中的锅炉与样品容器锁（c），可实现与样品容器的密封耦合，并将流体导出至出口。电子-气动组件（图3C）用于产生并驱动过热的D2O通过碳纤维棒进入样品容器，随后将超极化溶液从低温恒温器中提取出来。电子-气动组件由气动阀（a）构成，用于控制压缩氦气（P = 6–8 bar）管线（b）、锅炉（c）（通过阀门（d）向其中注入D2O）以及通过碳纤维棒（f）通向出口（e）之间的连接。该系统还包括安装在锅炉（c）内的压力计G、温度计和加热电阻丝、触发器（h）以及连接盒（i），后者用于将系统与电子控制装置连接。
DNP 冷冻仪与核磁共振波谱仪通过传输管线相连， 即， 内径为2 mm的聚四氟乙烯管，超极化溶液由加压氦气推动通过其中（P = 6-8 bar）时启动溶解。
溶解过程包含以下操作步骤：在前300毫秒内，将过热的D2O推入样品容器，以熔化并溶解超极化冷冻溶液。随后，通过加压（P = 6–8 bar）的氦气将超极化溶液从低温恒温器中抽出，并经由内径为2 mm的PTFE管（图3C-e）输送至测量位置，然后采用第6.2.1步或第6.2.2步中所述的任一程序进行注射。
溶解DNP NMR装置的第二个组成部分是核磁共振波谱仪。在本文所述的装置中，核磁共振波谱仪的工作磁场为 B0 = 11.7 特斯拉。使用一个5 mm核磁共振探头在溶解后检测超极化信号。核磁共振波谱仪通过核磁共振控制台进行操作，该控制台可用于固态和液态核磁共振测量，并结合厂商提供的软件XWinNMR使用。典型的测量过程包括一个低翻转角的硬脉冲（针对液态测量进行过校准，或针对固态测量未校准），随后进行信号采集。
使用定制的13C线圈在DNP极化器位置（图3Ab）连接核磁共振波谱仪，进行固态热极化信号和DNP诱导信号建立的测量。在此特定情况下，核磁共振波谱仪不进行信号锁场。当进行固态测量时，为避免对极化产生显著干扰，两次采集之间的时间延迟应足够长，通常应大于0.5 TDNP。
固态增强度定义为 <img alt="动态核极化方程，ε^ss_DNP = S^ss_DNP/S^ss_th，表示效率比。" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation4.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation4">，其中 <img alt="动态核极化（DNP）符号，用于光谱学研究的科学符号。" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation5.jpg" width="31" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation5"> 为超极化信号（在步骤 3.3 中获得），而 <img alt="静态平衡方程，ΣS=0，公式，教育用物理概念。" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation6.jpg" width="23" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation6"> 为固态信号（在步骤 3.2 中液氦泵送温度下的热平衡状态下获得）（图 4A）。该参数定义了在超极化溶液转移过程中不可避免的损失发生前，可用于核磁共振（NMR）实验的最大极化度。测量采用简单的脉冲-采集序列，使用未校准的小翻转角脉冲进行。对于固态测量，通常省略脉冲校准。
类似的方法可用于测定液态下的超极化信号增强。在这种情况下，注入前（步骤6.2）置于波谱仪管中的样品由500 µl的D2O组成。溶解并注入后，有两个重要参数需要监测。第一个是核磁共振波谱仪位置处的超极化增强，<img alt="DNP增强公式，εDNP=S_DNP/S_th，以科研背景下的科学方程形式展示。" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation7.jpg" width="95" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation7">（图4B），其中<img alt="静态平衡概念与ΣDNP方程。适用于物理研究的示意图。" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation8.jpg" width="30" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation8">为注入超极化溶液后立即测得的信号（在步骤7.1中获得），而<img alt="静态平衡公式 \(S_{ls}^{th}\)，方程符号，用于教育和研究。" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation9.jpg" width="20" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation9">为热极化信号（在步骤7.2中获得）。第二个参数是纵向弛豫时间T1（图4B，插图），该参数与底物及每种代谢产物相关（通过步骤7.1中获得信号的指数拟合得到）。这两个参数决定了获得足够信噪比（SNR）所需的最低底物浓度以及进行代谢转化测量的可用时间窗口。固态极化度<img alt="静态平衡公式 P_SS/DNP；表示技术图示中的平衡状态。" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation10.jpg" width="30" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation10">与液态极化度<img alt="DNP方程，显示科学分析中的偏最小二乘系数。" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation11.jpg" width="29" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation11">的比值可估算超极化溶液转移过程中因弛豫导致的极化损失。在无弛豫损失的情况下，应观察到比值<img alt="动态核极化比公式 \( P_{DNP}^{ls}/P_{DNP}^{ss} \sim 1 \)。" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation12.jpg" width="80" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation12">接近1。

<table><tbody><tr><td>DNP 极化仪</td><td>Vanderklink s.a.r.l (瑞士)</td><td>///</td><td>用于样品极化的低温恒温器及电子设备</td></tr><tr><td>真空系统组件</td><td>Edwards vacuum (法国)</td><td>各种</td><td> &lt;p&gt;- 涡轮分子泵系统&lt;/p&gt; &lt;p&gt;- 隔膜泵系统&lt;/p&gt; &lt;p&gt;- 高容量罗茨泵系统&lt;/p&gt; &lt;p&gt;- 真空接头及组件&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>DNP 3.35T 磁体</td><td>Bruker (法国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 MHz 核磁共振波谱仪</td><td>Bruker (法国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.0</td><td>OriginLab (美国)</td><td></td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-13C 标记丙酮酸钠，13C 原子丰度 99%</td><td>Sigma Aldrich (法国)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>氘代乙醇-D6，无水，氘原子丰度 99.5%</td><td>Sigma Aldrich (法国)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;4-羟基-TEMPO，纯度 97%</td><td>Sigma Aldrich (法国)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma Aldrich (法国)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）</td><td>Sigma Aldrich (法国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma Aldrich (法国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma Aldrich (法国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH&amp;nbsp;=&amp;nbsp;7.0</td><td>Sigma Aldrich (法国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乳酸脱氢酶（LDH）&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (法国)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich (法国)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于通过核磁共振实时测量酶反应速率的溶解动态核极化仪器装置

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

基于核磁共振（NMR）研究的主要局限性在于灵敏度较低，这导致需要较长的采集时间，从而无法实现对代谢转化过程的实时NMR检测。通过溶解态动态核极化（dissolution DNP）实现的超极化技术，借助电子自旋向核自旋的极化转移所产生的显著非平衡态核磁化，部分克服了灵敏度问题。由此获得的高强度NMR信号可用于实时监测化学反应。然而，超极化NMR的缺点在于信号采集的时间窗口有限，通常仅为核自旋纵向弛豫时间常数的数量级。 T1，或者在有利情况下，接近耦合核单重态的弛豫时间常数的数量级 TLLS细胞对内源性分子的摄取及代谢速率可为肿瘤发生发展和药物反应提供重要信息。大量既往的超极化核磁共振研究已证实丙酮酸作为代谢底物在监测酶活性方面的相关性 体内本研究详细描述了利用超极化核磁共振（NMR）技术研究酶促反应（特别是乳酸脱氢酶（LDH）存在下丙酮酸向乳酸转化速率）所需的实验装置与方法。

利用溶解DNP增强NMR信号 
DNP效应是指在微波照射样品的条件下，将未配对电子自旋（通常来自稳定的自由基分子）的高极化度转移至NMR活性核的过程。最常用的自由基为TAM(OXO63)和TEMPOL4。使用TEMPOL进行极化时，可通过“交叉极化”方法优化极化过程25。
为了在固态下获得最大的核极化，优化稳定自由基的浓度对该技术的成功至关重要。在本研究的实验条件下，TEMPOL 的最佳浓度为 33 mM。该底物的极化程度足以实时监测其酶促转化过程。
巴黎笛卡尔大学安装的极化器的磁场为 B0 = 3.35 T，该系统的各组件如上文所述（图 1–图 3）。低温恒温器的设计确保最终...

通过溶解动态核极化（DNP）实现的灵敏度提升，使得利用核磁共振（NMR）和磁共振成像（MRI）实时追踪代谢过程成为可能。本文讨论了一种专用于研究酶促反应的溶解DNP装置的特性与性能。

基于核磁共振（NMR）的研究主要局限性在于灵敏度较低。这导致需要较长的采集时间，从而无法实现对……的实时NMR测量。

本实验的总体目标是通过动态核极化增强的核磁共振技术实时追踪酶促反应过程。利用动态核极化（DNP）增强的液态核磁共振技术，有助于回答一些关键科学问题：例如，如何在不以任何方式修饰一对分子的前提下，确定这对分子在细胞内或活体内的酶促转化速率。我们实验室成功安装了溶解型DNP设备，同时来自洛桑Arnaud Comment实验室的博士研究生Riccardo Balzan也已抵达本实验室，这标志着我们的研究迈出了重要的一步。DNP 显著提高了我们在 500 兆赫核磁共振波谱仪上可进行实验的灵敏度。这套 DNP 设备是法国首套安装的设备，我想特别指出，我们 NMR 团队的所有成员都参与了使该设备正常运行的工作，尤其要提及我们的研究员工程师 Gildas Bertho 和讲师 Fatiha Kateb。该技术的主要优势在于，它能够以秒级时间分辨率对底物及其内源性衍生物进行直接、实时的定量分析。对于极化溶液，为碳13观测，将33毫摩尔的TEMPO自由基掺入2毫升1.12摩尔、碳13标记的丙酮酸钠溶液中，并以2:1的体积比加入氘代水与氘代乙醇。通过点击低温恒温器软件界面上的降温按钮，执行降温程序以降低动态核极化（DNP）低温恒温器的温度。通过填充程序收集液氦至DNP低温恒温器中。点击冷冻切片机软件界面上的填充按钮。然后将300微升优化的极化溶液加入DNP极化仪附带的样品容器中。通过将装有样品的容器轻轻浸入液氮浴中，使其冻结。在冷冻程序结束后，将样本容器从液氮浴中取出并倒置旋转，以去除样本容器中可能残留的液氮。接着，先将样本容器插入样本架中，再将样本架放入冷冻切片机主体的主插槽内，完成样本的装载。然后，将微波波导插入样本架中。通过启动1 K冷却程序来降低恒温器温度。在恒温器软件界面上点击1 K冷却按钮。打开微波源，并在恒温器软件界面上点击开启微波按钮以照射样品。将 NMR 控制台检测通道的同轴电缆从波谱仪线圈上断开，方法是将连接器逆时针旋转 90 度后拔出。将检测通道的同轴电缆插入低温恒温器 NMR 线圈的同轴连接器中。然后将 NMR 控制台电缆的公头连接器插入低温恒温器 NMR 线圈的母头连接器中，注意对准定位销。用力按压并将连接器顺时针旋转90度。使用简单的脉冲-采集序列，在低温恒温器位置对固态样品进行核磁共振热信号测量，采用未校准的小翻转角脉冲，重复间隔为 t 等于五分钟。设置测量后，在软件命令行中输入 zg，然后按键盘上的回车键。启动极化程序后，采用与热信号测量相同的步骤和条件，在固态下测量DNP增强的核磁共振（NMR）信号。将连接至低温恒温器NMR线圈的NMR控制台检测通道同轴电缆逆时针旋转90度并拔出，断开连接。然后将检测通道的同轴电缆插入波谱仪线圈的同轴连接器中。将核磁共振控制台电缆的公头插入光谱仪线圈的母头，注意对准定位销。用力推入，并顺时针旋转连接头90度。用含20微克/毫升牛血清白蛋白的反应缓冲液，新鲜配制每毫升含一个单位的兔肌肉乳酸脱氢酶溶液。接下来，将478 µL反应缓冲液、2 µL乳酸脱氢酶（LDH）溶液和20 µL氘代水混合，以实现核磁共振波谱仪的磁场稳定，即锁定。然后将500 µL溶液转移至5 mm NMR样品管中。将转移管连接至一种自动化的定制注射装置，该装置可将超极化溶液与用于转移的氦气分离。该设备会自动将500微升的超极化溶液注入样品管中。在溶解前，将装有500微升样品的5毫米核磁共振管置于11.74特斯拉核磁共振波谱仪的等中心位置。在溶解插件的锅炉中加入5毫升重水。通过点击恒温器软件界面上的“准备加热”按钮，利用电阻丝对氘代水加压并加热，直至温度达到约 180 至 200 摄氏度。然后点击恒温器软件界面上的“SS 操作”按钮，随后从溶解插件中移除微波导管。将溶解插件向下滑入样品 holder 中。溶解插件必须到达样品 holder 的底部，并用力推紧，以与样品容器形成密封连接，防止重水泄漏到低温恒温器中。按下硬件触发器以启动溶解程序，该程序为预设的、按时间顺序进行的气动阀操作序列。溶解后立即通过注射装置将500 µL的超极化溶液与置于核磁共振（NMR）波谱仪中的样品混合。溶解后，使用脉冲-采集序列（翻转角为10度，每1.5秒一次）测量波谱仪中样品的NMR超极化信号，以追踪底物和产物磁化强度的变化过程。设置测量参数后，在软件命令行中输入zg并按回车键。当磁化完全弛豫后，通过一系列间隔约三分钟（约等于3T1）的90度脉冲-采集序列测量NMR热信号。设置好测量参数后，在软件命令行中输入zg，然后按回车键。此处通过重复施加10度脉冲角度所获得的谱图时间进程展示了该技术的灵敏度和时间分辨率。在鉴定丙酮酸底物和乳酸产物的峰之后，通过代谢物信号积分进行定量分析。通过线性模型拟合产物信号的时间进程来确定酶活性。为验证测量结果，还通过产物与底物信号的比值计算初始反应速率，以评估相同的量。一旦掌握，若操作得当，完成一次完整的酶活性测量大约需要两个小时。观看本视频后，您应能够理解如何制备用于核磁共振（NMR）的高极化底物，将其注入含有酶的溶液中，并利用动态核极化（DNP）增强的NMR技术追踪酶的催化过程。在尝试该操作时，务必使用新鲜的酶和共底物仔细配制酶溶液，并避免样品管中产生任何气泡。随着液体状态下动态核极化（DNP）增强磁共振技术的发展，研究人员现在可通过测量产物生成速率，探索底物在多种细胞内的摄取及其酶促转化过程。请务必注意，操作低温设备和高磁场环境可能具有极高的危险性。在进行此类测量时，必须采取预防措施，例如穿戴针对低温物质的个人防护装备，并确认无磁性物体存在。与传统的核磁共振（NMR）不同，基于溶解性动态核极化（DNP）的NMR最多只能在几分钟的时间窗口内进行实验，具体时长取决于底物和当前的生命状态。这限制了其在单维D谱学之外的应用。溶解性DNP NMR需要进一步发展，才能达到传统多维NMR所具有的灵活性水平。

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本文介绍了一种用于制备13C,15N标记的真菌和植物样品的方案，适用于多维固态核磁共振波谱和动态核极化（DNP）研究。...

利用动态核极化固态核磁共振技术进行结构解析的真菌与植物材料制备

我们介绍了一种利用快速变场弛豫测量法测定通过动态核极化实现超极化的13C富集化合物的自旋-晶格弛豫时间随磁场变化的实验方案。具体而言，我们以[1-13C]丙酮酸为例进行了演示，但该方案可推广至其他超极化底物。...

测量超极化[1-13C]丙酮酸的自旋-晶格弛豫磁化率随磁场的变化

本文详细描述了在实验室中通过溶液核磁共振波谱法获取和分析15N弛豫色散谱的实验方案。...

15N CPMG 驰豫弥散用于研究蛋白质构象动力学的 µs-ms 时间尺度

中子背散射谱学提供了一种无损且无需标记的方法，用于研究蛋白质及其水合水在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。本文通过两项关于淀粉样蛋白的研究展示了该方法的工作流程：一是溶菌酶在聚集过程中时间分辨的动力学研究，二是tau蛋白在形成纤维时其水合水动力学的研究。...

高分辨率中子谱学研究蛋白质及水合水的皮秒至纳秒动力学

核磁共振（NMR）波谱法能够以残基特异性的方式表征蛋白质的结构动力学。本文提供了一套实用的实验方案，用于采集对皮秒到纳秒时间尺度敏感的NMR 15N R1 和 R2...

NMR 15N 弛豫实验用于研究蛋白质的皮秒至纳秒级结构动力学

本方案将定制的生物反应器系统与超极化¹³C核磁共振波谱技术相结合，用于实时测量活细胞中的丙酮酸代谢，从而提高代谢研究和药物筛选应用中的可重复性和动力学准确性。...

使用超极化13C核磁共振对活细胞进行实时代谢检测

学习利用溶出动态核极化（DNP）增强核磁共振技术实时监测酶反应过程。该方法可在不改变分子结构的情况下测定酶转化速率，显著提升500兆赫兹NMR波谱仪的实验灵敏度。

用于通过核磁共振实时测量酶反应速率的溶解动态核极化仪器装置

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