利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

本实验的总体目标是利用等位基因特异性的CRISPR/Cas9介导的缺失来研究小鼠胚胎干细胞中基因转录的调控。该技术的主要优势在于使用杂合基因组来生成和分析单等位基因缺失，从而避免了分析可能无法存活的单等位基因增强缺失的需要。

该方法有助于回答功能基因组学领域的关键问题，例如，某个特定增强子调控的是哪个基因，以及该基因的活性在多大程度上依赖于任何一个特定增强子。尽管该方法可为干细胞多能性的研究提供洞见，但它也可应用于其他系统。

例如，这有助于我们理解干细胞如何改变其命运，分化为神经元、血细胞或肌肉细胞。在设计、构建并确认拟使用的引导RNA（gRNA）序列后，准备将无内毒素质粒转染到ES细胞中。使用离心机，在300 × g条件下离心5分钟，将由Mus musculus 129与Mus castaneus杂交获得的1 × 10⁶个F1胚胎干细胞在1.5毫升离心管中沉淀。

离心后，弃去上清液，加入100微升试剂盒生产商提供的重悬缓冲液。为删除目标DNA区域，加入各5微克的P Cas9 GFP 5'端和3'端gRNA质粒。用移液器轻轻混匀。

避免引入气泡。接下来，使用电穿孔仪的电子移液器吸头吸取 100 µL 电穿孔混合液，注意避免将空气吸入吸头中。然后，将移液器插入转染装置中。

选择合适的程序并按下启动。电穿孔运行时，观察尖端。在正确设置下，微小的气泡应从管状电极中冒出。

火花表明存在气泡，会干扰转染过程。若出现此情况，必须使用新的一批细胞重新进行电穿孔。电穿孔完成后，将转染后的细胞注入含有十毫升 ES 细胞培养基的十厘米明胶包被培养皿中。

将转染后的细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。48小时后，使用流式细胞仪分选并分离表达九型GFP的阳性ES细胞。随后，将1至1.5 × 10⁴个GFP阳性细胞接种至含有10毫升ES细胞培养基的10厘米凝胶包被培养皿中。

以这种低密度接种将有助于挑取单个 ES 细胞克隆。4 到 5 天后，使用显微镜识别呈球形的单个 ES 细胞克隆。用移液器将每个克隆转移至经明胶预处理并含有 30 µL tripsom 的 96 孔板的一个孔中。

将所有克隆挑取并分散至培养基后，于二氧化碳培养箱中 37 摄氏度培养细胞，直至大多数孔中细胞融合度超过 70%。此过程通常需要约两天时间。当细胞准备传代时，吸除培养基，并加入 30 微升胰蛋白酶溶液。

将细胞孵育五分钟。然后，向每孔加入 180 µL ES 细胞培养基以中和胰蛋白酶。吹打混匀，获得单细胞悬液。

从每个孔中转移 70 微升至三个含胶原素包被的 96 孔板中，每个孔内含 130 微升 ES 细胞培养基。在 37 摄氏度下孵育。当孔板细胞融合度达到 70% 至 85% 时，用于后续各克隆的基因型鉴定和表达分析，具体方法见下文各节所述。

按照随附文档中所述方法冻存细胞株。此处将设计四组引物用于筛选克隆中目标基因的缺失情况，包括：内侧引物、外侧引物，以及分别针对5′端和3′端gRNA靶位点的gRNA侧翼引物。

首先访问此处所示网站，获取对应于 129 和 Cas 基因型的单核苷酸多态性（snip）轨迹。该链接指向 Mitchell 实验室的 CRISPR 网页，点击页面中的指定链接。

该网站将重定向至 UCSC 基因组浏览器，其中包含显示 MM-9 小鼠基因组组装中 129 与 Cas 基因组之间 SNP 的轨迹。接下来，输入要删除区域的坐标，然后点击“go”。在目标删除区域中部，选择一个包含三个以上 SNP、约 500 个碱基对的区域进行放大。

如果SNP位点稀少，等位基因特异性引物的设计可能会比较复杂。若无法设计出完全等位基因特异性的引物，可使用中等程度的等位基因特异性引物。只需在分析qPCR结果时，注意比较缺失型与非缺失型克隆之间的CT值即可。

现在，单击顶部面板中的“View”。从下拉菜单中选择 DNA，将出现“Get DNA in Window”页面。

在序列格式化选项中，选择全部大写，然后点击“获取 DNA”以全大写格式显示目标序列。复制该序列并粘贴到 Word 文档文件中。随后，将该序列与 129 cast snip 轨迹进行比对，标出 snip 位点，并用小写字母标记 129 snip 位点。

完成129序列后，将其复制以创建两个fast day格式的序列，分别用于129和Cas。在Cas序列中，在每个snip位点处替换为正确的碱基，并用小写字母标记snip位点。

接下来，使用相应的基因组名称（129 或 Cas）标记该序列。然后，在浏览器中输入 Primer3Plus 的网址。在指定区域中，粘贴替换后的 129 序列片段。

使用默认设置设计引物。要设计内侧等位基因特异性引物，请点击“Task”右侧的下拉菜单，选择“Primer List”，然后点击“Pick Primers”。新页面将打开，显示正向和反向引物列表。

勾选复选框，选择在3'端或距3'端四个碱基范围内的位置标有小写字母“snip”的正向或反向引物。请注意，在3'端具有“snip”的引物在qPCR过程中表现出更高的等位基因特异性。点击屏幕底部的“发送到Primer3管理器”。

新页面将打开并显示所选引物。要选择第二条引物，请返回引物列表页面，然后单击返回按钮以回到主页面。在任务下拉菜单中，选择检测。

主页面将刷新，并在底部出现左侧和右侧引物序列输入框。将第一条引物序列粘贴到相应的输入框中。接下来，切换到“主”选项卡旁边的“常规设置”选项卡，并将产物大小范围设置为 80 至 200 个碱基对。

单击“选择引物”，将打开一个页面，显示第一条引物序列的五对可能的引物组合。通过勾选引物左侧的复选框，从引物对列表中选择一组引物，然后单击屏幕底部的“发送到Primer3管理器”。这些引物将用于129内侧等位基因特异性扩增。

重复这些步骤以设计针对cast等位基因的引物。然后，将该技术应用于设计外侧等位基因特异性引物和非等位基因特异性引物。最后，按照随附文档中所述的方法，使用qPCR检测引物的等位基因特异性。

提取先前制备的96孔板中的基因组DNA。短暂离心平板，使任何冷凝液沉降至孔底。此DNA将作为缺失筛选的模板。

接下来，在384孔板上对每个克隆进行qPCR预扩增，并设置重复。采用两步PCR法，随后进行熔解曲线分析并检测。运行结束后，首先使用内侧等位基因特异性引物检测每个等位基因的扩增情况。

若一个等位基因无扩增，或等位基因之间的CT值差异超过五个循环，则表明这些克隆携带杂合性缺失。若两个等位基因均无扩增，则表明它们携带纯合性缺失。接下来，使用外侧等位基因特异性引物检测每个等位基因的扩增情况。

如果目标缺失大于1 KB，则仅在缺失存在时，使用外侧引物才能扩增出产物。CT值在22至28之间可确认缺失的存在。对于小于1 KB的目标缺失，需通过电泳确认扩增子的大小。

使用等位基因特异性内引物通过qPCR筛选了96孔板中的缺失克隆。灰色柱代表来自Cas特异性引物的扩增结果，黑色柱代表来自129特异性引物的扩增结果。内引物扩增的CT值较低或无扩增表明目标片段已缺失。

随后使用外侧引物对在一条或两条等位基因上发生缺失的克隆进行筛选。使用外侧引物时，扩增结果可证实缺失的存在。对于单等位基因缺失的克隆，采用跨越gRNA靶向区域的引物进行筛选，以确认未缺失的等位基因上不存在插入或缺失（称为indel）。

后续表达分析仅使用在非缺失等位基因的靶位点处无大片段插入或缺失的单等位基因克隆。此处显示的是来自129或Cas SCR缺失克隆的代表性结果。SCR是近期报道的在胚胎干细胞中特异性调控Sox2的增强子。

红色柱状图表示 Sox2 Cas 等位基因的表达，蓝色柱状图表示 Sox2 129 等位基因的扩增。从本图可以看出，在 129 或 Cas 等位基因上删除 SCR 会降低 CIS 中 Sox2 的表达水平。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用 CRISPR 技术构建大片段缺失，并使用等位基因特异性引物对缺失克隆进行基因型鉴定。