Name: 生成CRISPR / Cas9介导的单等位基因缺失来研究小鼠胚胎干细胞功能增强 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 了解CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失技术，用于研究小鼠胚胎干细胞中基因转录调控机制。该方法利用杂交基因组分析单等位基因缺失，揭示增强子与基因表达的关系。

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我们感谢Mitchell实验室所有成员的有益讨论。本工作得到了加拿大卫生研究院、加拿大创新基金会以及安大略省研究与创新部的支持（JAM持有的运营和基础设施资助）。

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<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-scale+genome-modified+mice+using+gRNA+and+CAS9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).</li>
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<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+reveals+a+distal+super-enhancer+required+for+Sox2+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114485(2014).</li>
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<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
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<li>Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+quantitative+PCR+for+the+analysis+of+cytokine+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels.</a> Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+effects+of+position+and+type+of+single+mismatch+on+single+base+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension.</a> J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
</ol>

作者已阅读 JoVE 关于利益冲突的政策，且无任何利益冲突需要披露。

CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术为基因组修饰提供了一种简便、快速且经济的方法。本文详述的方法利用 F1 小鼠细胞中的 SNP 来生成并分析单等位基因增强子缺失，以实现对功能增强子的表征。该方法的优势包括：1）单等位基因增强子缺失不会导致关键增强子在两个等位基因上同时缺失所引发的混杂效应，i.e.，靶基因蛋白表达水平大幅降低，进而引起细胞致死或表型改变；2）若单等位基因缺失频率较低，则获得纯合缺失的可能性较小；然而，通过在基因表达分析中使用等位基因特异性引物，仍可对携带单等位基因缺失的克隆进行分析；3）使用四对引物筛选单等位基因缺失，可排除含有部分缺失或大片段缺失的克隆，避免对后续分析造成干扰。
等位基因特异性引物设计对于基因分型单等位或双等位CRISPR缺失以及以等位基因特异性方式分析其对基因表达的影响至关重要。当所使用的F1细胞含有更频繁的SNP时，这种区分两个等位基因的操作更容易实现。本文使用由Mus musculus129与Mus castaneus杂交产生的胚胎干细胞（ES细胞）；然而，...

转录调控元件在发育过程中对基因表达进行时空精细调控至关重要1，这些元件的改变可因基因异常表达而导致疾病2。全基因组关联研究鉴定出的许多疾病相关区域位于非编码区，并具有转录增强子的特征3-4。由于增强子通常位于其所调控基因数千碱基之外，且可能以组织特异性方式被激活，因此识别增强子并将其与靶基因匹配具有较大挑战性5-6。增强子的预测通常基于组蛋白修饰标记、中介复合物-黏连蛋白复合体以及细胞类型特异性转录因子的结合情况7-10。对预测增强子的验证通常通过基于载体的检测方法进行，即增强子激活报告基因的表达11-12。这些数据可提供关于候选增强子序列调控潜力的重要信息，但无法揭示其在内源基因组环境中的功能，也无法确定其所调控的基因。基因组编辑技术可通过功能缺失分析，成为研究转录调控元件在其内源基因组背景下功能的有力工具。
基因组编辑技术的最新进展，特别是CRISPR/Cas9基因组编辑系统，促进了对基因组功能的研究。CRISPR/Cas9系统操作简便，且适用于多种生物体系。Cas9蛋白通过向导RNA（gRNA）被靶向至基因组中的特定位点13。SpCas9/gRNA复合物在基因组中扫描其靶序列，该序列必须位于原间隔序列邻近基序（PAM）序列NGG的5'端14-15。gRNA与其靶序列（一段与gRNA互补的20个核苷酸（nt）序列）发生碱基配对后，激活SpCas9的核酸酶活性，从而在PAM序列上游3个碱基对（bp）处产生双链断裂（DSB）。特异性主要依赖于gRNA种子区域（即紧邻PAM的6–12 nt区域）的完全碱基配对；相反，种子区域5'端的错配通常可被容忍16-17。所产生的DSB可通过非同源末端连接（NHEJ）DNA修复或同源定向修复（HDR）机制进行修复。NHEJ DNA修复常在靶位点引入几个碱基对的插入或缺失（indels），从而破坏基因的开放阅读框（ORF）。为了在基因组中产生较大的缺失，可使用两个gRNA，分别位于目标区域的两侧18-19。该策略在研究转录增强子时尤为有用，特别是那些成簇分布于位点控制区或超级增强子中的增强子，其规模大于传统的增强子9,18,20-22。
单等位基因缺失是研究的宝贵模型 顺式转录调控。在单等位基因增强子缺失后观察到的转录水平变化，能够反映该增强子在基因调控中的作用，同时避免了双等位基因转录同时受影响可能带来的细胞适应性干扰。然而，若无法区分缺失等位基因与野生型等位基因，则难以评估表达水平的降低情况。此外，在无法区分两个等位基因的情况下，对每个等位基因进行缺失基因分型具有挑战性，尤其是对于大片段缺失而言。 &gt;10 kb 至 1 Mb23 难以通过PCR扩增整个野生型区域。使用通过杂交产生的F1胚胎干细胞 Mus musculus129 与 Mus castaneus 通过等位基因特异性PCR可区分两个等位基因18,24这些细胞中的杂合基因组有利于进行等位基因特异性缺失筛选和表达分析。这两个基因组之间平均每125个碱基对就存在一个单核苷酸多态性（SNP），为表达分析和基因分型分析中的引物设计提供了灵活性。单个SNP的存在可能影响引物的熔解温度（Tm以及在实时定量PCR（qPCR）扩增中实现目标特异性，从而能够区分两个等位基因25此外，引物3'端的错配会极大影响DNA聚合酶从引物延伸的能力，从而阻止非目标等位基因的扩增26以下方案描述了利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统对F1胚胎干细胞进行等位基因特异性增强子删除（删除片段大于1 kb）及后续表达分析的方法图1).
<img alt="基因编辑过程；Cas9-gRNA，DNA双链断裂；示意图和PCR结果；CRISPR方法。" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 利用CRISPR/Cas9删除增强子以研究cis-调控基因表达。(A) 通过Mus musculus129与Mus castaneus杂交获得的F1胚胎干细胞（ES细胞），可用于实现等位基因特异性的删除。(B) 使用两种向导RNA（gRNA）诱导Cas9介导的大片段增强子区域删除。(C) 使用多组引物鉴定大片段的单等位基因和双等位基因缺失。橙色引物为内侧引物，紫色引物为外侧引物，绿色引物为gRNA侧翼引物。(D) 通过等位基因特异性qPCR监测基因表达变化。RFU表示相对荧光单位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>Phusion高保真DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>用于gRNA组装的高保真DNA聚合酶</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_克隆载体</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td>将目标序列克隆到该载体中以构建gRNA质粒</td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>密码子优化的 SpCas9 与 EGFP 共表达质粒</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统 100 &amp;micro;L 型试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>微孔电穿孔转染技术</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>基因组DNA提取试剂</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel &amp;和 PCR 产物纯化</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>高速质粒小提试剂盒</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>内毒素去除型大提质粒试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Geneaid</td><td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR select mix for CFX</td><td>Life Technologies</td><td>4472942</td><td>qPCR 试剂</td></tr><tr><td>iScript cDNA合成试剂盒</td><td>伯乐（Bio-rad）</td><td>170-8891</td><td>逆转录试剂</td></tr><tr><td>含EDTA的0.25%胰蛋白酶</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca/Mg 的 PBS&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA 第 V 组分（7.5%）</td><td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Max Efficiency DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ES细胞鉴定合格</td><td></td><td>FBS需在小鼠ES细胞中进行多能性预测试</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>封口胶带</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>无酒精细胞冻存容器</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>F1 ES细胞培养抑制剂</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>F1 ES细胞培养抑制剂</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>F1 ES细胞培养抑制剂</td></tr></tbody></table>

利用crispr/cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

增强子通过以位置和方向无关的方式调控组织特异性基因表达来控制细胞身份。这些增强子通常位于被调控基因远端的基因间区域，甚至位于另一个基因的内部。增强子活性的位置无关性使得将增强子与其所调控的基因进行匹配变得困难。删除增强子区域可为增强子活性提供直接证据，并且是揭示增强子在内源性基因转录中作用的金标准。基于传统同源重组的删除方法已被近年来基因组编辑技术的进步所超越，后者能够对多种模式生物的基因组进行快速且精确定位的修改。由于Cas9可通过定制表达质粒中的向导RNA轻松靶向基因组，CRISPR/Cas9介导的基因组编辑可快速、低成本地在多种细胞类型和生物体中实现基因组操作。对关键基因调控元件进行纯合删除可能导致致死性或改变细胞表型，而对转录增强子进行单等位基因删除则可在避免此类混杂因素的情况下研究基因表达的cis调控。本文介绍了一种在F1小鼠胚胎干细胞（ES细胞）（Mus musculus129 × Mus castaneus）中进行CRISPR/Cas9介导的删除的实验方案。由于这两种等位基因之间平均每125 bp就存在一个单核苷酸多态性（SNP），因此可利用这些SNP实现单等位基因删除后的筛选与表达分析。

本方案使用F1 ES细胞进行研究 cis-利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术生成的单等位基因增强子缺失细胞中基因表达的调控图1）。基因分型和基因表达分析中的gRNA及等位基因特异性引物设计是该方法的关键因素。每对等位基因特异性引物均需通过qPCR验证其等位基因特异性。理想情况下，等位基因特异性引物应仅扩增其对应的基因组DNA靶标（图2）。理想情况下，这些引物在其3'端应包含一个SNP。若引物对等位基因的特异性较低，则需确保其在扩增正确基因型与错误基因型时的Ct值差异至少达到5个循环。25. 引物的SNP位点位于更偏5'端的位置th 从3'端起始的引物通常无法表现出等位基因特异性，会以相同的效率扩增两种基因型，这凸显了SNP在引物中位置的重要性34此外，研究表明，嘌呤/嘌呤或嘧啶/嘧啶替换对结果具有更大的影响 Tm 两种引物之间的差异相较于嘌呤/嘧啶替换<sup...

通过功能缺失分析是验证增强子活性的最佳方法。本文介绍了一种高效方案，利用CRISPR/Cas9介导的缺失技术，在含有杂合基因组（Mus musculus129 × Mus castaneus）的F1胚胎干细胞中研究基因转录的等位基因特异性调控。

利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

增强子通过以位置和方向无关的方式调控组织特异性基因表达来控制细胞身份。这些增强子通常……

本实验的总体目标是利用等位基因特异性的CRISPR/Cas9介导的缺失来研究小鼠胚胎干细胞中基因转录的调控。该技术的主要优势在于使用杂合基因组来生成和分析单等位基因缺失，从而避免了分析可能无法存活的单等位基因增强缺失的需要。该方法有助于回答功能基因组学领域的关键问题，例如，某个特定增强子调控的是哪个基因，以及该基因的活性在多大程度上依赖于任何一个特定增强子。尽管该方法可为干细胞多能性的研究提供洞见，但它也可应用于其他系统。例如，这有助于我们理解干细胞如何改变其命运，分化为神经元、血细胞或肌肉细胞。在设计、构建并确认拟使用的引导RNA（gRNA）序列后，准备将无内毒素质粒转染到ES细胞中。使用离心机，在300 × g条件下离心5分钟，将由Mus musculus 129与Mus castaneus杂交获得的1 × 10⁶个F1胚胎干细胞在1.5毫升离心管中沉淀。离心后，弃去上清液，加入100微升试剂盒生产商提供的重悬缓冲液。为删除目标DNA区域，加入各5微克的P Cas9 GFP 5'端和3'端gRNA质粒。用移液器轻轻混匀。避免引入气泡。接下来，使用电穿孔仪的电子移液器吸头吸取 100 µL 电穿孔混合液，注意避免将空气吸入吸头中。然后，将移液器插入转染装置中。选择合适的程序并按下启动。电穿孔运行时，观察尖端。在正确设置下，微小的气泡应从管状电极中冒出。火花表明存在气泡，会干扰转染过程。若出现此情况，必须使用新的一批细胞重新进行电穿孔。电穿孔完成后，将转染后的细胞注入含有十毫升 ES 细胞培养基的十厘米明胶包被培养皿中。将转染后的细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。48小时后，使用流式细胞仪分选并分离表达九型GFP的阳性ES细胞。随后，将1至1.5 × 10⁴个GFP阳性细胞接种至含有10毫升ES细胞培养基的10厘米凝胶包被培养皿中。以这种低密度接种将有助于挑取单个 ES 细胞克隆。4 到 5 天后，使用显微镜识别呈球形的单个 ES 细胞克隆。用移液器将每个克隆转移至经明胶预处理并含有 30 µL tripsom 的 96 孔板的一个孔中。将所有克隆挑取并分散至培养基后，于二氧化碳培养箱中 37 摄氏度培养细胞，直至大多数孔中细胞融合度超过 70%。此过程通常需要约两天时间。当细胞准备传代时，吸除培养基，并加入 30 微升胰蛋白酶溶液。将细胞孵育五分钟。然后，向每孔加入 180 µL ES 细胞培养基以中和胰蛋白酶。吹打混匀，获得单细胞悬液。从每个孔中转移 70 微升至三个含胶原素包被的 96 孔板中，每个孔内含 130 微升 ES 细胞培养基。在 37 摄氏度下孵育。当孔板细胞融合度达到 70% 至 85% 时，用于后续各克隆的基因型鉴定和表达分析，具体方法见下文各节所述。按照随附文档中所述方法冻存细胞株。此处将设计四组引物用于筛选克隆中目标基因的缺

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

生成CRISPR / Cas9介导的单等位基因缺失来研究小鼠胚胎干细胞功能增强

CRISPR/Cas9 是一种强大的系统，可用于破坏基因和遗传元件。本文介绍了一种利用 CRISPR/Cas9...

利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞系中产生基因组缺失

蛋白质通常包含多个可发挥不同细胞功能的结构域。基因敲除（KO）无法考虑这种功能多样性。本文中，我们报道了一种基于重组介导的盒式交换（RMCE）的结构-功能研究方法，该方法应用于基因敲除的胚胎干细胞，可实现对蛋白质不同功能结构域或变异体的分子解析。...

利用重组酶介导的盒式交换在小鼠胚胎干细胞中进行结构-功能研究

本方案描述了使用失活融合蛋白SID4X-dCas9-KRAB（也称为增强子干扰，Enhancer-i）对增强子进行多重靶向设计与操作的步骤。该方案可用于鉴定调控基因表达的增强子，并有助于解析调控同一靶基因的多个增强子之间的相互关系。...

利用细胞系中基于多重CRISPR的增强子干扰解析增强子功能

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

该方法旨在追踪细胞系中由PRC2介导的染色质结构域的形成过程，并且可适用于许多其他系统。...

一种研究方法 从头合成 染色质结构域的形成

本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。...

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

本文介绍了一种改良的一细胞胚胎冷冻保存方法，以及一种将冻融胚胎与电穿孔技术相结合的方案，用于高效制备基因修饰小鼠。...

利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。...

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

本文报道了利用CRISPR/Cas9系统构建着丝粒相关蛋白E（CENP-E）基因敲除细胞及三种基于表型的筛选策略。我们已利用CENP-E 基因敲除细胞系建立了一种新方法，用于验证CENP-E抑制剂的特异性和毒性，该方法对药物开发和生物学研究具有重要意义。...

使用 CRISPR/Cas9 系统构建着丝粒相关蛋白-E CENP-E-/- 敲除细胞系

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

了解CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失技术，用于研究小鼠胚胎干细胞中基因转录调控机制。该方法利用杂交基因组分析单等位基因缺失，揭示增强子与基因表达的关系。

利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

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