Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

该程序的总体目标是使用等位基因特异性 CRISPR/Cas9 介导的缺失来研究小鼠胚胎干细胞中基因转录的调节。该技术的主要优点是使用杂交基因组生成和分析单等位基因缺失。相反，它消除了分析可能不可行的单等位基因增强缺失的需要。

这种方法可以帮助回答功能基因组学领域的关键问题。例如，特定增强子调节哪个基因，以及该基因对其活性的任何一个增强子的依赖性。那些这种方法可以提供对干细胞多能性的见解，它也可以应用于其他系统。

例如，它可以帮助我们了解干细胞如何改变它们的命运，变成神经元、血细胞或肌肉。在设计、构建和确认要使用的向导 RNA 或 gRNA 的序列后，准备将无内毒素的质粒转染到 ES 细胞中。使用离心机，将 Mus musculus 129 与 Mus castaneus 在 1.5 毫升试管中以 300 倍 g' 杂交 5 分钟，沉淀 1 乘以 10 至第六个 F1 胚胎干细胞。

离心后，弃去上清液，加入 100 μL 试剂盒制造商提供的重悬缓冲液。对于目标 DNA 区域的缺失，添加 P Cas9 GFP 5-prime 和 3-prime gRNA 质粒各 5 μg。使用移液管轻轻混合。

避免引入任何气泡。接下来，使用微量穿孔仪的电动移液器吸头吸出 100 μL 电穿孔混合物，注意避免将空气引入吸头。然后，将移液器插入转染装置。

选择适当的协议，然后按 start。在电穿孔运行时，观察尖端。通过正确的设置，微小的气泡应该会从管状电极中冒出。

火花表示存在气泡，会干扰转染。如果发生这种情况，则必须对新一批细胞重复电穿孔。电穿孔后，将转染的细胞弹出到含有 10 毫升 ES 细胞培养基的 10 厘米明胶包被培养皿中。

在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育转染的细胞。48 小时后，使用流式细胞仪对铸型 9 个 GFP 阳性 ES 细胞进行分类和分离。然后，将 10 至 10 厘米的明胶包被培养皿中，以 10 至 1.5 倍的剂量喂食至第 4 个 GFP 阳性细胞，培养 10 毫升 ES 细胞培养基。

以这种低密度铺板将有助于拾取单个 ES 细胞集落。4 到 5 天后，使用显微镜鉴定单个球形单个 ES 细胞集落。使用移液器将每个菌落转移到用明胶预处理并含有 30 μL tripsom 的 96 孔板的一个孔中。

一旦所有菌落都被挑取并解离到培养基中，在二氧化碳培养箱中以 37 摄氏度培养细胞，直到大多数孔超过 70% 汇合。这通常需要大约两天时间。当细胞准备好分液时，去除培养基并加入 30 μL tripsom。

将细胞孵育 5 分钟。然后，向每个孔中加入 180 微升 ES 细胞培养基以中和三联体。上下移液以获得单细胞悬液。

从每个孔中，将 70 μL 转移到三个明胶包被的 96 孔板中，每个孔中含有 130 μL ES 细胞培养基。在 37 摄氏度下孵育。当板达到 70% 至 85% 汇合度时，使用它们对每个克隆进行基因分型和表达分析，如以下各节所述。

如随附文件所述冷冻细胞原液。在这里，将设计四组引物来筛选克隆以获得所需的缺失。这些包括：内部引物、外部引物以及 5-引物和 3-引物 gRNA 靶位点的 gRNA 侧翼引物。

首先访问此处显示的网站，以获得对应于 129 和 Cas 基因型的单核苷酸多态性或片段轨迹。这指向 Mitchell Lab CRISPR 网页。在那里，单击给定的链接。

该站点将重定向到 UCSC 基因组浏览器，其中包含显示 MM-9 小鼠基因组组装中 129 和 Cas 基因组之间的片段的轨道。接下来，输入要删除的区域的坐标。然后单击 go"放大所需删除中间包含三个以上片段的大约 500 个碱基对的区域。

如果片段稀缺，等位基因特异性引物设计可能会很复杂。如果无法设计绝对等位基因特异性引物，则可以使用中等等位基因特异性引物。请记住在分析 qPCR 结果期间比较已删除和未删除克隆之间的 CT 值。

现在，单击顶部面板中的"查看"。从下拉菜单中，选择 DNA。此时将出现 Get DNA in Window（在窗口中获取 DNA）页面。

在序列格式化选项中，选择全部大写，然后单击 Get DNA（获取 DNA）以全部大写格式显示目标序列。复制此序列并将其粘贴到 Word 文档文件中。然后，将序列与 129 个强制转换截图轨道进行比较，突出显示截图位置，并用小写字母标记 129 个截图。

完成 129 序列后，复制它以创建两个快速日期格式的序列。1 个用于 129，一个用于 Cas。在强制转换序列中，在每个截图位置替换正确的碱基，用小写标记截图。

接下来，用其相应的基因组 129 或 Cas标记序列。然后，在浏览器中输入 Primer3Plus 的地址。在适当的区域中，粘贴 snip substitute 129 序列。

使用默认设置设计引物。要设计内部等位基因特异性引物，请单击右侧的下拉菜单"任务"并选择引物列表"，然后单击 Pick 引物。将打开一个新页面，显示正向和反向引物列表。

选中选择框以选择在 3-prime 端或 3-prime 端的四个碱基内具有小写标记的 snip 的正向或反向引物。请注意，在 3 引物末端有片段的引物在 qPCR 过程中显示出更高的等位基因特异性。单击屏幕底部的 Send to Primer3 Manager"。

将打开一个新页面，显示所选引物。要选择第二个引物，请返回引物列表页面，然后单击返回按钮以返回主页面。在任务下拉菜单中，选择 Detection。

主页将刷新，底部将出现左右引物序列框。将第一个引物序列粘贴到相应的框中。接下来，导航到【主要】选项卡旁边的【常规设置】选项卡，并将商品尺寸范围的设置更改为 80 到 200 个碱基对。

Click Pick Primers（选择引物）将打开一个页面，显示第一个引物序列的五个可能的引物对。通过选中引物左侧的框，从引物对列表中选择引物组，然后单击屏幕底部的 Send to Primer3 Manager"。这些将是 129 个内部等位基因特异性引物。

重复这些步骤以设计铸造等位基因的引物。然后，将该技术应用于外部等位基因特异性引物和非等位基因特异性引物的设计。最后，使用 qPCR 测试引物的等位基因特异性，如随附文件所述。

从先前制备的 96 孔板中提取基因组 DNA。短暂离心板以将任何冷凝物沉降到孔底部。该 DNA 将用作缺失筛选的模板。

接下来，在 384 孔板上，为每个克隆进行 qPCR 和复制。使用两步法 PCR，然后进行熔解曲线分析并进行检测。运行后，首先检查每个等位基因是否使用内部等位基因特异性引物进行扩增。

没有一个等位基因的扩增或等位基因之间 CT 值差异超过 5 个周期，表明这些克隆携带杂合缺失。两个等位基因的扩增均表明它们携带纯合缺失。接下来，检查每个等位基因是否使用外部等位基因特异性引物进行扩增。

如果靶标缺失大于 1 KB，则只有在存在缺失时才会发生使用外部引物的扩增。CT 值为 22 至 28 确认缺失。对于小于 1 KB 的靶标缺失，通过电泳确认扩增子大小。

使用 qPCR 使用等位基因特异性内部引物筛选缺失克隆的 96 孔板。灰色条表示来自 Cas 特异性引物，黑色条表示来自 129 种特异性引物的扩增。低 CT 值或没有引物内部的扩增表明靶标缺失。

然后用外部引物筛选一个或两个等位基因缺失的克隆。使用外部引物，扩增确认缺失。使用位于 gRNA 靶区两侧的引物筛选具有单等位基因缺失的克隆，以确认未缺失等位基因上不存在插入或缺失，称为插入缺失。

在随后的表达分析中，仅使用在未缺失等位基因上的靶位点没有大插入缺失的单等位基因克隆。此处显示的是 129 个或 Cas SCR 缺失克隆的代表性结果。SCR 是 ES 细胞中最近描述的 Sox2 特异性增强子。

红色条形代表 Sox2 Cas 等位基因的表达，蓝色条形代表 Sox2 129 等位基因的扩增。从该图中可以看出，129 或 Cas 等位基因上的 SCR 缺失降低了 CIS 中 Sox2 的表达。看完这个视频后，您应该对如何使用 CRISPR 技术生成大缺失并使用等位基因特异性引物对缺失的克隆进行基因分型有一个很好的了解。