一种结合染色体微阵列比较基因组杂交、全外显子组测序的新型策略 子宫内 电穿孔法在啮齿类动物中鉴定脑部畸形的致病基因

本实验的总体目标是鉴定脑发育畸形疾病的新型候选基因，并在体内直接验证其致病作用。该策略有助于通过发现与脑发育及相关病理过程相关的分子通路，回答神经生物学领域的关键科学问题。该策略的主要优势在于，有助于发现与脑部疾病相关的新基因，并推动新型诊断工具的开发。

利用该方法，我们能够揭示C6orf70基因在室管膜下结节性异位（一种由神经元迁移异常引起的脑部畸形）发病机制中的关键作用。本实验操作将由本实验室的工程师Fabienne Schaller进行演示。请按照书面实验方案以及机构和国家指南的要求，准备一只E15孕鼠用于实验操作。

确保动物已正确麻醉，眼睛已涂抹眼用软膏，腹部已妥善剃毛并消毒。使用锋利的剪刀在尾侧腹部正中线的皮肤和肌肉上做一个2厘米长的垂直切口，小心地从腹腔中暴露一侧子宫角。滴加37°C预热的生理盐水溶液，以保持胚胎湿润。

在整个操作过程中保持子宫湿润。注射DNA时，用一只手轻轻握住胚胎，使头部易于接触。然后，用另一只手小心地将连接至显微注射仪的玻璃毛细管插入侧脑室左侧，该位置位于中线外侧1毫米处，深度为2至3毫米。

使用显微注射仪注入约一微升含有快绿的DNA，以便通过视觉监测注射过程。为将DNA电穿孔转入细胞，首先将生理盐水溶液滴加至3毫米×7毫米电极的表面，然后将正极置于注射侧，负极置于未注射的右心室。

使用脚控踏板以950毫秒的间隔递送五个电脉冲。电穿孔后，将子宫角放回腹腔，并加入无菌生理盐水，以使胚胎更自然地定位，并补偿术中液体流失。用可吸收外科缝线缝合肌层，然后用间断缝合法缝合皮肤。

根据机构指南提供长达48小时或指定时间的术后镇痛。将大鼠放回清洁的饲养笼中，并监测直至其从麻醉状态恢复。按照方案书面部分所述，用4%多聚甲醛固定脑组织后，用PBS洗涤10分钟。

洗涤过程中，准备50毫升含4%琼脂的PBS溶液，确保溶解的琼脂糖温度不超过50摄氏度。将琼脂糖倒入塑料包埋模具中，然后将脑组织放入琼脂糖内。将包埋好的脑组织置于4摄氏度环境中，使琼脂糖聚合至少1小时。

琼脂糖凝固后，将脑组织周围多余的琼脂糖切除，然后将脑组织粘附到振动切片机底板上，使脑的前-后轴垂直于刀片。等待数分钟使胶水干燥后，将粘有脑组织的底板放入振动切片机的切片腔中。用 PBS 填充切片腔，并开始切出厚度为 100 µm 的切片。

切片后，将切片转移至显微镜载玻片并除去多余液体。随后滴加数滴封片介质，并在切片上放置盖玻片。室温避光静置过夜使其干燥。

使用激光扫描共聚焦显微镜以 10 倍放大倍数对切片进行成像。为分析图像，首先使用适当的定量图像分析软件将图像转换为 8 位。然后选择一个具有代表性的 GFP 阳性荧光细胞，通过点击估算并使用手绘选择工具手动勾勒细胞边界，定义其形状。

该软件会自动保留细胞的直径和强度阈值。单击“查找细胞”以使软件在整个皮层中定位转染的细胞。然后，如有需要，可手动去除假阳性结果。

通过点击区域工具，选择八个区域条带，将皮层全层厚度划分为八个标准化的兴趣区域，其中条带一和条带八分别对应脑室区和皮层板顶部。接着，点击应用，使软件能够计算整个皮层中GFP转染细胞的相对位置。最后，点击保存定量结果，将数据导出为Excel文件以供分析。

通过阵列CGH和全外显子组测序，发现C6orf70是发育相关基因异常的候选基因。定量PCR结果表明，该基因与PHF10和DLL1均在大鼠大脑皮层中表达。以下图像显示了E20大鼠脑在电穿孔5天后的代表性新皮层冠状切片，电穿孔处理分别使用了仅含绿色荧光蛋白表达载体的构建体、针对C6orf70编码序列的shRNA联合载体，或相对无效的错配对照构建体。

以 Filament A 沉默作为神经元迁移受损的对照。通过子宫内电穿孔将靶向 C6orf70 或 Filament A 的 shRNA 导入后，GFP 阳性细胞在室管膜区停滞，如白色箭头所示；而仅表达 GFP 或与错配对照结构共表达的细胞则未改变神经元迁移。在进行该操作时，需明确拟分析的皮层发生阶段，即神经元增殖、迁移或成熟阶段。

请记住，掌握在啮齿类动物胚胎大脑中进行子宫内电穿孔技术需要长期的训练、技巧以及定期练习。