Name: 一种新的结合阵列全息、全外测序和宫内电穿孔的方法来识别脑畸形的致病基因 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解一种结合阵列CGH、全外显子测序和宫内电穿孔的新策略，用于识别脑畸形致病基因并在体内验证其功能。该方法有助于发现与脑发育障碍相关的新基因并开发诊断工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们感谢 G. McGillivray 博士、J. Clayton-Smith 教授、W.B. Dobyns 教授、P. Striano 教授、I.E. Scheffer 教授、S.P. Roberston 教授和 S.F. Berkovic 教授提供 MCD 患者样本。感谢 F. Michel 博士和 D. Mei 提供技术指导和帮助。本研究获得了欧盟第七框架计划 DESIRE 项目（合同编号：Health-F2-602531-2013）（资助对象：V.C.、R.G.、A.R.、A.F. 和 C.C.）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）（资助对象：A.R. 和 C.C.）、Jérôme Lejeune 基金会（R13083AA，资助对象：A.F.、E.P.P. 和 C.C.）以及普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区（APO2014 - DEMOTIC，资助对象：C.C. 和 A.A.D.）的经费支持。D.A.K. 是欧洲分子生物学组织（EMBO）青年研究员，同时获得奥地利科学基金会（FWF）资助（项目编号 I914 和 P24367）。

<ol><li>Meencke, H. J., Veith, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1285910">Migration disturbances in epilepsy.</a> Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).</li>
<li>Shorvon, S., Stefan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+safety+of+newer+antiepileptic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Overview of the safety of newer antiepileptic drugs.</a> Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).</li>
<li>Parrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periventricular+heterotopia%3A+phenotypic+heterogeneity+and+correlation+with+Filamin+A+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations.</a> Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).</li>
<li>Fox, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+filamin+1+prevent+migration+of+cerebral+cortical+neurons+in+human+periventricular+heterotopia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia.</a> Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).</li>
<li>Sheen, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+ARFGEF2+implicate+vesicle+trafficking+in+neural+progenitor+proliferation+and+migration+in+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex.</a> Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).</li>
<li>Cappello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+genes+encoding+the+cadherin+receptor-ligand+pair+DCHS1+and+FAT4+disrupt+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development.</a> Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).</li>
<li>Moro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periventricular+heterotopia+in+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Periventricular heterotopia in fragile X syndrome.</a> Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).</li>
<li>Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periventricular+nodular+heterotopia+and+Williams+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+A%22%5BJournal%5D)">Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome.</a> Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).</li>
<li>van Kogelenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periventricular+heterotopia+in+common+microdeletion+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syndromol%22%5BJournal%5D)">Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes.</a> Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).</li>
<li>Sheen, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periventricular+heterotopia+associated+with+chromosome+5p+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies.</a> Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).</li>
<li>Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+chromosome+1p36+is+associated+with+periventricular+nodular+heterotopia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+A%22%5BJournal%5D)">Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia.</a> Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).</li>
<li>Cardoso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periventricular+heterotopia%2C+mental+retardation%2C+and+epilepsy+associated+with+5q14.3-q15+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion.</a> Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).</li>
<li>Cellini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periventricular+heterotopia+with+white+matter+abnormalities+associated+with+6p25+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+A%22%5BJournal%5D)">Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion.</a> Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).</li>
<li>Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+6q+terminal+deletions%3A+an+emerging+new+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+A%22%5BJournal%5D)">Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome.</a> Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).</li>
<li>Dobyns, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+chromosome+abnormalities+identify+novel+polymicrogyria+loci+in+1p36.3%2C+2p16.1-p23.1%2C+4q21.21-q22.1%2C+6q26-q27%2C+and+21q2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+A%22%5BJournal%5D)">Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2.</a> Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).</li>
<li>Conti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periventricular+heterotopia+in+6q+terminal+deletion+syndrome%3A+role+of+the+C6orf70+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene.</a> Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).</li>
<li>Sheen, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiological+heterogeneity+of+familial+periventricular+heterotopia+and+hydrocephalus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus.</a> Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).</li>
<li>Jaglin, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+beta-tubulin+gene+TUBB2B+result+in+asymmetrical+polymicrogyria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria.</a> Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).</li>
<li>Falace, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBC1D24+regulates+neuronal+migration+and+maturation+through+modulation+of+the+ARF6-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).</li>
<li>Lunter, G., Goodson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stampy%3A+a+statistical+algorithm+for+sensitive+and+fast+mapping+of+Illumina+sequence+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads.</a> Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).</li>
<li>Pagnamenta, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+can+detect+pathogenic+mosaic+mutations+present+at+low+allele+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies.</a> J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).</li>
<li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).</li>
<li>Bai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).</li>
<li>Carabalona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glial+origin+for+periventricular+nodular+heterotopia+caused+by+impaired+expression+of+Filamin-A%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A.</a> Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

皮质发育畸形（MCDs）是智力障碍的重要病因，占儿童期耐药性癫痫病例的20-40%1,2。在过去十年中，由于两个主要因素，人们对MCDs的兴趣显著增加。第一个因素是脑成像技术（尤其是磁共振成像，MRI）的进步，使医生和科学家能够观察到许多以往未被识别的脑部畸形。另一个因素是遗传学工具的发展，使得大量新的MCD致病基因得以被发现。这极大地加深了我们对大脑发育和功能机制的理解，并实现了更精确的遗传咨询。
过去，研究人员主要致力于致病基因的鉴定，而将设计功能实验以阐明这些基因在脑发育中的作用留待后续阶段。随着研究从罕见的、反复出现的遗传性疾病转向更为常见的散发性障碍，这一过程变得更加困难，因为传统的基因发现方法难以适用于后者。目前用于鉴定致病基因的方法通常只能识别出包含大量基因的较大基因组区域（如通过染色体微阵列分析，array-CGH），或在多个候选基因中发现若干难以验证的变异（如通过全外显子组测序WES或全基因组测序WGS）。
<p class="jove_c...

大脑皮层在认知和智力过程中起着关键作用，同时参与情绪调控、学习与记忆。因此，许多神经系统和精神疾病都源于皮层发育畸形（MCD）。MCD 的病因复杂，涉及获得性因素和遗传因素。遗传决定的 MCD 累积患病率约为 2%，且大多数为散发病例。例如，先天性脑发育不良在人群中的发病率估计超过 1%，某些类型的 MCD 在所有癫痫患者中占比超过 14%，在重度或难治性癫痫患者中则高达 40%1,2。
室管膜下结节状异位（Periventricular Nodular Heterotopia, PNH）是最常见的脑皮质发育畸形（MCDs）之一，由神经元从脑室区（VZ）向发育中的大脑皮层迁移异常所致。神经元迁移失败导致异位神经元聚集在侧脑室壁周围，通常可通过磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）观察到。PNH 的临床表现、解剖特征和影像学特征具有异质性。结节可表现为单侧小范围病灶，也可为双侧对称性病灶。常见的临床后遗症包括癫痫和智力障碍3。位于 Xq28 的 Filamin A（即 FLNA）基因突变在所有 X 连锁双侧 PNH 家系中均被发现，在散发患者中检出率为 26%3,4。位于 20q13 的 ARFGEF2 基因突变可导致一种罕见的隐性遗传型 PNH，已在两个近亲婚配家族中报道5。最近，在九名患有包括 PNH 在内的多系统疾病患者中，发现编码钙黏蛋白受体-配体对 DCHS1 和 FAT4 的基因存在双等位基因突变6。PNH 还被发现与脆性 X 综合征7、威廉姆斯综合征8、22q11 微缺失综合征9、5p15 重复10、1p36 缺失11、5q14.3-q15 缺失12、6p25 缺失13 以及 6q 末端缺失综合征14,15,16,17,18,19 相关，提示其他致病基因广泛分布于全基因组中。然而，约 74% 的散发性 PNH 患者的遗传基础仍有待阐明17。
传统的基因定位方法（如阵列比较基因组杂交技术，array-CGH）已被证明是检测亚显微染色体异常的有力工具，然而，通过该方法鉴定出的基因组区域通常较大，且包含大量基因。
大规模并行测序技术的出现（即 全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）已显著降低了测序完整人类外显子组或基因组所需的成本和时间。然而，在大多数情况下，WES 和 WGS 数据的解读仍然具有挑战性，因为每位患者在数据过滤后通常会检出数十至数百个（甚至数千个，具体数量取决于分析类型）变异位点。
为了加快鉴定新型MCD致病基因的进程，我们设计了一种结合阵列比较基因组杂交（array-CGH）、全外显子组测序（WES）以及候选基因在体电穿孔（in utero electroporation, IUE）筛选的新型系统性策略。IUE技术可选择性地在啮齿类动物大脑中失活（或过表达）特定基因或突变，从而快速评估其在皮质形成中的作用18,19。当候选基因与疾病发生相关时，通过RNA干扰介导的基因敲低或过表达一个或多个候选基因，预期会在神经元迁移和/或成熟过程中引起局部缺陷。一旦鉴定出某个基因，其失活（或过表达）可在啮齿类动物中重现患者中观察到的表型，则该基因将成为在散发性MCD患者中进行筛查的重要候选基因。利用该方法，我们近期揭示了C6orf70基因（亦称为ERMARD）在携带6q27染色体缺失的患者中对PNH发病机制的关键作用16。

<table><tbody><tr><td>皮可喷射器 III</td><td>Parker Hannifin Corp</td><td>P/N 051-0500-900</td><td>细胞内显微注射分配系统</td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>快绿用于注射过程的可视化监测</td></tr><tr><td>BTX ECM 830 电穿孔仪</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td>ECM 830 是一种方波脉冲发生器，专为体外和体内应用设计</td></tr><tr><td>HM 650 V 切片机</td><td>Microm</td><td>10076838</td><td>HM 650 V 振动切片机，240V 50/60Hz，带振动刀片</td></tr><tr><td>FluoView 300</td><td>Olympus</td><td></td><td>Olympus FluoViewTM 300 是一种点扫描、点检测的共聚焦激光扫描显微镜，专为生物学研究应用设计</td></tr><tr><td>eCELLence 软件</td><td>Glance Vision Technologies</td><td></td><td>eCELLence 是专为细胞迁移定量分析设计的软件</td></tr><tr><td>安捷伦微阵列扫描仪套装</td><td></td><td></td><td>微阵列玻片</td></tr><tr><td>适用于 1 × 244K、2 × 105K、4 × 44K 或 8 × 15K</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G4900DA, G2565CA 或 G2565BA</td><td></td></tr><tr><td>适用于 1 × 1M、2 × 400K、4 × 180K 或 8 × 60K</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G4900DA 或 G2565CA</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢杂交室</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G2534A</td><td>用于阵列CGH杂交的腔室</td></tr><tr><td>杂交室垫圈玻片，5片装</td><td></td><td></td><td>用于阵列CGH杂交的垫圈</td></tr><tr><td>适用于1片装微阵列</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G2534-60003</td><td></td></tr><tr><td>适用于2片装微阵列</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G2534-60002</td><td></td></tr><tr><td>适用于4片装微阵列</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G2534-60011</td><td></td></tr><tr><td>适用于8片装微阵列</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G2534-60014</td><td></td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G2545A</td><td></td></tr><tr><td>安捷伦微阵列杂交室用杂交炉旋转器</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G2530-60029</td><td></td></tr><tr><td>带加热盖的热循环仪</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G8800A 或同等产品</td><td>用于孵育的热循环仪</td></tr><tr><td>1.5 mL 无RNase微量离心管</td><td>Ambion</td><td>p/n AM12400 或同等产品</td><td>微量离心管</td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Corning</td><td>p/n 401435 或同等产品</td><td>搅拌仪器</td></tr><tr><td>Qubit 荧光计</td><td>Life Technologies</td><td>p/n Q32857</td><td>用于DNA定量的仪器</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 定量检测试剂盒，用于Qubit荧光计</td><td>Invitrogen</td><td>p/n Q32850</td><td>Qubit荧光计配套试剂盒</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 8000 或 2000，或同等产品</td><td>用于DNA定量的仪器</td></tr><tr><td>P10、P20、P200 和 P1000 移液器</td><td>Pipetman 或同等产品</td><td></td><td>DNA分配</td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>p/n DNA120-115 或&lt;br/&gt; 同等产品</td><td>用于浓缩DNA的仪器</td></tr><tr><td>SureTag 完整DNA标记试剂盒</td><td>Agilent</td><td>p/n 5190-4240</td><td>DNA标记试剂盒（适用于人源样本）</td></tr><tr><td>纯化柱（50个单位）</td><td>Agilent</td><td>p/n 5190-3391</td><td>DNA标记试剂盒（适用于人源样本）</td></tr><tr><td>AutoScreen A，96孔板</td><td>GE Healthcare</td><td>p/n 25-9005-98</td><td>DNA标记试剂盒（适用于人源样本）</td></tr><tr><td>GenElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p/n NA1020</td><td>DNA标记试剂盒（适用于人源样本）</td></tr><tr><td>人基因组DNA</td><td></td><td>p/n G1521</td><td>DNA标记试剂盒（适用于人源样本）</td></tr><tr><td>用于CGH微阵列：</td><td>Promega</td><td>（女性）或 p/n G1471（男性）</td><td>阵列CGH对照DNA</td></tr><tr><td>用于CGH+SNP微阵列：</td><td>Coriell</td><td>p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, 或 NA18579</td><td>阵列CGH对照DNA</td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交洗涤缓冲液试剂盒 或</td><td>Agilent</td><td>p/n 5188-5226</td><td>阵列CGH杂交与洗涤</td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交洗涤缓冲液 1 和</td><td>Agilent</td><td>p/n 5188-5221</td><td>阵列CGH杂交与洗涤</td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交洗涤缓冲液 2</td><td>Agilent</td><td>p/n 5188-5222</td><td>阵列CGH杂交与洗涤</td></tr><tr><td>稳定与干燥溶液</td><td>Agilent</td><td>p/n 5185-5979</td><td>阵列CGH杂交与洗涤</td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交试剂盒</td><td>Agilent</td><td>p/n 5188-5220（25）或 p/n 5188-5380（100）</td><td>阵列CGH杂交与洗涤</td></tr><tr><td>人源Cot-1 DNA</td><td>Agilent</td><td>p/n 5190-3393</td><td>阵列CGH杂交与洗涤</td></tr><tr><td>安捷伦C扫描仪</td><td>Agilent</td><td></td><td>用于阵列CGH玻片的扫描仪</td></tr><tr><td>SureSelect XT2 试剂盒</td><td></td><td></td><td>靶向富集试剂盒</td></tr><tr><td>HiSeq 平台 (HSQ)，16 样本</td><td>Agilent</td><td>p/n G9621A</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 平台 (HSQ)，96 样本</td><td>Agilent</td><td>p/n G9621B</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 平台 (HSQ)，480 样本</td><td>Agilent</td><td>p/n G9621C</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 平台 (MSQ)，16 样本</td><td>Agilent</td><td>p/n G9622A</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 平台 (MSQ)，96 样本</td><td>Agilent</td><td>p/n G9622B</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 平台 (MSQ)，480 样本</td><td>Agilent</td><td>p/n G9622C</td><td></td></tr><tr><td>DNA 1000 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>p/n 5067-1504</td><td>用于分离、定长和定量25至1000 bp的双链DNA片段的试剂盒。</td></tr><tr><td>高灵敏度DNA试剂盒</td><td>Agilent</td><td>p/n 5067-4626</td><td>用于分析片段化DNA或DNA文库的试剂盒。</td></tr><tr><td>AMPure XP 试剂盒</td><td></td><td></td><td>用于自动化PCR纯化的试剂盒。</td></tr><tr><td>5 mL</td><td>Agencourt</td><td>p/n A63880</td><td></td></tr><tr><td>60 mL</td><td>Agencourt</td><td>p/n A63881</td><td></td></tr><tr><td>450 mL</td><td>Agencourt</td><td>p/n A63882</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1</td><td></td><td></td><td>生物素化核酸的分离与操作</td></tr><tr><td>2 mL</td><td>Life Technologies</td><td>Cat #65601</td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Life Technologies</td><td>Cat #65602</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR 定量检测试剂盒，用于Qubit荧光计</td><td></td><td></td><td>DNA定量</td></tr><tr><td>100次检测，2-1000 ng</td><td>Life Technologies</td><td>Cat #Q32850</td><td></td></tr><tr><td>500次检测，2-1000 ng</td><td>Life Technologies</td><td>Cat #Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>Life Technologies</td><td>p/n Q32856</td><td>DNA定量</td></tr><tr><td>SureSelect XT2 捕获文库</td><td>Agilent</td><td>根据实验而定</td><td>文库捕获试剂盒</td></tr><tr><td>SureCycler 8800 热循环仪</td><td>Agilent</td><td>p/n G8800A</td><td>DNA扩增</td></tr><tr><td>SureCycler 8800 热循环仪用96孔板模块</td><td>Agilent</td><td>p/n G8810A</td><td>DNA扩增</td></tr><tr><td>与SureCycler 8800兼容的96孔板</td><td>Agilent</td><td>p/n 410088</td><td>DNA扩增</td></tr><tr><td>光学条形盖</td><td>Agilent</td><td>p/n 410025</td><td>DNA扩增</td></tr><tr><td>拱形管条盖</td><td>Agilent</td><td>p/n 410096</td><td>DNA扩增</td></tr><tr><td>压缩垫</td><td>Agilent</td><td>p/n 410187</td><td>DNA扩增</td></tr><tr><td>2100 生物分析仪笔记本电脑套装</td><td>Agilent</td><td>p/n G2943CA</td><td>DNA扩增</td></tr><tr><td>2100 生物分析仪电泳套装</td><td>Agilent</td><td>p/n G2947CA</td><td>DNA扩增</td></tr><tr><td>Covaris 样品制备系统，E系列或S系列</td><td>Covaris</td><td></td><td>DNA剪切</td></tr><tr><td>Covaris 样品架</td><td></td><td>p/n 520078</td><td>DNA剪切</td></tr><tr><td>Nutator 板式混合器</td><td>BD Diagnostics</td><td>p/n 421105 或同等产品</td><td>板式混合器</td></tr><tr><td>GaIIx</td><td>Illumina</td><td></td><td>下一代测序仪</td></tr></tbody></table>

一种结合染色体微阵列比较基因组杂交、全外显子组测序的新型策略 子宫内 电穿孔法在啮齿类动物中鉴定脑部畸形的致病基因

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

涉及大脑皮层的出生缺陷，也称为皮层发育畸形（malformations of cortical development, MCD），是智力障碍的重要病因，占儿童期耐药性癫痫病例的20%–40%。高分辨率脑成像技术已促进了 体内 识别大量MCD表型。尽管脑成像、基因组分析和动物模型构建已取得进展，但仍缺乏一种系统性优先筛选候选基因并检测假定突变功能效应的直接工作流程。为解决这一问题，已开发并验证了一种可识别MCD新致病基因的实验策略。该策略基于通过array-CGH或全外显子组测序鉴定候选基因组区域或基因，并通过在发育中的啮齿类动物大脑中失活这些基因或过表达特定突变，来表征其功能影响 在子宫内 电穿孔。该方法促成了以下发现 C6orf70 基因，编码一种假定的囊泡蛋白，在室周结节状异位（一种由神经元迁移缺陷引起的脑皮质发育畸形）的发病机制中起作用。

用于鉴定新型MCD致病基因的实验策略如图1所示。
通过对155例伴有发育性脑异常的患者队列进行染色体微阵列比较基因组杂交（array-CGH）分析，这些患者的临床表型包括室管膜下异位神经元（PNH）（图2A）、胼胝体发育不良、脑室扩张、小脑发育不全以及多小脑回畸形，并伴有癫痫、共济失调和认知功能障碍，我们发现其中12例患者共享一个位于6q27区域、大小为1.2 Mb的最小重叠缺失区（图2B）21。该基因组区域包含4个已知基因（THBS2、PHF10、TCTE3 和 DLL1）以及2个预测基因（WDR27 和 C6orf70）（图2B）。
<p class="...

室管膜下结节状异位（PNH）是成年期最常见的皮质发育畸形（MCD）形式，但在大多数散发病例中，其遗传基础仍不明确。我们近期开发了一种策略，用于识别MCDs的新型候选基因，并直接验证其致病作用 体内.

涉及大脑皮层的出生缺陷——也称为皮层发育畸形（MCD）——是导致……的重要原因

本实验的总体目标是鉴定脑发育畸形疾病的新型候选基因，并在体内直接验证其致病作用。该策略有助于通过发现与脑发育及相关病理过程相关的分子通路，回答神经生物学领域的关键科学问题。该策略的主要优势在于，有助于发现与脑部疾病相关的新基因，并推动新型诊断工具的开发。利用该方法，我们能够揭示C6orf70基因在室管膜下结节性异位（一种由神经元迁移异常引起的脑部畸形）发病机制中的关键作用。本实验操作将由本实验室的工程师Fabienne Schaller进行演示。请按照书面实验方案以及机构和国家指南的要求，准备一只E15孕鼠用于实验操作。确保动物已正确麻醉，眼睛已涂抹眼用软膏，腹部已妥善剃毛并消毒。使用锋利的剪刀在尾侧腹部正中线的皮肤和肌肉上做一个2厘米长的垂直切口，小心地从腹腔中暴露一侧子宫角。滴加37°C预热的生理盐水溶液，以保持胚胎湿润。在整个操作过程中保持子宫湿润。注射DNA时，用一只手轻轻握住胚胎，使头部易于接触。然后，用另一只手小心地将连接至显微注射仪的玻璃毛细管插入侧脑室左侧，该位置位于中线外侧1毫米处，深度为2至3毫米。使用显微注射仪注入约一微升含有快绿的DNA，以便通过视觉监测注射过程。为将DNA电穿孔转入细胞，首先将生理盐水溶液滴加至3毫米×7毫米电极的表面，然后将正极置于注射侧，负极置于未注射的右心室。使用脚控踏板以950毫秒的间隔递送五个电脉冲。电穿孔后，将子宫角放回腹腔，并加入无菌生理盐水，以使胚胎更自然地定位，并补偿术中液体流失。用可吸收外科缝线缝合肌层，然后用间断缝合法缝合皮肤。根据机构指南提供长达48小时或指定时间的术后镇痛。将大鼠放回清洁的饲养笼中，并监测直至其从麻醉状态恢复。按照方案书面部分所述，用4%多聚甲醛固定脑组织后，用PBS洗涤10分钟。洗涤过程中，准备50毫升含4%琼脂的PBS溶液，确保溶解的琼脂糖温度不超过50摄氏度。将琼脂糖倒入塑料包埋模具中，然后将脑组织放入琼脂糖内。将包埋好的脑组织置于4摄氏度环境中，使琼脂糖聚合至少1小时。琼脂糖凝固后，将脑组织周围多余的琼脂糖切除，然后将脑组织粘附到振动切片机底板上，使脑的前-后轴垂直于刀片。等待数分钟使胶水干燥后，将粘有脑组织的底板放入振动切片机的切片腔中。用 PBS 填充切片腔，并开始切出厚度为 100 µm 的切片。切片后，将切片转移至显微镜载玻片并除去多余液体。随后滴加数滴封片介质，并在切片上放置盖玻片。室温避光静置过夜使其干燥。使用激光扫描共聚焦显微镜以 10 倍放大倍数对切片进行成像。为分析图像，首先使用适当的定量图像分析软件将图像转换为 8 位。然后选择一个具有代表性的 GFP 阳性荧光细胞，通过点击估算并使用手绘选择工具手动勾勒细胞边界，定义其形状。该软件会自动保留细胞的直径和强度阈值。单击“查找细胞”以使软件在整个皮层中定位转染的细胞。然后，如有需要，可手动去除假阳性结

a-novel-strategy-combining-array-cgh-whole-exome-sequencing-utero

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

一种新的结合阵列全息、全外测序和宫内电穿孔的方法来识别脑畸形的致病基因

寻找导致自闭症和精神分裂症等常见疾病的新生突变的分子遗传学策略。...

一种在自闭症和精神分裂症等常见疾病中鉴定新生突变的策略

高效基因递送至中枢神经系统多个区域 在子宫内 电穿孔

本文介绍了一种利用独特手术方法和特殊形状电极将基因转入发育中 小鼠大脑...

小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

本视频展示了利用子宫内电穿孔技术将质粒DNA递送至小鼠胚胎小脑神经元细胞的方法。该技术有助于理解基因在正常脑发育过程中的体内功能，以及神经元细胞在肿瘤进展过程中基因表达的变化。...

基于子宫内电穿孔的基因递送技术：向小鼠胚胎小脑细胞注射质粒DNA的方法

可通过在 E16 时期对大鼠的皮层或海马体进行子宫内电穿孔（IUE），在发育过程中操控基因，从而实现对成年动物神经元连接的快速且靶向的修饰，以用于后续的行为学或神经病理学研究。通过共转染的荧光素酶的生物发光，对 IUE...

通过局部转基因技术制备转基因大鼠 在子宫内 电穿孔和 在体 生物发光筛选

本方案描述了一种改进的器官块培养方法，涉及胚胎小鼠全脑半球的子宫外电穿孔、解剖与体外培养。ex utero...

Ex utero 电穿孔与全半球外植体：一种用于早期皮质发育研究的简单实验方法

本文介绍了一种用于研究海马发育过程中特定基因调控机制的实验方案。通过采用 子宫外...

Ex Utero 电穿孔与小鼠海马组织的器官型切片培养

传统的利用基因敲除动物进行的基因功能缺失研究通常成本高昂且耗时。基于电穿孔的CRISPR介导体细胞突变技术是研究基因功能的强大工具。...

使用CRISPR介导的功能缺失分析研究小脑颗粒细胞 子宫内 基于电穿孔的基因转移

星形胶质细胞在大脑皮层中均匀分布，这使得在细胞水平上分析其复杂形态具有挑战性。本方案采用基于子宫内电穿孔的多色标记方法，以标记单个皮层星形胶质细胞，并结合用户友好的图像分析流程，对其体积和形态进行分析。...

子宫内电穿孔法将多靶点基因组整合彩色（MAGIC）标记递送至个体小鼠皮层星形胶质细胞

新近发现的疾病相关基因在神经精神障碍发病机制中的作用仍不明确。一种改良的双侧子宫内电穿孔技术可实现将基因转入大量神经元群体中，并可用于研究基因表达变化对社交行为的因果影响。...

利用双侧子宫内电穿孔技术研究基因对啮齿类动物行为影响的实验流程

了解一种结合阵列CGH、全外显子测序和宫内电穿孔的新策略，用于识别脑畸形致病基因并在体内验证其功能。该方法有助于发现与脑发育障碍相关的新基因并开发诊断工具。

一种结合染色体微阵列比较基因组杂交、全外显子组测序的新型策略子宫内电穿孔法在啮齿类动物中鉴定脑部畸形的致病基因

探索更多视频

一种结合染色体微阵列比较基因组杂交、全外显子组测序的新型策略 子宫内 电穿孔法在啮齿类动物中鉴定脑部畸形的致病基因

探索更多视频

一种结合染色体微阵列比较基因组杂交、全外显子组测序的新型策略子宫内电穿孔法在啮齿类动物中鉴定脑部畸形的致病基因