利用双光子显微镜的艾滋病毒引起的神经炎症的小鼠模型脑血管结构的量化
January 12th, 2016
本文描述了一种可以使用体内和离体双光子显微镜量化大脑血管结构的方法。
该程序的总体目标是量化长时间暴露于 HIV 病毒毒素 tat 后皮质毛细血管网络的变化。该方法可以帮助检查皮质毛细血管形态的关键变化，这些变化可能有助于 HIV 相关神经认知障碍的发病机制。该技术的主要优点是它允许对多个毛细管形态参数进行生理准确定量。
尽管这种方法可以深入了解 HIV 相关神经认知障碍的发病机制。它也可以应用于其他发生血管变化的疾病，例如阿尔茨海默病。通过将人工泪液凝胶涂抹在麻醉小鼠的眼睛上来开始此过程。
接下来，用电动剃须刀剃头。然后，使用聚维酮碘溶液对头皮进行消毒，并让其干燥。在光学显微镜下，去除动物的头皮，以完全暴露顶骨、尾额骨和前囟点。
将少量 10% 的氯化铁溶液涂抹在颅骨上，以干燥膜以便于去除。随后，用镊子轻轻刮擦颅骨，去除干燥的膜。然后，在头板窗口周围涂上一层薄薄的胶水。
轻轻地将头板压在鼠标的头骨上，使感兴趣区域保持在窗口的中心。然后，在头板上滴一滴牙科水泥，使胶水聚合。接下来，沿着头板窗口的边缘涂上一层薄薄的胶水，以创建一个储液罐来容纳盐水。
胶水干燥后，将头板拧入鼠标头板线束中。使用连接到微型鱼环钻的钻头去除头板窗口上的所有胶水，转速设置为 6， 000 rpm。每 10 到 15 秒停止一次，以防止小鼠颅骨过热。
之后，使用新的钻头，开始使用 4， 000 rpm 的微型 torp 钻头组减薄头骨。轻轻地将钻头穿过颅骨，不要直接向下压力。一旦头骨完全变薄，将鼠标从支架上拆下并放在它的背上。
轻轻地用胶带固定双后肢，以清楚地露出大腿内侧。然后去除两个大腿内侧的毛发，并用聚维酮碘覆盖大腿对手术部位进行消毒。接下来，轻轻去除右大腿内侧、股静脉和动脉上方的皮肤。
将大约 3 到 5 滴 0.9% 盐水滴在手术部位。然后，通过钝剖开股骨神经血管束，将股静脉与动脉分开。现在，将两根 3 厘米的手术缝合线放在股动脉下方，相距约 1 厘米。
顺时针旋转上缝合线以形成血管止血带，有助于防止导管插入术期间失血过多。随后，使用弹簧剪刀在股动脉上做一个小切口，稍后插入导管以监测小鼠的生理参数。在此过程中，去除小鼠左大腿内侧的皮肤。
接下来，找到股静脉。使用 1 毫升注射器和 30 号针头，吸取 130 微升荧光染料溶液。将 100 微升染料缓慢注入股静脉。
取出针头后，对注射部位施加稳定、轻柔的压力以止血，并让染料循环 5 分钟。然后，用缝合线闭合手术部位。小心地将鼠标翻转到它的腹部，然后将其放入鼠标头板安全带中。
对于体内双光子成像，将手术器械移至双光子显微镜，并确保保持动物的麻醉水平。接下来，将少量 0.9% 盐水放入头板储液器中并降低显微镜物镜，使其与盐水接触。然后，使用明场观察物镜定位感兴趣区域。
之后，开始双光子成像。在视图屏幕上找到毛细管床，并使用光学变焦放大该区域。使用两个光子成像软件获取毛细血管的图像。
对于离体双光子成像，在头皮上从顶骨到被斩首的小鼠的额骨做一个切口。用食指和拇指将皮肤固定在颅骨两侧，将超细剪刀放在内侧顶骨下方，然后沿着矢状缝合线剪断颅骨，直到前囟点后约 3 毫米。然后，将颅骨与大脑分开，并用镊子小心地从大脑表面去除任何脑膜。
轻轻地将镊子滑到大脑下方，将其从颅骨中释放出来。之后，将大脑置于小鼠专用的脑基质中，并用 ACSF 滴剂洗涤。接下来，去除一毫米厚的冠状脑切片。
将脑切片放在含有 ACSF 的凹形载玻片上，切片的最前部朝上。然后用玻璃盖玻片轻轻盖住脑切片。将载玻片转移到显微镜载物台上，并在盖玻片上放置少量 0.9% 盐水。
降低显微镜物镜，直到它与盐水接触。随后，使用明场物镜定位大脑的中线。现在，开始双光子成像，并使用 25 倍物镜再次定位中线。
通过在冠状切片的皮质表面寻找纵向裂隙来实现这一点。然后，将成像屏幕的右边缘放在中线上，并在三个完整的帧上横向移动查看器屏幕。找到毛细管在视图屏幕上几乎不可见的深度。
然后，将焦平面再降低 20 微米，以确定 z 堆栈的顶部。将图像厚度设置为 1 微米。将视屏降低 100 微米，并调整整个激光功率，使不超过 1% 的像素过度饱和。
最后，获取 z 堆栈。在此图中，准备好脑切片后，位于距中线约 1.5 毫米处的成像区域。100 微米的 z 堆栈可生成用于 Amira 分析软件分析的三维图像。
然后，通过在毛细管的开头和结尾或一个毛细管分支到另一个毛细管的任何位置放置节点来手动追踪毛细管网络。这将生成一个完全骨架化的图像，从中自动提取形态参数。毛细血管节点的数量、节段、平均节段长度和总节段长度可以使用小鼠脑切片的双光子离体成像来提取。
在这里，通过体内成像产生毛细管网络的二维图像，其中可以提取毛细管直径，并且可以使用从离体成像获得的毛细管直径和总段长度计算总毛细管体积。一旦掌握，如果执行得当，这个过程可以在三个半小时内完成。在执行此程序时，在保持稳定麻醉水平的同时快速移动很重要，因为异氟醚会导致皮质毛细血管舒张，从而使数据歪曲。
在此过程中，可能会获得其他毛细血管参数，例如红细胞速度或红细胞通量，这可以更深入地了解在 HIV 相关神经认知障碍和其他神经退行性疾病中观察到的致病性变化。祝你的实验好运。
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概述
本文描述了一种通过体内和体外双光子显微镜来量化大脑血管结构的方法。此过程的总体目标是量化长时间暴露于HIV毒素tat后皮质毛细血管网络的变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 血管生物学
- 神经认知障碍
背景
- 该方法有助于检查皮质毛细血管形态的关键变化。
- 它可能有助于HIV相关神经认知障碍的发病机制。
- 该技术允许对多个毛细血管形态参数进行生理上准确的量化。
- 它也可以应用于其他有血管变化的疾病，如阿尔茨海默病。
研究目的
- 量化皮质毛细血管网络的变化。
- 调查HIV毒素tat对毛细血管形态的影响。
- 提供有关HIV相关神经认知障碍发病机制的见解。
使用的方法
- 体内和体外双光子显微镜。
- 对麻醉小鼠的眼睛涂抹人工泪液凝胶。
- 量化毛细血管形态参数。
- 分析皮质毛细血管网络。
主要结果
- 实现了对毛细血管参数的生理上准确的量化。
- 在暴露于HIV毒素后观察到毛细血管形态的显著变化。
- 该方法提供了与神经认知障碍相关的血管变化的见解。
- 注意到该方法可能适用于其他疾病。
结论
- 该方法对研究大脑血管结构有效。
- 它可以增强对HIV相关神经认知障碍的理解。
- 未来的应用可能扩展到其他神经退行性疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying cerebral vascular architecture provides mechanistic insights into neuroinflammatory disease models, supporting target validation in CNS drug discovery. This method enables preclinical assessment of vascular changes that may contribute to cognitive dysfunction, informing go/no-go decisions in neurodegenerative disease portfolios. By delivering physiologically accurate capillary morphometrics, it enhances predictive confidence in early-stage target de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses linking neuroinflammation to vascular rarefaction in HIV-associated neurocognitive disorders.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantification of capillary density, segment length, and network complexity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying vascular-mediated mechanisms of cognitive decline.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline vascular phenotypes.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs including capillary node count, mean segment length, and total vascular length.
- Scalability: Enables platform reuse across disease models such as Alzheimer’s where vascular pathology is implicated.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through direct measurement of cortical capillary alterations in a transgenic mouse model of HIV-1 Tat expression.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical validation via consistent morphological readouts.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying vascular de-risking parameters.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for CNS-targeted therapeutics where vascular integrity is a mechanistic modifier.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neurovascular unit dysfunction and pathway clarification in neuroinflammatory models.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized z-stack acquisition and automated morphological parameter extraction.
- Analytics: Provides quantitative readouts such as capillary diameter, red blood cell flux, and volumetric flow for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via biomarker-aligned vascular metrics that predict cognitive outcomes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across neurodegenerative disease programs with vascular comorbidity.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence through mechanistic de-risking of vascular contributions to neurodegeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across in vivo and ex vivo imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk from unanticipated vascular toxicity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular phenotype modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neurosurgical preparation, two-photon microscopy, and intravascular dye injection.
- Depends on two-photon laser scanning microscopes, head plate harnesses, and image analysis software such as Amira.
- Necessitates cross-team standardization between surgery, imaging, and analysis teams for consistent z-stack acquisition.
- Involves adaptation considerations when translating from mouse models to human-relevant vascular scaling.
- Limited by the technical skill required to maintain stable anesthesia without inducing vasoconstriction or vasodilation artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Preparation of the Thin-skull Cranial Window
2:41
Monitoring of Physiological Parameters
4:02
Injection of the Fluorescent Dye
4:54
In Vivo Two-Photon Imaging
5:42
Ex Vivo Two Photon Imaging
8:04
Results: Generation of Skeletonized Capillary Networks
9:17
Conclusion
