生物印刷细胞化构造使用组织特异性水凝胶生物油墨
2016年4月21日
我们描述一组一起提供组织模仿水凝胶生物油墨与官能的和可行的3-D组织构建可bioprinted在体外筛选应用中使用的协议。
该协议的总体目标是展示一种设计可通过生物打印设备挤出的水凝胶生物墨水的通用方法。然后，生物墨水可用于制造三维组织结构。这种方法可以帮助回答生物打印领域的关键问题，例如如何控制所需的机械性能，以提供可以使用生物打印机挤出的材料。
这种技术的主要优点是我们使用市售组件以模块化方式组合，以创建简单有效的生物打印水凝胶生物墨水。这些技术的应用包括创建 3D 组织类器官，可用于准确模拟药物、毒素和疾病的影响。虽然这种方法可以提供生物打印 3D 肝脏构建体的框架，但它也可以应用于其他组织类型，例如肌肉、肺和结肠。
一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为有许多不同的试剂用于制造水凝胶生物墨水，但实际上非常简单。演示该程序的是我们团队的博士后 Young-Joon Seol。首先，准备组织特异性细胞外基质消化物，用于水凝胶制剂，如其他地方所述。
然后，将光引发剂以 0.1% 的重量比溶解在水中要形成水凝胶生物墨水，首先将透明质酸水凝胶试剂盒中的基材成分溶解成水光引发剂溶液的单独等分试样。然后，按此处显示的比例混合 ECM 溶液、2% 硫醇化透明质酸、2% 硫醇化明胶、交联剂和肝细胞培养基。为了改善生物墨水的挤出性能，请在混合物中加入每毫升 1.5 毫克未改性的透明质酸和每毫升 30 毫克明胶。
然后，在使用前将所得混合物高速涡旋 10 秒。在生物打印设备中测试生物墨水之前，首先在实验室工作台上测试挤出特性。使用标准注射器，滴下生物墨水样品，然后将 20 至 30 号针头连接到注射器上。
让生物墨水交联，然后将生物墨水推入针头以获得平滑挤出的水凝胶丝。如果配方能够产生很少或没有凸起的细丝，那么它就可以进行生物打印了。要将生物墨水制剂加载到生物打印机中，请将生物墨水移液到消毒的打印机墨盒中。
在挤出前让它们静置 30 分钟，因为生物墨水将在墨盒内发生自发的第一阶段交联。接下来，将墨盒装入打印装置中，并将气动压力源连接到墨盒。准备一个简单的图案，比如这个 7 x 7 毫米的平行线网格，进行打印，以评估其挤出兼容性。
当打印头以每分钟约 300 毫米的速度在 XY 平面中移动时，对墨盒施加 20 千帕的压力以挤出生物墨水。如果挤出的材料是块状或不规则的，请减少添加的交联剂的量，以软化第一阶段交联材料。正确制备的生物墨水配方应平滑挤出，可实现精确的沉积和结构。
如随附文本方案中所述，使用悬滴法在 96 孔板中制备 3D 原代细胞肝球体。培养三天后，使用移液管从悬挂滴板中收集肝球，并将它们转移到无菌的 15 毫升锥形管中。让球体沉降到锥形管底部 1 到 2 分钟。
然后，用移液管小心吸出培养基。将新鲜制备的水凝胶生物墨水溶液的所需打印 3D 构建体积的 110% 至 125% 转移到含有球状体的锥形管中。然后，小心地上下移液球体，将它们重新悬浮在水凝胶生物墨水溶液中。
均匀悬浮后，使用移液管将球状体溶液转移到生物打印机墨盒中，并让溶液进行第一个交联阶段 30 分钟。在交联阶段之后，使用生物打印装置创建包含初级肝球体的所需水凝胶结构。每层沉积后，将打印的生物墨水暴露在紫外线下 2 到 4 秒，以启动二次交联机制。
这将稳定结构并将刚度提高到所需的水平。溶液中 PEG 炔烃的浓度控制着整体交联密度，因此主要控制最终结构的刚度。生物打印后，使用共聚焦显微镜观察到肝脏构建体中的高细胞活力。
在最佳环境条件下，活力应高于 85%此外，当对构建体进行指示肝组织的标志物染色时，观察到 CYP3A4、一种细胞色素 P450 亚型、细胞内白蛋白、E-钙粘蛋白、一种上皮细胞间粘附蛋白和 DPP4（一种在肝脏中高度表达的蛋白质）的阳性表达。当测试培养基中的尿素和白蛋白水平时，发现该构建体在 14 天的时间过程中以恒定水平分泌尿素和白蛋白。这进一步表明，组织特异性水凝胶生物墨水有助于维持肝细胞的功能。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以从头到尾大约两个小时完成。然而，这通常取决于所采用的特定生物打印设备。在尝试此程序时，重要的是要记住，演示的步骤通常必须经过调整以与其他组织类型或生物打印设备兼容。
按照此程序，可以创建其他水凝胶生物墨水配方，以支持其他组织类型的生物打印。这些技术的发展为创建用于药物筛选和疾病建模的多类器官、体内芯片平台铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何开始使用多步交联设计可用于生物打印 3D 组织结构的材料有很好的了解。
不要忘记，在紫外线下工作可能对一个人的视力极为危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用紫外线防护镜。
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概述
本文介绍了创建模拟组织的水凝胶生物墨水的协议，实现了体外应用的功能性3D组织构建体的生物打印。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物打印
- 组织工程
- 水凝胶开发
背景
- 水凝胶生物墨水对3D生物打印至关重要。
- 控制机械性质对于挤出过程至关重要。
- 市场上可用的组件可以模块化组合。
- 应用包括药物测试和疾病建模。
研究目的
- 展示设计水凝胶生物墨水的通用方法。
- 制造用于研究应用的3D组织构建体。
- 探索生物打印所需的机械性质。
使用的方法
- 开发模拟组织的水凝胶生物墨水。
- 通过生物打印设备进行挤出。
- 制造3D组织类器官。
- 模块化组合组件以创建生物墨水。
主要结果
- 成功生物打印功能性3D组织构建体。
- 展示了对生物墨水机械性质的控制。
- 适用于各种组织类型的应用潜力，包括肝脏、肌肉、肺和结肠。
- 为未来的生物打印研究建立了框架。
结论
- 开发的水凝胶生物墨水适用于生物打印。
- 该方法可以推进组织工程研究。
- 准确模拟药物效果和疾病机制的潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Bioprinting functional 3D tissue constructs enables physiologically relevant in vitro models for drug screening and toxicology assessment. The described hydrogel bioink system provides tissue-specific biochemical cues and tunable mechanical properties, supporting predictive modeling of human tissue responses. This approach addresses a key bottleneck in preclinical development by improving the translational fidelity of organoid-based assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in liver-specific microenvironments with measurable functional outputs like albumin and urea secretion.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining primary hepatocyte viability and phenotype over extended culture periods.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, extrudable bioinks with quantifiable shear stiffness (100 Pa to 20 kPa) for reproducible construct fabrication.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through modular, commercially available components that simplify formulation and reduce batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates tissue-specific functionality via CYP3A4, E-cadherin, and DPP4 expression, aligning with human liver biology.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through sustained secretory output (urea, albumin) over 14 days, indicating stable metabolic function.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports early discovery workflows by generating disease-relevant liver organoids that bridge target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by enabling controlled evaluation of compound effects in a physiologically contextualized system.
- Screening: Delivers quantitative, functional readouts (albumin, urea) that support compound prioritization and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides measurable biochemical and structural outputs that allow cross-condition comparison and assay standardization.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery to preclinical validation by preserving key hepatic markers and functions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable hydrogel framework adaptable to multiple tissue types, reducing redundant bioink development efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through tissue-specific biochemical signaling and functional readouts that reflect in vivo-like behavior.
- Operational Value: Standardization and scalability via a two-stage crosslinking protocol compatible with common bioprinting platforms.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false negatives in toxicity screening through enhanced model fidelity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on mechanistic data from human-relevant organoid systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel formulation, bioprinting device operation, and primary cell handling.
- Dependent on access to bioprinters with pneumatic extrusion and UV crosslinking capabilities.
- Necessitates standardization of ECM digest preparation and crosslinking ratios across teams.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to non-liver tissue types such as muscle or lung.
- Limited by the need for sterile technique and UV safety protocols during secondary crosslinking.
