使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

本实验方案的总体目标是展示一种多功能方法，用于设计可通过生物打印设备挤出的水凝胶生物墨水。这些生物墨水随后可用于制造三维组织结构。该方法有助于解决生物打印领域中的关键问题，例如如何调控所需的机械性能，以提供一种能够使用生物打印机进行挤出的材料。

该技术的主要优势在于，我们采用市售组分以模块化方式组合，制备出一种简单且高效的可生物打印水凝胶生物墨水。这些技术的应用包括创建三维组织类器官，可用于精确模拟药物、毒素及疾病的作用效果。尽管该方法可为生物打印三维肝组织构建提供框架，但也同样适用于其他组织类型，如肌肉、肺和结肠组织。

通常，初次接触该方法的人员可能会遇到困难，因为制备水凝胶生物墨水需要用到多种不同的试剂，但实际上该过程相当直接。本实验操作将由本团队的博士后 Young-Joon Seol 进行示范。首先，按照其他部分所述方法，制备可用于水凝胶配方中的组织特异性细胞外基质消化液。

然后，将光引发剂以0.1%的重量体积比溶解于水中。为制备水凝胶生物墨水，首先将透明质酸水凝胶试剂盒中的基础材料组分分别溶解于上述含光引发剂的水溶液中。接着，按照此处所示比例，将细胞外基质溶液、2%巯基化透明质酸、2%巯基化明胶、交联剂以及肝细胞培养基混合。为改善生物墨水的挤出性能，向混合物中加入1.5毫克/毫升未修饰的透明质酸和30毫克/毫升明胶。

然后，在使用前将所得混合物在高速下涡旋震荡十秒钟。在将生物墨水用于生物打印设备之前，首先在实验台上测试其挤出特性。使用标准注射器，取少量生物墨水样品，然后在注射器上安装一根20至30号的针头。

让生物墨水交联，然后通过针头推出生物墨水，以获得平滑挤出的水凝胶丝。如果该配方能够形成少凸起或无凸起的丝状结构，则可进行生物打印。将生物墨水装入生物打印机时，用移液器将生物墨水转移至已灭菌的打印机 cartridge 中。

让其静置30分钟后再进行挤出，因为生物墨水将在 cartridge 内自发进行第一阶段交联。接下来，将 cartridge 装入打印装置，并将气动压力源连接至 cartridge。准备一个简单的打印图案，例如此7 mm × 7 mm的平行线网格，用于评估其挤出兼容性。

当打印头在 XY 平面以约 300 毫米/分钟的速度移动时，对 cartridge 施加 20 千帕的压力以挤出生物墨水。如果挤出材料呈块状或不规则，应减少添加的交联剂用量，以软化第一阶段交联的材料。配制得当的生物墨水应能平稳挤出，实现精确沉积和结构成型。

采用随附文本方案中所述的悬滴法，在96孔板中制备三维原代肝细胞球。培养三天后，使用移液器从悬滴板中收集肝细胞球，并转移至无菌的15毫升锥形管中。静置1至2分钟，使细胞球沉降至锥形管底部。

然后，用移液器小心吸除培养基。将新鲜配制的水凝胶生物墨水溶液转移至含有类球体的锥形管中，转移体积为所需打印的3D结构体积的110%至125%。随后，轻轻吹打类球体，使其在水凝胶生物墨水溶液中重新悬浮。

待类球体溶液均匀悬浮后，使用移液器将其转移至生物打印 cartridge 中，并使溶液经历第一阶段交联，持续 30 分钟。完成第一阶段交联后，利用生物打印设备制备含有原代肝类球体的目标水凝胶结构。每沉积一层后，将打印出的生物墨暴露于紫外光下照射 2 至 4 秒，以启动第二阶段交联反应。

这将稳定构建物并使刚度达到所需水平。溶液中 PEG 炔烃的浓度控制着整体交联密度，因而主要决定了最终构建物的刚度。生物打印后，通过共聚焦显微镜观察到肝构建物中细胞存活率较高。

在最佳环境条件下，细胞活力应高于 85%。此外，对类肝组织构建物进行肝组织标志物染色时，观察到细胞色素 P450 同工酶 CYP3A4、细胞内白蛋白、上皮细胞间黏附蛋白 E-cadherin 以及在肝脏中高表达的蛋白 DPP4 均呈阳性表达。对培养基中尿素和白蛋白水平的检测结果显示，在 14 天的实验周期内，该构建物持续稳定地分泌尿素和白蛋白。这进一步表明，组织特异性水凝胶生物墨水有助于维持肝细胞的功能。

熟练掌握后，若操作得当，整个技术流程从开始到结束大约可在两小时内完成。然而，这通常取决于所使用的特定生物打印设备。在实施该操作时，需注意所演示的步骤往往需要根据其他组织类型或生物打印设备进行相应调整。

通过此操作流程，可开发其他水凝胶生物墨水配方，以支持其他组织类型的生物打印。这些技术的发展为构建多类器官“芯片上器官”平台奠定了基础，可用于药物筛选和疾病建模。观看本视频后，您应能够充分理解如何着手设计可用于通过多步交联进行3D组织构建物生物打印的材料。

请注意，使用紫外光可能对视力造成极大危害，因此在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴紫外防护眼镜。