Name: 生物印刷细胞化构造使用组织特异性水凝胶生物油墨 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 了解如何使用模块化水凝胶生物油墨进行生物印刷，构建功能性三维组织结构。该方法利用多步交联技术控制机械性能，适用于肝脏、肌肉等多种组织类型的体外药物筛选与疾病建模研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢美国国防威胁降低局（DTRA）通过空间与海战系统中心太平洋分部（SSC PACIFIC）合同编号N6601-13-C-2027提供的资助。本材料的发表并不代表政府批准 herein的发现或结论。

1. 水凝胶生物墨水的配方与制备
<ol>
	<li>为了提供组织特异性的生化谱型，按照先前描述的肝脏方法制备组织特异性的细胞外基质（ECM）消化液。20 
	注意：通常，该ECM消化液将占最终水凝胶生物墨水体积的40%。可制备数百毫升ECM消化液，分装后于-80 °C冷冻保存，以备将来使用。</li>
	<li>在配制水凝胶之前，将光引发剂2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮以0.1% w/v的浓度溶于水中。 
	注意：可预先配制50–100 ml体积的溶液，避光保存于4 °C，可稳定数月。</li>
	<li>为形成水凝胶生物墨水，首先将透明质酸（HA）水凝胶试剂盒中的基础材料组分溶解于水-光引发剂溶液中。
	<ol>
		<li>将巯基化HA和巯基化明胶分别溶于水-光引发剂溶液（步骤1.2）中，配制成2% w/v的溶液。</li>
		<li>将水凝胶试剂盒中的交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）溶于水-光引发剂溶液（步骤1.2）中，配制成8% w/v的溶液。</li>
		<li>将八臂聚乙二醇炔烃（PEG 8-Arm alkyne，分子量10 kDa）溶于水-光引发剂溶液（步骤1.2）中，配制成8% w/v的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通常按照以下方案制备水凝胶，但也可根据需要进行额外定制。
	<ol>
		<li>将4份2%巯基化HA、4份2%巯基化明胶、1份交联剂1、1份交联剂2与8份组织ECM溶液及2份肝细胞培养基（HCM）混合（或以10份水替代，制备通用的非组织特异性水凝胶）。 
		注意：可添加额外的未修饰HA或明胶，以使生物墨水更顺畅地挤出。下文将对此进行说明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用前，将所得混合物在高速（10级中的第10级）涡旋振荡10秒以充分混匀。</li>
	<li>水凝胶生物墨水的使用
	<ol>
		<li>用于挤出或生物打印测试时，将混合物转移至注射器或打印机墨盒中，在37 °C下静置30分钟使其自发交联（第一阶段交联）。</li>
		<li>用于流变学测量时，将混合物转移至35 mm培养皿中，静置30分钟进行交联。 
		注意：混合物会立即开始通过巯基-丙烯酸酯键的形成发生交联，并逐渐增加黏度。应在混合后10分钟内将混合物转移至注射器、打印墨盒或目标位置，以避免在转移过程中发生移液器或注射器堵塞。</li>
		<li>当需要进行二次交联（第二阶段）时，使用紫外光（365 nm，18 W/cm2）照射第一阶段已交联的凝胶，以引发巯基-炔烃聚合反应。 
		注意：照射时间取决于材料的表面积。通常，在此紫外光强度下，每平方厘米材料仅需照射1–2秒即可。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 打印机兼容性测试
<ol>
	<li>在与生物打印设备进行整合测试之前，先在实验台上使用标准注射器和细规格针头（20–30 G）进行简单的挤出测试，以评估挤出特性。
	<ol>
		<li>通过标准注射器挤出生物墨水，以获得表面光滑、无明显凸起或极少凸起的水凝胶细丝。挤出线条或简单图案即可判断操作是否成功。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将生物墨水通过移液方式装入打印机墨盒中以实现生物打印机的整合，并静置30分钟，使生物墨水在墨盒内自发完成第一阶段交联。 
	注意：生物墨水的用量取决于具体应用，应由使用者自行确定。打印机 cartridge 可能类似于或为与生物打印机设备兼容的注射器。</li>
	<li>通过使用生物墨水打印简单图案来评估其在生物打印中的挤出兼容性。例如，打印一个由平行线组成的7 x 7 mm图案。施加压力（例如， 20 kPa气动压力），同时打印头在X-Y平面以约300 mm/min的速度移动。 
	注意：可使用不同尺寸的喷头喷嘴，但使用喷嘴开口直径为 400–500 µm 的锥形喷嘴最适合打印直径在 250–350 µm 范围内的球状体。
	<ol>
		<li>如果挤出的材料呈块状或不规则，参见步骤2.4，或减少PEGDA用量以软化第一阶段交联的材料。配制得当的生物墨水可平稳挤出，实现精确沉积，形成预期的图案或结构。 
		注意：所述的生物打印程序使用一种自行设计和定制的3-D生物打印机，专用于组织构建物的打印。32 因此，每种设备的打印参数差异显著，需由用户自行测试确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为改善挤出性能，向生物墨水中添加未修饰的HA和明胶（浓度分别为1.5 mg/ml和30 mg/ml）。</li>
</ol>
3. 利用原代肝构建物进行生物打印验证
<ol>
	<li>采用悬滴法准备三维原代肝细胞球体作为细胞组分33 
	注意：生物打印也可不使用球体，而是直接将单个细胞悬浮于水凝胶生物墨水中进行。此处采用球体以加速细胞间相互作用并促进结构功能的形成。所用球体或细胞的数量取决于具体应用，应由使用者自行确定。这些步骤应在无菌条件下使用无菌耗材进行。
	<ol>
		<li>通过将肝细胞培养基（HCM）补充剂组件试剂盒中的解冻组分加入肝细胞基础培养基（HBM）中并进行无菌过滤，制备HCM。
		<ol>
			<li>将补充剂组分解冻至液态。</li>
			<li>将补充剂组分（抗坏血酸 0.5 ml；牛血清白蛋白 [无脂肪酸] 10 ml；庆大霉素硫酸盐/两性霉素B 0.5 ml；氢化可的松21-半琥珀酸酯 0.5 ml；胰岛素 0.5 ml；人重组表皮生长因子 0.5 ml；转铁蛋白 0.5 ml）加入500 ml HBM中。</li>
			<li>使用瓶顶滤器或注射器滤头，经0.45 μm或0.22 μm滤膜进行无菌过滤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据制造商说明书解冻原代人肝细胞、库普弗细胞和星状细胞后，使用血细胞计数板对各类型细胞的密度进行计数。</li>
		<li>在锥形管中，将原代人肝细胞、库普弗细胞和星状细胞按细胞数量80:10:10的比例混合于已预热至37 °C的HCM培养基中。 
		注意：所用培养基体积取决于具体应用中的总细胞数，应由使用者自行确定。</li>
		<li>将细胞悬液在20 °C下以520 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸除上清液，保留细胞沉淀。</li>
		<li>用HCM培养基重悬细胞沉淀，制备成每40 µl培养基含1,000个细胞的细胞悬液。总体积取决于拟生成的球体数量。</li>
		<li>将细胞悬液转移至96孔悬滴培养板中。每孔加入约1,000个细胞的悬液，置于37 °C、5% CO2条件下培养3天，期间形成多细胞球体。</li>
		<li>使用移液器从悬滴板中收集肝球体，并转移至无菌15 ml锥形管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在肝脏特异性水凝胶生物墨水中进行肝球体生物打印
	<ol>
		<li>按照步骤1所述方法，配制含肝脏细胞外基质（ECM）的水凝胶生物墨水，使用8% PEGDA和8% 8-臂PEG炔作为交联剂。选用该组合因其可形成剪切弹性模量接近天然肝组织的水凝胶。</li>
		<li>让步骤3.1.7中置于锥形管内的球体自然沉降至管底。沉降时间因球体大小和密度而异，通常在1–2分钟内完成。小心吸除或用移液器去除全部培养基。</li>
		<li>将新配制的水凝胶生物墨水按所需体积转移至含有球体的锥形管中。通常，体积应比拟打印的三维结构体积大10%–25%。轻柔吹打混匀，使球体均匀重悬于水凝胶生物墨水中。使用移液器或血清移液管转移至生物打印机卡匣中。</li>
		<li>在生物打印机卡匣内，使溶液在30分钟内完成第一阶段交联（巯基-丙烯酸酯反应）。 
		注意：根据球体大小，可能需要缓慢旋转卡匣或使用无菌刮刀轻轻搅拌内容物，以确保在第一阶段交联过程中球体在整个生物墨水中均匀分布。若使用悬浮细胞而非球体制备生物墨水，则此操作必要性较低。 
		注意：第一阶段交联完成后，用户有数小时的操作窗口期。但建议尽快完成生物打印过程，以提高细胞存活率。</li>
		<li>完成第一阶段交联后，使用生物打印设备构建含有原代肝球体（或其他细胞）的目标水凝胶结构。 
		注意：该技术可支持多种结构的生物制造。总体积、细胞或球体数量、打印结构几何形状以及构建体所打印的基底等参数高度依赖于使用者的研究目标。</li>
		<li>将材料沉积至目标构型后，施加紫外光照射2–4秒，以启动第二阶段交联机制，稳定构建体并将其刚度提升至目标水平。 
		注意：PEG-炔的浓度决定了最终交联密度，从而主要控制构建体的最终刚度。</li>
		<li>重复步骤3.2.4和3.2.5，以构建多层结构。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Visconti, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+organ+printing%3A+engineering+an+intra-organ+branched+vascular+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree.</a> Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+and+prototyping+of+tissues+and+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing and prototyping of tissues and scaffolds.</a> Science. 338, 921-926 (2012).</li>
<li>Fedorovich, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrices+for+skeletal+tissue+engineering%3A+state-of-the-art+and+novel+application+in+organ+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing.</a> Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).</li>
<li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).</li>
<li>Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+organ+printing+2%3A+fusion+of+cell+aggregates+in+three-dimensional+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+A+Discov+Mol+Cell+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels.</a> Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMironov%2C+V+%22Regen+Med%22">Regen Med</a>. 3, 93-103 (2008).</li>
<li>Skardal, A., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+integration+with+3-d+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for integration with 3-d bioprinting.</a> Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).</li>
<li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li>
<li>Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+vessel-like+constructs+using+hyaluronan+hydrogels+crosslinked+with+tetrahedral+polyethylene+glycol+tetracrylates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates.</a> Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).</li>
<li>Bertassoni, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-write+bioprinting+of+cell-laden+methacrylated+gelatin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels.</a> Biofabrication. 6, 024105(2014).</li>
<li>Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamically+crosslinked+gold+nanoparticle+-+hyaluronan+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels.</a> Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinkable+hyaluronan-gelatin+hydrogels+for+two-step+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinted+amniotic+fluid-derived+stem+cells+accelerate+healing+of+large+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+printing+of+mechanically+and+biologically+improved+constructs+for+cartilage+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications.</a> Biofabrication. 5, 015001(2013).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+heterogeneous+tissue+constructs+containing+multiple+cell+types+prepared+by+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology.</a> Biomaterials. 34, 130-139 (2013).</li>
<li>Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hydrogels+for+bio-printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hydrogels for bio-printing applications.</a> J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li>
<li>Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrated+versus+lyophilized+forms+of+porcine+extracellular+matrix+derived+from+the+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder.</a> J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+synthetic+ECM+hydrogels+for+3-D+in+vitro+maintenance+of+hepatocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function.</a> Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).</li>
<li>Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+ECM+scaffolds+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Injectable ECM scaffolds for cardiac repair.</a> Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).</li>
<li>Pati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+three-dimensional+tissue+analogues+with+decellularized+extracellular+matrix+bioink%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+comm%22%5BJournal%5D)">Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink.</a> Nat comm. 5, 3935(2014).</li>
<li>Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheological+properties+of+cross-linked+hyaluronan-gelatin+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering.</a> Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).</li>
<li>Engler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cardiomyocytes+beat+best+on+a+matrix+with+heart-like+elasticity%3A+scar-like+rigidity+inhibits+beating%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating.</a> J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+collagen-coated+gels+that+maximize+in+vitro+myogenesis+of+stem+cells+by+matching+the+lateral+elasticity+of+in+vivo+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle.</a> Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).</li>
<li>Lozoya, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hepatic+stem%2Fprogenitor+phenotype+by+microenvironment+stiffness+in+hydrogel+models+of+the+human+liver+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche.</a> Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+elasticity+provides+mechanical+signals+for+the+expansion+of+hemopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).</li>
<li>Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+elasticity+controls+cell+proliferation%2C+surface+marker+expression+and+motile+phenotype+in+amniotic+fluid-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).</li>
<li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable%2C+cell-compatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).</li>
<li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((25th+anniversary+article%3A+Engineering+hydrogels+for+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication.</a> Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).</li>
<li>Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. , 2012/00889238 A1 (2011).</li>
<li>Drewitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+production+and+drug+sensitivity+testing+using+scaffold-free+spherical+tumor+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues.</a> Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogel+bioink+toolkit+for+mimicking+native+tissue+biochemical+and+mechanical+properties+in+bioprinted+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs.</a> Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).</li>
<li>Peattie, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+in+vivo+angiogenesis+by+cytokine-loaded+hyaluronic+acid+hydrogel+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants.</a> Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).</li>
<li>Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+with+naturally+derived+scaffolds+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).</li>
<li>Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+in+vivo+with+adipose-derived+stem+cells+on+naturally+derived+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds.</a> J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).</li>
<li>Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+synthetic+extracellular+matrix+on+vocal+fold+lamina+propria+gene+expression+in+early+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing.</a> Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).</li>
<li>Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+fold+tissue+repair+in+vivo+using+a+synthetic+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix.</a> Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteochondral+defect+repair+with+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+an+injectable%2C+in+situ%2C+cross-linked+synthetic+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix.</a> Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+repair+of+cortical+bone+defects+using+a+synthetic+extracellular+matrix+to+deliver+human+demineralized+bone+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix.</a> J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+extracellular+matrices+with+cleavable+crosslinkers+for+cell+expansion+and+easy+cell+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery.</a> Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).</li>
<li>Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+10.14%2C+Use+of+hyaluronan-derived+hydrogels+for+three-dimensional+cell+culture+and+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).</li>
<li>Xu, X., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tumor+growth+and+angiogenesis+by+a+lysophosphatidic+acid+antagonist+in+an+engineered+three-dimensional+lung+cancer+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model.</a> Cancer. 116, 1739-1750 (2010).</li>
<li>Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engineering%3A+orthotopic+cancer+models+in+mice+using+cell-loaded%2C+injectable%2C+cross-linked+hyaluronan-derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels.</a> Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).</li>
<li>Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-Tumor+Hybrid+Organoids+for+Modeling+Tumor+Growth+and+Drug+Response+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro.</a> Ann Biomed Eng. , (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在尝试生物制造用于人体或其它用途的三维组织构建物时，有几个关键组成部分需要重点考虑 体外 筛选应用。选择合适的细胞组分决定了最终的功能潜力，而生物制造设备本身则决定了实现最终结构的总体方法。第三个组分——生物材料——同样至关重要，因其具有双重作用。具体而言，生物材料必须与生物制造硬件兼容（即生物打印机）并为可能脆弱的生物细胞组分提供支撑。优化这两个要求可能十分困难，因为可用于生物打印的材料需要满足若干关键参数：1）具备适当的化学、力学和时间特性，以实现高效且无阻碍的打印过程；2）在制备阶段和生物打印过程中维持细胞活性；3）在生物打印完成后，提供有利于细胞存活并促进最终组织构建物功能发挥的微环境。本研究采用此处所述方法中描述的模块化水凝胶生物墨水系统，以满足上述要求。首先，通过引入来源于特定组织类型细胞外基质（ECM）的生长因子、胶原蛋白、糖胺聚糖（GAGs）和弹性蛋白，可构建出与目标组织类型生化特征相似的生化谱型。其次，通过采用两种相似但相互独立的交联反应，我们能够获得一种柔软且可挤出的材料，该材料适用于大多数基于挤出的生物打印系统，并可通过第二步交联进一步调节，以达到与选定目标组织相匹配的特定材料弹...

近年来，多种技术相继出现，旨在通过制造或生物制造功能性器官和组织来满足对替代来源的需求。其中，生物打印技术已成为最具前景的技术之一。生物打印可被视为一种对生物部件进行机器人化增材制造的技术，可用于构建或图案化出三维的、具有活性的类器官或类组织结构1。在大多数情况下，生物打印采用由计算机控制的三维（3-D）打印设备，将细胞和生物材料精确地沉积到指定位置，从而重现模拟解剖结构的生理架构2。这些设备打印的是一种称为“&#34;生物墨水&#34;”的材料，其形式可以是细胞聚集体、包埋于水凝胶或黏性流体中的细胞、接种了细胞的微载体，也可以是提供机械支撑或作为无细胞占位结构的无细胞聚合物3,4。在完成生物打印后，所获得的结构可进一步成熟为功能性组织或器官结构，并用于预期的最终应用5,6。迄今为止，尚未成功打印出完整且完全功能化的人体尺寸器官，但这仍是生物打印研发的主要长期目标2。然而，目前小型的“&#34;类器官&#34;”组织结构已在多种应用中投入使用，包括病理建模、药物开发和毒理学筛选。
研究人员在应用生物打印技术时遇到的主要障碍之一是，专门用于生物打印的材料非常有限。要成功实现生物打印，生物材料必须满足四个基本要求：生物材料需要具备 1）适当的机械性能，以实现材料的沉积（无论是通过喷嘴挤出凝胶形式，还是以喷墨方式形成液滴）；2）在沉积后作为三维结构组分保持其形状的能力；3）能够由用户调控前述两个特性；以及 4）在整个生物打印过程中为细胞提供友好且支持性的环境。7 从历史来看，生物打印研究常常试图在生物打印设备中直接使用现有的传统生物材料，而未充分考虑其兼容性，而不是专门设计出具备生物打印及后续打印后应用所需特性的生物材料。
近年来，为了更好地与沉积和制造设备相兼容，已开发出多种生物墨水。标准的水凝胶体系存在显著问题，因为它们通常要么是机械性能不足的前体流体溶液，要么是聚合后的水凝胶，在打印过程中容易堵塞喷嘴或在挤出时发生断裂。我们团队及其他研究者已探索了多种水凝胶配方以解决这些生物打印问题，包括将细胞球体打印到水凝胶基质中5,8、通过微毛细管实现细胞和水凝胶细丝的挤出9-11、具有动态交联特性的可挤出透明质酸（HA）-金纳米颗粒水凝胶12、利用光聚合甲基丙烯酰化透明质酸和明胶实现对水凝胶刚度的时间控制13、基于纤维蛋白原-凝血酶的交联体系14,15、通过离子交换形成的海藻酸-胶原蛋白凝胶16，以及最近发展的快速聚合紫外光（UV）引发交联技术17
这些示例证明了制备可有效进行生物打印的材料是可行的。然而，除了与硬件集成外，要成功生成具有活性和功能的三维组织结构，生物材料还必须包含有助于维持细胞活力和功能的生化与力学信号。这些附加因素，即生化特性与力学特性，对生物打印组织结构的成功功能具有重要影响。
细胞和天然的细胞外基质（ECM）均能够向其他细胞呈递多种信号分子，例如生长因子和其他细胞因子。这些信号的组合因组织而异，但在调控细胞和组织行为方面可能具有极强的效力和影响力。18 研究已成功探索了利用来自不同器官的组织特异性ECM组分，并将其作为水凝胶或水凝胶的一部分加以应用。19-21 该方法包括对特定组织进行脱细胞处理、研磨粉碎并溶解，可用于从任何组织中产生组织特异性的生化信号，并可整合到三维水凝胶结构中。22
此外，已有大量文献记载，人体内的组织具有广泛不同的刚度23。因此，调控生物材料力学性能（如弹性模量 E' 或剪切弹性模量 G'）的能力，在组织工程中是一项有用的工具。如上所述，对生物墨水力学性能的控制可实现基于软凝胶的挤出式生物制造，随后可通过后续交联进一步调控材料性能，使其弹性模量达到与目标器官类型相匹配的水平。例如，生物材料可被定制为匹配天然肝脏的刚度（5–10 kPa）23，或匹配天然心肌组织的刚度（10–15 kPa）24,25，理论上可增强这些类器官以类似于其对应天然组织的方式发挥功能的能力。近年来，环境刚度对细胞表型的影响已被广泛研究，尤其是在干细胞领域。Engler et al. 证明，基底弹性有助于引导间充质干细胞（MSC）向与其基底弹性相匹配的组织谱系分化25。该概念已被进一步应用于肌肉分化、心脏功能、肝脏表型、造血干细胞增殖以及干细胞治疗潜能的维持等方面24,26–29。能够将水凝胶调节至不同弹性模量，是用于生物制造组织结构的生物材料的一项重要特性30。
在此，我们描述一种在本实验室广泛应用的通用方案，用于制备可进行挤出式生物打印的水凝胶体系，并可根据需要定制，以实现：1）包含特定组织类型的生化特性；2）模拟该组织类型的弹性模量。通过满足上述要求，旨在提供一种能够重现目标组织理化及生物学特性的材料。 体内 组织。31 本文所述的模块化水凝胶复合系统采用多重交联策略，可制备具有可挤出性的生物墨水，并通过二次交联稳定结构并提高终产物的刚度，以匹配多种组织类型。通过使用组织特异性的细胞外基质（ECM）成分实现生化定制。作为示例，我们采用肝脏特异性的该水凝胶系统进行功能性肝类器官构建物的生物打印。本方案使用定制的三维生物打印机。总体而言，该方案可适配大多数基于挤出的生物打印机，但不同设备的具体打印参数差异显著，需由用户自行测试优化。

<table><tbody><tr><td>透明质酸</td><td>Sigma</td><td>53747</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>2-羟基-4&amp;prime;-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮</td><td>Sigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸和明胶水凝胶试剂盒（HyStem-HP）</td><td>ESI-BIO</td><td>GS315</td><td>试剂盒包含以下组分：Heprasil（巯基化和肝素化透明质酸）、Gelin-S（巯基化明胶）和Extralink（PEGDA）</td></tr><tr><td>8臂聚乙二醇炔烃，10&amp;nbsp;kDa</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PSB-887</td><td></td></tr><tr><td>原代人肝细胞</td><td>Triangle Research Labs</td><td>HUCPM6</td><td></td></tr><tr><td>原代人肝星状细胞</td><td>ScienCell</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>原代人库普弗细胞</td><td>Life Technologies</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞基础培养基（HBM）</td><td>Lonza</td><td>CC-3199</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞培养基补充剂试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td>HCM SingleQuot试剂盒（包含抗坏血酸0.5&amp;nbsp;ml；牛血清白蛋白[无脂肪酸]，10&amp;nbsp;ml；硫酸庆大霉素/两性霉素B，0.5&amp;nbsp;ml；氢化可的松21-半琥珀酸酯，0.5&amp;nbsp;ml；胰岛素，0.5&amp;nbsp;ml；人重组表皮生长因子，0.5&amp;nbsp;ml；转铁蛋白，0.5&amp;nbsp;ml）</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>其他厂家产品亦可使用。</td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Fischer Scientific</td><td>A669</td><td>其他厂家产品亦可使用。</td></tr><tr><td>新鲜猪尸体组织</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>任意</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>冷冻研磨机</td><td>任意</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>生物打印机</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>本文所述生物打印机为实验室自行定制。通常情况下，其他设备也可使用，只要其支持基于计算机控制的水凝胶材料挤出式打印即可。</td></tr><tr><td>悬滴细胞培养板</td><td>InSphero</td><td>CS-06-001</td><td>InSphero GravityPlus 3D培养平台</td></tr></tbody></table>

使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

生物打印已成为一种多功能的生物制造方法，可用于构建组织工程器官。这些结构有望作为器官替代物植入患者体内，同时，当以较小尺度构建时，可作为模型“类器官”使用，应用于 体外 用于药物和毒理学筛选的系统。
尽管已开发出多种多样的生物打印设备，但生物打印技术的应用仍可能受限于可用材料的范围，这些材料需既能加快生物打印过程，又能通过提供组织特异性信号来支持细胞的存活与功能。本文介绍一种基于透明质酸（HA）和明胶的多功能水凝胶体系，该体系采用多交联剂、两阶段交联方案，可提供组织特异性的生化信号，并模拟目标组织的力学性能。 体内 组织。 
通过引入来源于组织的细胞外基质材料（包含强效生长因子）来提供生化因子。组织的力学性能则通过不同分子量、结构（线性或多臂）和官能团的聚乙二醇（PEG）交联剂组合进行调控，从而获得可挤出的生物墨水，并使最终构建物的剪切刚度在较宽范围内（100 Pa 至 20 kPa）可调。利用这些参数，采用肝组织特异性生物墨水进行水凝胶生物打印，将原代肝细胞球体打印成in vitro肝组织构建物，实现了高细胞存活率，并可检测到白蛋白和尿素的功能性分泌。该方法提供了一个通用框架，可为进一步定制用于多种组织构建物生物制造的水凝胶提供适应性基础。

若正确执行上述操作步骤，水凝胶应具有针对目标组织类型的特定生化谱20，能够对生物打印过程及最终弹性模量进行高度控制34，并支持组织构建物中细胞的存活与功能。 
水凝胶定制 
为了更好地模拟天然肝脏，向水凝胶生物墨水中添加肝脏细胞外基质（ECM）溶液和生长因子阵列,20 ECM溶液中含有多种生长因子和细胞因子（浓度单位为pg/ml，图1A）。这些因子包括脑源性神经营养因子（BDNF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、骨形态发生蛋白5（BMP-5）、成纤维细胞生长因子4（FGF-4）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP-2）、转化生长因子β1（TGF-β1）、骨形态发生蛋白7（BMP-7）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子7（FGF-7）、生长激素（GH）、肝素结合性...

我们描述了一组联合使用的方案，可共同制备出具有组织模拟特性的水凝胶生物墨水，用于生物打印功能完整且存活的三维组织结构 体外 筛选应用。

生物打印已成为一种多功能的生物制造方法，可用于构建组织工程器官。这些结构有望作为……

本实验方案的总体目标是展示一种多功能方法，用于设计可通过生物打印设备挤出的水凝胶生物墨水。这些生物墨水随后可用于制造三维组织结构。该方法有助于解决生物打印领域中的关键问题，例如如何调控所需的机械性能，以提供一种能够使用生物打印机进行挤出的材料。该技术的主要优势在于，我们采用市售组分以模块化方式组合，制备出一种简单且高效的可生物打印水凝胶生物墨水。这些技术的应用包括创建三维组织类器官，可用于精确模拟药物、毒素及疾病的作用效果。尽管该方法可为生物打印三维肝组织构建提供框架，但也同样适用于其他组织类型，如肌肉、肺和结肠组织。通常，初次接触该方法的人员可能会遇到困难，因为制备水凝胶生物墨水需要用到多种不同的试剂，但实际上该过程相当直接。本实验操作将由本团队的博士后 Young-Joon Seol 进行示范。首先，按照其他部分所述方法，制备可用于水凝胶配方中的组织特异性细胞外基质消化液。然后，将光引发剂以0.1%的重量体积比溶解于水中。为制备水凝胶生物墨水，首先将透明质酸水凝胶试剂盒中的基础材料组分分别溶解于上述含光引发剂的水溶液中。接着，按照此处所示比例，将细胞外基质溶液、2%巯基化透明质酸、2%巯基化明胶、交联剂以及肝细胞培养基混合。为改善生物墨水的挤出性能，向混合物中加入1.5毫克/毫升未修饰的透明质酸和30毫克/毫升明胶。然后，在使用前将所得混合物在高速下涡旋震荡十秒钟。在将生物墨水用于生物打印设备之前，首先在实验台上测试其挤出特性。使用标准注射器，取少量生物墨水样品，然后在注射器上安装一根20至30号的针头。让生物墨水交联，然后通过针头推出生物墨水，以获得平滑挤出的水凝胶丝。如果该配方能够形成少凸起或无凸起的丝状结构，则可进行生物打印。将生物墨水装入生物打印机时，用移液器将生物墨水转移至已灭菌的打印机 cartridge 中。让其静置30分钟后再进行挤出，因为生物墨水将在 cartridge 内自发进行第一阶段交联。接下来，将 cartridge 装入打印装置，并将气动压力源连接至 cartridge。准备一个简单的打印图案，例如此7 mm × 7 mm的平行线网格，用于评估其挤出兼容性。当打印头在 XY 平面以约 300 毫米/分钟的速度移动时，对 cartridge 施加 20 千帕的压力以挤出生物墨水。如果挤出材料呈块状或不规则，应减少添加的交联剂用量，以软化第一阶段交联的材料。配制得当的生物墨水应能平稳挤出，实现精确沉积和结构成型。采用随附文本方案中所述的悬滴法，在96孔板中制备三维原代肝细胞球。培养三天后，使用移液器从悬滴板中收集肝细胞球，并转移至无菌的15毫升锥形管中。静置1至2分钟，使细胞球沉降至锥形管底部。然后，用移液器小心吸除培养基。将新鲜配制的水凝胶生物墨水溶液转移至含有类球体的锥形管中，转移体积为所需打印的3D结构体积的110%至125%。随后，轻轻吹打类球体，使其在水凝胶生物墨水溶液中重新悬浮。待类球体溶液均匀悬浮后，使用移液器将其转移至生物打印 cartridge 中，并使溶液经历第一阶段交联，持续 30 分钟。完成第一阶段交联后，利用生物打印设备制备含有原代肝类球体的目标水凝胶结构。每沉积一层后，将打印出的生物墨暴露于紫外光下照射 2 至 4 秒，以启动第二阶段交联反应。这将稳定构建物并使刚度达到所需水平。溶液中 PEG 炔烃的浓度控制着整体交联密度，因而主要决定了最终构建物的刚度。生物打印后，通过共聚焦显微镜观察到肝构建物中细胞存活率较高。在最佳环境条件下，细胞活力应高于 85%。此外，对类肝组织构建物进行肝组织标志物染色时，观察到细胞色素 P450 同工酶 CYP3A4、细胞内白蛋白、上皮细胞间黏附蛋白 E-cadherin 以及在肝脏中高表达的蛋白 DPP4 均呈阳性表达。对培养基中尿素和白蛋白水平的检测结果显示，在 14 天的实验周期内，该构建物持续稳定地分泌尿素和白蛋白。这进一步表明，组织特异性水凝胶生物墨水有助于维持肝细胞的功能。熟练掌握后，若操作得当，整个技术流程从开始到结束大约可在两小时内完成。然而，这通常取决于所使用的特定生物打印设备。在实施该操作时，需注意所演示的步骤往往需要根据其他组织类型或生物打印设备进行相应调整。通过此操作流程，可开发其他水凝胶生物墨水配方，以支持其他组织类型的生物打印。这些技术的发展为构建多类器官“芯片上器官”平台奠定了基础，可用于药物筛选和疾病建模。观看本视频后，您应能够充分理解如何着手设计可用于通过多步交联进行3D组织构建物生物打印的材料。请注意，使用紫外光可能对视力造成极大危害，因此在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴紫外防护眼镜。

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

生物印刷细胞化构造使用组织特异性水凝胶生物油墨

采用生物打印机基于可牺牲模具制备出具有特定图案的水凝胶。首先用第二种水凝胶填充泊洛沙姆模具，随后将其洗脱，形成可被第三种水凝胶填充的孔隙结构。该方法利用泊洛沙姆快速洗脱和良好可打印性的特点，实现由生物聚合物构建复杂结构。...

打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

设计并制造了一种笛卡尔式生物打印机，可实现多种材料在精确且可重复的几何形状中的沉积，同时允许对环境因素进行控制。利用该三维生物打印机，可打印出复杂且具有活性的结构，并能够轻松实现重复制备。...

使用三喷头笛卡尔打印机进行细胞构建物生物打印的活性研究

本方案描述了一种使用自动化机器人沉积系统的生物打印方法，该方法结合了刻蚀的拓扑引导线索与承载细胞的水凝胶生物墨水的精确沉积。打印的细胞被直接递送至刻蚀结构中，并能够感知并沿其定向排列。...

用于细胞表面引导与生物打印的自动化机器人分配技术

我们提供一种基于微流控生物打印策略的通用方案，用于构建微纤维血管床，其中可进一步将第二种细胞类型接种于该微纤维结构的间隙空间，以生成带血管化的组织和类器官。...

用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

使用基于纳米纤维素-海藻酸盐的生物墨水对软骨和皮肤类似物进行生物打印。打印前通过单步被动混合装置对生物墨水进行细胞接种。结果显示，所构建的组织结构细胞分布均匀，细胞活力高，并表现出良好的分化标志物。...

利用新型被动混合单元技术实现生物墨水预细胞化的软骨与皮肤组织类似物生物打印

我们开发了一种异质性乳腺癌模型，该模型由永生化的肿瘤细胞和成纤维细胞嵌入可生物打印的海藻酸盐/明胶生物墨水中构成。该模型可重现 体内...

可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外 模型系统诱导细胞球体形成

本文介绍了一种明胶甲基丙烯酰胺的3D生物打印方法。...

基于明胶甲基丙烯酰胺水凝胶生物墨水的3D生物打印方案

本研究中，我们开发了一种新型的多层改性策略，用于低黏度类液体生物墨水（甲基丙烯酰化明胶），以防止包封细胞发生沉降。...

使用多层水凝胶生物墨水进行三维生物打印以实现均匀的细胞分布

本方案重点介绍了一种快速评估结晶纳米纤维素（CNC）/琼脂糖复合水凝胶生物材料油墨与小鼠骨髓来源肥大细胞生物相容性的方法，主要考察细胞活力以及细胞表面受体Kit（CD117）和高亲和力IgE受体（FcεRI）的表型表达。...

用于骨髓来源肥大细胞培养的结晶纳米纤维素嵌入琼脂糖生物材料油墨的制备

本方案描述了一种3D打印技术，通过在明胶基颗粒支撑材料中沉积磷酸钙墨水来制备类似骨组织的结构。所打印的骨类似物可实现自由成形，并具有灵活性，既可直接取出打印产物，也可在含活细胞的基质中进行交联，以构建多相复合结构。...

在含细胞悬浮液中进行陶瓷全向生物打印以生成骨类似物

了解如何使用模块化水凝胶生物油墨进行生物印刷，构建功能性三维组织结构。该方法利用多步交联技术控制机械性能，适用于肝脏、肌肉等多种组织类型的体外药物筛选与疾病建模研究。

使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

探索更多视频