Name: 在脑片恐惧电路体外光遗传学解剖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学习离体光遗传学技术，通过表达通道视紫红质并结合膜片钳记录，研究恐惧相关神经环路中局部与长程突触连接的功能特性。该方法可精确操控神经活动，揭示恐惧行为的神经基础。

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感谢Cora Hübner和Andrea Gall在获取部分代表性结果方面提供的帮助。本工作由图宾根大学整合神经科学卓越中心（CIN）资助，该中心是德国研究基金会（DFG）在卓越计划框架内资助的卓越计划项目（EXC 307），并得到慈善赫蒂基金会资金的支持。

伦理声明：所有实验程序均符合欧盟关于研究中使用动物的指令，并已获得负责图宾根大学的当地动物护理与使用委员会（德国巴登-符腾堡州图宾根区政府）的批准。&#160;
1. 立体定位注射步骤
<ol>
	<li>使用灭菌器准备无菌器械（剪刀、手术刀、钳子、钻头、针头、缝合材料）。将无菌器械及其他所需溶液和手术用品（如无菌棉签、消毒剂、无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和 H2O2）放置于无菌手术单上。</li>
	<li>根据制造商说明，使用水平微电极拉制仪和3 mm宽的盒式灯丝拉制用于注射的玻璃微电极（图1A，插图）。 
	注意：对于深部注射，电极锥形部分应足够长以到达最腹侧的坐标位置（约5 mm；具体坐标见1.10）。</li>
	<li>在无菌PBS中预先混合1 µl病毒溶液和&#160;0.2 µl的0.1%快绿溶液（以便在玻璃微电极中更清晰地观察溶液）。使用带细尖的微量移液器将病毒溶液与快绿的混合液装入玻璃微电极中（图1A，插图）。 
	注意：重组腺相关病毒载体（rAAV）的操作属于生物安全一级（BSL 1）实验，需在BSL 1实验室中进行。本研究中使用的rAAV（图1C）包括：1)&#160;mPFC：rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP（血清型2/9）16；2) MGm/PIN：rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry（血清型2/9）23；3) mpITC/BLA：rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP（血清型2/1）23</li>
	<li>使用小型动物麻醉机对小鼠进行麻醉（诱导阶段使用3%异氟烷与氧气混合气体）。 
	注意：本研究使用的小鼠年龄为4至7周，品系与基因型如下：C57Bl6/J野生型（图2A和3A-D中的实验）；GAD67-GFP 24（图2B和3E-H中的实验）；Tac2-Cre 25（图2C和3I-J中的实验）。</li>
	<li>剃除耳朵之间及眼睛前方的头部毛发。使用棉签涂抹消毒剂（聚维酮碘基）于剃毛区域。</li>
	<li>涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干燥。皮下注射镇痛药（美洛昔康基，0.1 ml的5 mg/ml溶液）。</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位仪（图1A）中，并通过气体麻醉面罩维持麻醉（维持阶段使用2%异氟烷与氧气混合气体）。继续操作前检查肢体回缩反射以确认麻醉深度。 
	注意：整个手术过程中应尽可能保持无菌条件；佩戴一次性口罩、手术服和手套。</li>
	<li>使用剪刀在头顶做皮肤切口。用钝头镊子轻轻将皮肤向一侧牵拉，用钳子固定以暴露颅骨表面，并用H2O2清洁颅骨。</li>
	<li>使用细尖永久性记号笔在颅骨上标记注射位点，并为双侧半球钻孔（图1B）。本研究的注射坐标（以Bregma为参考，单位：mm）如下：mPFC：前向1.9，外侧±0.3，腹侧2.1；MGm/PIN：后向3.0，外侧±1.8，腹侧3.8；mpITC/BLA：后向1.45，外侧±3.35，腹侧4.75。</li>
	<li>将装有液体的玻璃微电极安装至连接压力注射装置的立体定位仪上，并将电极移至Bregma位置。</li>
	<li>使用细直头镊子轻轻折断玻璃微电极尖端。操作应轻柔，避免产生病毒溶液气溶胶。通过施加数次压力脉冲并观察病毒溶液液滴的挤出来确认电极尖端通畅。</li>
	<li>将电极移至目标注射坐标，使用压力注射装置以下列参数注入一半电极内容物（约0.5 µl）：压力：20 psi，平均脉冲时长：30 ms，平均脉冲次数：50。</li>
	<li>注射后保持电极原位约1分钟，然后缓慢（1 mm/min）撤出。 
	注意：若使用同一根电极在另一侧半球重复操作，需确保电极未堵塞。如尖端堵塞，应清洗或重新折断尖端，并再次将电极位置归零至Bregma。</li>
	<li>用PBS（pH 7.4）清洁颅骨，移除钳子，轻轻将皮肤拉拢，使用单个纽扣式缝合法缝合切口（打3–4个结）。在伤口周围涂抹消毒剂（聚维酮碘基）。</li>
	<li>停止麻醉，直至小鼠完全清醒前不得无人看护。术后单独饲养，或仅在完全恢复后方可放回群体。术后持续监测健康状况，必要时给予镇痛处理。所有操作须遵循当地动物护理与使用委员会制定的规定。</li>
</ol>
2. 急性脑片的制备
<ol>
	<li>准备人工脑脊液（ACSF）、切割溶液、工具（剪刀、手术刀、镊子、刮勺、巴斯德移液管）以及琼脂块。 
	注意：每次实验需要1 L&#160;人工脑脊液（ACSF），通过将化学试剂溶解于双蒸水（H2O）中配制，具体配方见先前文献报道16,23。切割溶液通过向200 ml ACSF中加入0.87 ml 2 M MgSO4储备液配制而成。</li>
	<li>在整个实验过程中，使用95% O2和5% CO2对ACSF和切割溶液持续供氧。</li>
	<li>使用小动物麻醉机以异氟烷（氧气中浓度3%）对小鼠进行深度麻醉。在继续操作前，通过肢体回缩反射检测麻醉深度。</li>
	<li>使用大剪刀将小鼠断头，并立即将头部浸入冰冻的切割溶液中冷却。</li>
	<li>从尾侧向头侧沿中线做单一切口打开颅骨，用镊子轻轻将颅骨碎片向两侧推开。使用小型圆头刮勺轻柔地将脑组织从颅腔中取出。用手术刀切除小脑，并将脑组织置于冰冻的切割溶液中。</li>
	<li>对于mPFC注射位点：使用手术刀切下脑组织前部（包含mPFC），并将其保存在冰冻的切割溶液中，直至进行切片。</li>
	<li>用滤纸吸去多余的切割溶液，将脑组织后部粘附至振动切片机载物台上。</li>
	<li>对于倾斜切片的杏仁核切片，将脑组织粘附于以35°角切割的4%琼脂块上（图1D，中图）；对于冠状面杏仁核切片、MGm/PIN注射位点及mPFC注射位点，直接将脑组织粘附于载物台上（图1D，左图和右图）。在脑组织后方放置额外的琼脂块以增强切片过程中的稳定性。</li>
	<li>将载物台放入切片室，切片室内盛有冰冻且持续供氧的切割溶液，并通过冷却装置维持温度在4 °C。使用蓝宝石刀片制备杏仁核急性切片（厚度320 µm）。将切片转移至界面型孵育室，用持续供氧的ACSF在室温（RT）下孵育。</li>
	<li>完成急性杏仁核切片制备后，将界面型孵育室置于36 °C水浴中，使切片恢复35–45分钟。随后将孵育室重新放回室温环境。如需对这些切片进行记录，请继续执行步骤3.2。</li>
	<li>在开始步骤2.10的同时，按照前述急性杏仁核切片的方法（步骤2.8–2.9）对注射位点所在脑区进行切片。此处无需在水浴中恢复切片。可选：为快速估计注射位点位置，可在配备荧光灯及适当滤光片的体视显微镜下观察切片。</li>
	<li>为进行事后分析，将含有注射位点的切片夹在两层滤纸之间，浸入含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液中固定过夜（O/N）。如需进一步分析注射位点，请继续执行步骤4.1。</li>
</ol>
3. 突触前纤维的可视化与刺激
<ol>
	<li>准备用于光遗传学激活纤维和细胞的膜片钳显微镜：
	<ol>
		<li>将安装好的发光二极管（LED）对准光传递路径的中心。</li>
		<li>使用功率计在后焦平面以及每个物镜输出端测量LED光强，选择适当的波长470 nm。</li>
		<li>计算以mW/mm2为单位的光强，并为每个物镜在470 nm波长下测得的数值绘制校准曲线（LED强度（%）相对于光输出（mW/mm2））。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从界面式孵育槽中取出急性杏仁核脑片，置于直立显微镜上的记录槽内，该显微镜配备有荧光光源。注意确保脑片在界面式孵育槽中朝上的表面在记录槽中仍保持朝上。以约31 °C、流速为1 - 2 ml/min的新鲜含氧人工脑脊液（ACSF）持续灌流脑片。</li>
	<li>结合使用荧光光源和适用于所表达的特定荧光蛋白的滤光片组，在脑片中观察突触前纤维。使用5倍物镜获取整体视野（图1E），使用60倍物镜评估目标区域内的纤维密度。 
	注意：对于GFP和YFP，&#160;使用&#34;绿色&#34;滤光片组（激发光472/20，分光镜495，发射光490 LP）；对于mCherry，使用&#34;红色&#34;滤光片组（激发光560/40，分光镜585，发射光630/70），具体参见材料与设备表。</li>
	<li>根据实验需要，打开或限制显微镜光路中的光圈（图2D）。</li>
	<li>进行膜片钳记录时，先用内液填充膜片钳电极，然后将其安装至电极夹持器中。对膜片钳电极施加正压，使用显微操作器将其缓慢插入浴液，再在视觉控制下进入脑片。
	<ol>
		<li>从侧面和上方接近目标神经元。当电极接触细胞表面（细胞表面可见凹陷）时释放正压，并通过施加负压形成&#34;吉欧封接&#34;。</li>
		<li>进一步施加负压以破裂膜片，获得全细胞记录模式。随后，使用连接的LED以激活ChR的适当波长（470 nm）刺激标记的纤维，同时记录细胞的电反应。</li>
		<li>进行突触刺激时，从低LED强度开始，逐步增加至达到所需的突触电流幅度。通过数据采集软件设置数字输出信号，以控制LED的刺激时序和脉冲持续时间（示例见图3）。 
		注意：也可使用其他软件和/或TTL信号发生设备来触发LED。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要，在后续记录的细胞中或在特定药物存在下，重复进行显微镜光路中光圈打开或限制（步骤3.4）条件下的刺激。</li>
	<li>记录完成后，将脑片夹在两张滤纸之间，浸入4%多聚甲醛（PFA）中过夜，用于后续组织学分析。</li>
	<li>分析电生理数据。 
	注意：使用适当的软件离线查看每次刺激所记录的扫描数据。在分析药物效应时，使用峰值检测程序获取所有单次扫描中突触电流幅度随时间变化的过程，确定药物效应达到稳态的时间点。为准备图示中的代表性平均反应，使用软件对每种实验条件下不少于10次的单次扫描进行平均（参见图3B-D、F-H、J右图）。 
	注意：可使用多种其他软件包进行数据分析。</li>
</ol>
4. 注射位点的事后分析
<ol>
	<li>将注射位点切片（来自步骤2.12）和记录位点切片（如需重新成像，来自步骤3.7）在PBS中洗涤三次。具体操作为：在旋转摇床上每次加入新鲜PBS，振荡10分钟，重复更换溶液三次。</li>
	<li>在 PBS 中配制 2% 琼脂糖溶液，冷却至约 65 °C。将脑片平放于直径 30 mm 的小型培养皿底部，用琼脂糖包埋脑片，静置冷却至凝固。</li>
	<li>将含有切片的琼脂块用胶固定在振动切片机的载物台上，并将载物台放入含 PBS 的切割室中。</li>
	<li>将包埋的切片修整至 70 µm 厚度。可选：修片后可对切片进行染色， 即，使用Neurotrace揭示细胞构筑（图3A，C），和/或通过YFP或mCherry的免疫荧光染色以增强ChR融合蛋白的信号。</li>
	<li>将切片置于载玻片上，并用封片介质加盖盖玻片。使用荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察注射位点，如需要，还可观察投射区域含有纤维的切片图2A-C).</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案描述了一种用于离体（ex&#160;vivo）光遗传学研究神经环路及局部连接性的方法，该方法可通过在直立式脑片膜片钳记录装置的落射荧光光源接口加装波长约470 nm的LED实现，适用于大多数（即使不是全部）此类设备。在脑片中对轴突投射进行光遗传学刺激的一个主要优势在于，它能够特异性地激活并研究那些利用传统电刺激无法触及的神经连接特性，原因在于相应的纤维束此前未被发现、边界不清晰，或在单个脑片中未能完整保留。作为一个与恐惧环路密切相关的关键示例，本文阐述了如何应用该方法解析内侧前额叶皮层（mPFC）向杏仁核投射的输入特性。
即使在以往研究中已广泛使用电刺激纤维束的情况下，这些纤维束通常也携带来自不同起源区域的纤维。例如，在与恐惧学习相关的神经环路中，来自不同感觉丘脑核团或皮层区域的投射分别混合走行于内囊和外囊之中。光遗传学刺激的优势在于能够选择性地激活来自特定区域的纤维亚群。这一点在从PIN和MGm向间质细胞以及侧杏仁核主细胞发出的特定丘脑输入中得到了清晰体现。此外，电刺激所带来的一系列问题， 即，可通过光遗传学刺激克服刺激电极附近其他穿行纤...

可视化并同时激活脑区间特定连接及特定类型神经元的精确工具，在理解健康脑功能和疾病状态下功能连接性的研究中正变得愈发重要。理想情况下，这需要对已鉴定神经元之间通信的精确突触特性进行生理学研究。这一点对于那些无法在单个急性脑切片中保存的脑区之间的连接尤为重要。过去，这类研究主要通过分离的实验来实现。一方面，通过注射神经示踪剂 体内 已结合后续的光学或电子显微镜分析，用于研究突触前和突触后配对结构。另一方面，当起始区域的纤维束在脑片制备中得以保留并可及，可通过电刺激来评估其与靶区细胞之间的突触传递机制。
随着光遗传学的发展，通过靶向表达光控阳离子通道（例如与荧光蛋白融合的通道视紫红质，ChR），现在不仅可以激活神经元及其轴突通路，还能实现其可视化以及后续的解剖学分析1-4。由于表达ChR的轴突即使在与胞体分离后仍可被刺激5，因此在脑片中可以实现：&#160;1）评估那些传统电刺激难以触及的脑区输入，因为纤维束无法分离或特定路径尚不明确；&#160;2）明确鉴定此前推测但尚未完全阐明的特定输入的起源脑区；以及3）研究定义明确的细胞类型之间在局部和长程投射中的功能性连接。由于具备多项优势，近年来脑片中的光遗传环路作图技术已被广泛应用，市面上也 readily available 多种用于表达荧光标记ChR的病毒载体。相比传统电刺激，光遗传激活的关键优势包括：避免因放置刺激电极而对组织造成损伤、对纤维刺激具有更高特异性（电刺激可能同时激活途经纤维或其他邻近细胞），以及同样快速且时间精度高的刺激。此外，通过立体定位注射可将病毒载体精准靶向特定脑区6，并可通过Cre依赖性表达和/或特异性启动子实现条件性或细胞类型特异性的表达7。本文将该技术应用于恐惧系统中长程与局部环路的作图研究。
杏仁核是恐惧的习得与表达，以及恐惧和情绪记忆存储的关键脑区 8,9除了杏仁核外，内侧前额叶皮层（mPFC）和海马（HC）——这些与杏仁核相互连接的脑区——也参与恐惧记忆及消退记忆的获得、巩固和提取过程 10,11. 内侧前额叶皮层（mPFC）各亚区的活动似乎在调控以下两方面发挥双重作用&#160;高恐惧状态与低恐惧状态 12,13这可能部分通过从内侧前额叶皮层（mPFC）到杏仁核的直接连接来介导，从而调控杏仁核的活动和输出。因此，近年来，多项研究已开始进行 离体 利用脑片实验研究内侧前额皮层传入纤维与杏仁核内特定靶细胞之间的突触相互作用 14-17.
在恐惧学习过程中，关于条件刺激和非条件刺激的感觉信息通过特定丘脑和皮层区域的投射传递至杏仁核。这些输入在基底外侧杏仁核（BLA）的外侧部（LA）神经元上产生的可塑性，是恐惧条件反射的重要机制 9,18越来越多的证据表明，杏仁核中平行发生的可塑性过程涉及抑制性成分，以调控恐惧记忆 19一群聚集的抑制性神经元是GABA能内侧壳旁间质细胞（mpITCs），但其精确的连接方式和功能尚不完全清楚 20-22在此，采用光遗传学环路示踪技术评估这些细胞的传入与传出连接及其对杏仁核中靶向神经元的影响，结果表明，内侧腹侧间质细胞（mpITCs）接受来自丘脑和皮层中继核团的直接感觉输入&#160;23在mpITCs或BLA神经元中特异性表达ChR可实现&#160;局部相互作用的图谱显示，内侧颗粒细胞抑制BLA主神经元，但同时也被BLA主神经元相互激活，使其处于新型的前馈和反馈抑制环路中，从而有效调控BLA活动 23.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;手术&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>可替换为其他适用于小鼠的立体定位仪</td></tr><tr><td>立体定位仪小鼠适配器</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td>可替换为其他适用于小鼠的立体定位仪</td></tr><tr><td>小鼠用气体麻醉面罩</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>已不再供应，由货号51609M替代</td></tr><tr><td>压力注射装置，Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>可使用其他压力注射装置（例如Picospritzer）</td></tr><tr><td>Kwik Fill玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>麻醉机，IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>直流温度控制器及加热垫</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>水平式微电极拉制仪 P-1000型</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>手术器械灭菌器，Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP（血清型2/9）</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry（血清型2/9）&amp;nbsp;</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP（血清型2/1）&amp;nbsp;</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>快绿</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉剂，Isofuran CP（1ml/ml）</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消毒剂，Betadine（聚维酮碘）</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>可替换为其他消毒剂</td></tr><tr><td>镇痛药，Metacam溶液（5mg/ml美洛昔康）</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>可替换为其他镇痛药</td></tr><tr><td>Bepanthen眼膏</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>可替换为其他眼膏</td></tr><tr><td>钻机 NM3000（SNKG1341 和 SNIH1681）</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox缝合针</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>编织丝线缝合线</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;记录、光刺激与分析&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>人工脑脊液（ACSF）</td><td>成分见参考文献#16和#23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞内记录灌流液</td><td>成分见参考文献#16和#23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Roth, Germany</td><td>P027.1</td><td>用纯水配制2M储备液</td></tr><tr><td>切片机，Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific, Germany</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>组织切片机冷却装置，CU65</td><td>Fisher Scientific, Germany</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>蓝宝石刀片</td><td>Delaware Diamond Knives</td><td></td><td>定制订购，请联系公司</td></tr><tr><td>体视显微镜，SZX2-RFA16</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite荧光灯（XI120Q-1492）</td><td>Lumen Dynamics Group, Canada</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳显微镜，BX51WI</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B膜片钳放大器&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PClamp软件，版本10</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>用于控制数据采集和刺激</td></tr><tr><td>浴槽温度控制器，TC05</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann, Germany</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>三轴微操纵器 Mini 25</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann, Germany</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>微操纵器控制器 SM7</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann, Germany</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>用于界面式记录室的硝酸纤维素滤纸&amp;nbsp;</td><td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>LED光源单元，CoolLED pE</td><td>CoolLED, UK</td><td>244-1400</td><td>CoolLED或USL 70/470配合相应适配器是LED刺激的两种可选方案</td></tr><tr><td>CoolLED 100 Dual Adapt</td><td>CoolLED, UK</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLED或USL 70/470配合相应适配器是LED刺激的两种可选方案</td></tr><tr><td>LED光源单元，USL 70/470</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td>L70-000</td><td>CoolLED或USL 70/470配合相应适配器是LED刺激的两种可选方案</td></tr><tr><td>双端口适配器</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td>请咨询公司</td><td>CoolLED或USL 70/470配合相应适配器是LED刺激的两种可选方案</td></tr><tr><td>红色滤光片组（激发）</td><td>AHF, Germany</td><td>F49-560</td><td>滤光片可整套购买，货号F46-008</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;（分光镜）</td><td>AHF, Germany</td><td>F48-585</td><td>滤光片可整套购买，货号F46-008</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;（发射）</td><td>AHF, Germany</td><td>F47-630</td><td>滤光片可整套购买，货号F46-008</td></tr><tr><td>绿色滤光片组（激发）</td><td>AHF, Germany</td><td>F39-472</td><td>替代方案：滤光片组F36-149或F46-002（带带通发射滤光片）</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;（分光镜）</td><td>AHF, Germany</td><td>F43-495W</td><td>替代方案：滤光片组F36-149或F46-002（带带通发射滤光片）</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;（发射）</td><td>AHF, Germany</td><td>F76-490</td><td>替代方案：滤光片组F36-149或F46-002（带带通发射滤光片）</td></tr><tr><td>LaserCheck手持式功率计</td><td>Coherent, USA</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorPro软件，版本6</td><td>Wavemetrics, USA</td><td></td><td>用于电生理数据分析，也可使用其他替代软件包&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IgorPro用Neuromatic宏工具包</td><td>http://www.neuromatic.thinkrandom.com</td><td></td><td>用于电生理数据分析，也可使用其他替代软件包&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;注射与投射的后续分析&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>多聚甲醛粉末（PFA）</td><td>Roth, Germany</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 435/455 蓝色荧光尼氏染色剂</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>用于包埋和再切片的琼脂-琼脂</td><td>Roth, Germany</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>用于包埋的30 x 10 mm培养皿</td><td>SPL Life Sciences</td><td></td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>载玻片，Super Frost</td><td>R. Langenbrinck, Germany</td><td>61303802</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>R. Langenbrinck, Germany</td><td>3000302</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>Vecta Shield封片剂</td><td>Vector Laboratories, USA</td><td>H-1000</td><td>可使用其他封片剂</td></tr><tr><td>用于展平切片以固定的硝酸纤维素滤膜</td><td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td><td>11406--25------N</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜 LSM 710</td><td>Zeiss, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

离体 光遗传学解析脑片中的恐惧环路

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

光遗传学方法现已被广泛用于研究神经元群体和神经环路的功能，其结合了光敏蛋白的靶向表达以及通过光照对神经活动进行操控。通道视紫红质（Channelrhodopsins, ChRs）是一类光控阳离子通道，当其与荧光蛋白融合后，可在脑内特定区域实现特定细胞类型及其轴突投射的可视化与同步激活。通过立体定位注射病毒载体，可在特定脑区的特定细胞中组成性或条件性表达ChR融合蛋白，进而通过解剖学和功能学方法研究其轴突投射情况 离体 在脑切片中进行光遗传学激活。当旨在理解那些无法通过传统电刺激方法研究的突触连接特性，或用于识别先前了解甚少的传入与传出连接时，该技术尤为重要。以下通过几个实例说明如何应用此技术探究与杏仁核中恐惧相关环路有关的问题。杏仁核是恐惧习得与表达以及恐惧和情绪记忆存储的关键脑区。大量证据表明，内侧前额叶皮层（mPFC）参与恐惧习得与消退的不同阶段，但其与杏仁核之间精确的神经连接关系才刚刚开始被揭示。首先，本文展示了如何 离体 光遗传学激活可用于研究内侧前额叶皮层（mPFC）传入纤维与基底外侧杏仁核（BLA）靶细胞之间突触通讯的各个方面。此外，还展示了如何利用该方法 离体 光遗传学方法可用于评估新的连接模式，以杏仁核中的一组GABA能神经元——包膜旁间质细胞簇（mpITC）为例。

本节展示了某项工作的流程 离体 光遗传学方法及不同实验策略的代表性结果，用于研究感觉性和调节性长程投射至BLA和mpITC神经元的生理特性，以及mpITC与BLA之间局部连接的特性。
在将选定的病毒载体立体定位注射至小鼠脑内目标坐标后（图 1A-C，病毒表达时间根据实验需求为 2–6 周），制备注射部位及其在杏仁核投射区域的急性脑切片，用于膜片钳实验；同时制备注射脑区的切片，用于注射位点的后期分析（图 1D）。在开始记录和光遗传学刺激之前，应使用直立显微镜配备的荧光灯，检查目标区域（杏仁核）中荧光标记的细胞或轴突投射，以确认膜片钳记录的可行性（图 1E）。当在脑片的投射区域获得目标细胞的膜片钳记录后，启动光刺激，通过膜片钳软件控制刺激的时间点、间隔和脉冲持续时间，以触发发光二极管（LED）输出。根据实验策略的不同（图 ...

光遗传学方法被广泛用于操控神经元活动并评估其对脑功能的影响。本文概述了一种技术方案，该方案&#160;在……之后 体内 光敏激活蛋白Channelrhodopsin的表达，使得能够 离体 恐惧相关神经环路中特定长程与局部神经连接的突触特性分析

光遗传学方法现已被广泛用于研究神经元群体和神经环路的功能，其通过将光敏蛋白的靶向表达与光激活技术相结合……

本实验的总体目标是利用离体光遗传学技术研究神经投射和微环路的功能特性及突触特性。该方法包括在特定神经投射中表达通道视紫红质并加以激活，同时结合膜片钳记录技术。该方法有助于解答关于脑区内及脑区之间局部和长程连接突触特性的关键科学问题。本文通过研究支持恐惧行为的神经回路来说明这一点。该技术的主要优势在于，它能够研究那些无法通过传统电刺激技术进行探索的神经回路和突触。通常，初次接触该方法的研究人员需要克服在操作过程中准确完成所有必要步骤的挑战。这包括病毒注射的立体定位靶向、确定通道视紫红质的最佳表达时间、制备高质量的脑切片，以及稳定的光激活和记录。在开始本实验步骤之前，已通过立体定位手术将一种重组腺相关病毒载体注入内侧前额叶皮层，该病毒载体经基因工程改造可表达与荧光蛋白融合的通道视紫红质。准备振动切片机时，安装蓝宝石刀片，并将其设定为切割厚度320 µm。根据批准的方法处死动物并取出脑组织后，使用手术刀切除小脑，然后分离含有内侧前额叶皮层的脑前部。将脑前部置于冰上冷的切割液中，直至进行切片。使用冷却装置将切割室内的冰上冷切割液维持在4摄氏度。向溶液中通入氧气。用滤纸将脑组织吸干。将已切成35度角的4%琼脂块黏附到振动切片机的载物台上，并将脑组织的后部黏附到该琼脂块上。为保持切片时的稳定性，在脑组织块的前方和后方各粘贴一块额外的琼脂块。将带有组织的载物台放入切片室，并确保其完全浸没。开始切割急性脑片。将每片切片切成两半，转移至含有充氧人工脑脊液（ACSF）的界面式孵育 chamber 中，室温下保存。急性杏仁核切片制备完成后，将孵育 chamber 置于36摄氏度水浴中，使切片恢复35至45分钟。为进行事后分析，选取包含注射位点的一部分切片，将其夹在两片滤纸之间，浸入含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）中，4℃过夜固定。在此，通过立体定位手术，将一种经基因工程改造、可表达与荧光蛋白融合的通道视紫红质的重组腺相关病毒载体，导入内侧膝状体核内侧部及其相邻的后部板内核。获取脑组织后，使用手术刀切除小脑及脑的前部，然后将脑组织中段如前所述置于冰冻切割液中冷却。用滤纸吸干脑组织，随后将其粘附至振动切片机的载物台上。再次，在脑组织后方固定一块额外的琼脂以增强切片时的稳定性。将切片阶段置入盛有4 °C切割液的切片室后，对杏仁核区域进行320 μm厚度的冠状切片，将切片一分为二，并如前所述收集至界面式孵育 chamber 中。在体视显微镜下使用荧光照明检查注射位点。为准备用于光遗传学激活纤维和细胞的膜片钳显微镜，将安装好的发光二极管（LED）置于光传递路径的中心位置。使用功率计在470纳米波长下测量后焦平面以及每个物镜输出端的LED光强度。利用电子表格计算以毫瓦每平方毫米（mW/mm²）为单位的光强度，并为每个物镜建立校准曲线。接下来，从界面式孵育槽中取出急性杏仁核脑片，并将其置

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在脑片恐惧电路体外光遗传学解剖

该视频展示了从小鼠脑中制备斜位杏仁核脑片的方法。将脑组织以一定角度放置在振动切片机的样本台上，以获取包含杏仁核以及来自内侧前额叶皮层并与其形成突触连接的轴突的脑片。脑片保持在生理温度下，以维持组织活性，供后续实验使用。...

从小鼠脑中制备倾斜的杏仁核脑片

本视频展示了从小鼠脑中制备薄冠状脑切片的过程，暴露出富含来自内侧前额叶皮层突触连接的杏仁核区域。随后将切片置于充氧的人工脑脊液中恢复，以维持神经元的活性。...

从小鼠脑中制备暴露杏仁核区域的冠状脑切片

本视频介绍了一种同时对含有神经元特异性荧光蛋白的转基因脑片进行成像和记录电活动的方法。该方法包括将脑片置于灌流室中，并用充氧的人工脑脊液维持；使用光源激发荧光标记的细胞；并通过多通道探针和膜片钳技术记录电信号。...

脑切片中神经元细胞的同步光学与电生理监测

本视频演示了一种利用小鼠急性杏仁核脑片分析内侧前额叶皮层（mPFC）与杏仁核神经元之间突触连接的方法。这些小鼠的mPFC神经元表达与荧光蛋白融合的光敏通道蛋白。在光照激活下，光敏通道蛋白可促进离子内流并引发mPFC神经元产生动作电位。随后，mPFC神经元释放神经递质，与杏仁核突触后神经元上的受体结合，触发突触后电流，通过记录这些电流可可视化mPFC-杏仁核之间的连接性。...

杏仁核脑切片中神经元通路的可视化与定位

我们描述了一种利用光遗传学方法在体外光刺激神经元群体，以表征前脑环路功能拓扑结构和突触特性的方法 in...

光遗传靶向前脑环路的激光扫描光刺激

本方案描述了一组利用离体脑片中的光遗传学刺激，鉴定来自远端脑区的长程输入的细胞类型特异性功能连接的方法。...

在体小鼠脑切片中长程投射通路的光遗传学刺激：颅内立体定位注射方法

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。...

光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

离体脑片可用于研究挥发性麻醉剂对传入刺激诱发反应的影响。利用光遗传学技术可独立激活丘脑皮层和皮层间传入纤维，作用于非初级新皮层，并通过异氟烷调节突触和神经网络反应。...

脑片中传入通路的光遗传学激活及挥发性麻醉剂对反应的调节

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体...

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

观察性恐惧范式通过检测啮齿类动物的替代性僵直行为来评估情感共情。该实验流程包括使观察者啮齿类动物接触接受厌恶足底电击的同种示范者，以诱发共情相关的僵直反应。通过采用观察性恐惧检测方法，研究人员能够探究情感共情背后的神经机制。...

小鼠中作为情感共情模型的观察性恐惧

学习离体光遗传学技术，通过表达通道视紫红质并结合膜片钳记录，研究恐惧相关神经环路中局部与长程突触连接的功能特性。该方法可精确操控神经活动，揭示恐惧行为的神经基础。

离体光遗传学解析脑片中的恐惧环路

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