具有光热特性的电活性聚合物纳米颗粒

本实验方案的总体目标是制备具有光热特性的导电聚合物纳米颗粒，并评估其细胞毒性。导电聚合物纳米颗粒是光热治疗的理想试剂，因其可在近红外光区吸收光能并将其转化为热能，从而杀死癌细胞。聚合物光疗试剂的主要优势在于，可通过调节其相容性和肿瘤靶向能力，定制其光吸收特性，实现有效的非侵入性局部癌症治疗。

我们用于光热治疗的聚合物也可应用于替代能源、传感器和电致变色领域。由于该反应对水分敏感，初学者可能会遇到困难。因此，充分掌握无空气合成技术至关重要。

细胞培养实验的可视化演示至关重要，因为无菌技术难以掌握。所有多角色参与的实验都需要精确性和一致性才能获得正确的结果。将隔膜、装有进气控制适配器的冷凝器和出气控制适配器固定在三颈圆底烧瓶上。

将气体出口接头连接至鼓泡器。接着，使用厚壁PVC管将入口接头连接至氩气施伦克管线。开始向反应瓶中通入氩气，并持续通气数分钟。

开启真空后，使用本生灯对反应体系进行火焰干燥，然后用氩气吹扫装置。重复此步骤两次，以获得无空气的环境。使用注射器通过隔膜向装置中加入1.07克EDOT。

向烧瓶中加入 20 毫升四氢呋喃并搅拌。在低型杜瓦瓶中制备干冰丙酮浴，将 EDOT 烧瓶在 -78 °C 下冷却 15 分钟。然后在维持温度为 -78 °C 的条件下，逐滴加入 11 毫摩尔正丁基锂的己烷溶液。

加料完毕后，继续搅拌一小时。操作有机锂试剂时必须格外小心。这些溶液具有极高的危险性，仅可由经过充分培训的人员进行操作。

移除干冰丙酮浴，并立即开始逐滴加入14.13毫升1摩尔的氯化锌溶液，在室温下搅拌反应1小时。接着，向反应体系中加入4毫摩尔的1,4-二烷氧基-2,5-二溴苯和80微摩尔的四(三苯基膦)钯。

使用油浴将反应重新加热回流至75摄氏度。每天用注射器取少量反应混合物样品，将样品沉淀至2毫升1摩尔盐酸中，并用2毫升二氯甲烷萃取产物。

将提取物点样于硅胶薄层色谱板（TLC板）上，同时点入预先配制的纯化EDOT溶液和相应的四烷氧基-2,5-二溴苯溶液作为对照。使用体积比为60:40的乙酸乙酯与正己烷混合溶液，在玻璃展开槽中展开色谱板。待反应完成（3至5天）后，将反应体系冷却至室温。

加入10毫升1摩尔的盐酸，随后加入20毫升二氯甲烷以淬灭反应。将反应混合物转移至分液漏斗中，分离出有机层。用去离子水洗涤有机相，直至水洗液不再呈酸性。

接下来，用15克硫酸镁干燥有机相。过滤除去固体后，使用旋转蒸发仪去除溶剂，得到黄色至橙色固体。在玻璃小瓶中，配制1毫升2%（质量/体积）的PSS-co-MA水溶液，并加入一个小型搅拌子。

将单体溶于氯仿，配制成16毫克/毫升的溶液，取100微升转移至微量离心管中。在微量离心管中溶解30毫克十二烷基苯磺酸，然后使用自动涡旋混合器搅拌30至60分钟，使溶液均匀。随后，每隔60秒将均一的有机相以10微升等分试样加入2% PSS-co-MA溶液中。

完全加入后，用两毫升水稀释溶液，并取出搅拌子。将乳液置于冰浴中，然后使用探头以30%的振幅进行两次、每次10秒的超声处理。从冰浴中取出小瓶，重新放入搅拌子以继续混合乳液。

接下来，向单体乳液中加入3.8 µL的100 mg/mL氯化铁水溶液，搅拌1小时，得到由PSS-co-MA稳定的聚合物纳米颗粒。将纳米颗粒悬浮液转移至7 mL离心管中，在75,600 ×g条件下离心3分钟。最后，收集上清液，并使用截留分子量为100 kDa的透析袋在水中透析24小时。

在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37°C及5%二氧化碳条件下，在T75培养瓶中培养三种卵巢癌细胞SCOV。采用标准方案消化并计数细胞后，以每孔5,000个细胞的密度将细胞接种至96孔板中。于37°C及5%二氧化碳条件下孵育细胞24小时。

使用前立即用完全培养基将纳米颗粒悬液稀释至每毫升一毫克的浓度。将纳米颗粒悬液通过无菌的0.2微米滤膜过滤。然后用含1%青霉素-链霉素的完全培养基将悬液稀释至所需的暴露浓度。

轻轻吸出每个孔中的培养基，替换为 100 微升含有不同暴露浓度纳米颗粒的悬浮液。孵育细胞后，小心移除溶液，然后加入 100 微升无菌过滤的 0.5 毫克/毫升 MTT 溶液。将细胞在培养箱中继续孵育 2 至 4 小时。

然后在显微镜下观察细胞，检查是否有甲臜晶体形成。小心移除 MTT 溶液，并加入 100 微升二甲基亚砜。将培养板置于摇床上，振荡数分钟以充分混匀。

最后，在 590 纳米和 700 纳米处测定每个孔的吸光度。这些数值分别对应于甲臜产物的峰值吸光度和基线。所得单体可通过氢谱和碳 13 核磁共振（NMR）波谱法进行表征。

Negishi偶联反应将苯环连接到EDOT上，导致苯环质子峰从7.1 ppm位移至7.8 ppm。噻吩环质子也向上场位移至6.5 ppm。亚乙基二氧桥碳上的四个质子在4.3 ppm处分裂为两组多重峰。

碳13核磁共振谱在70、45、40和13处显示出噻吩环碳的峰，以及在50、20和12处显示出苯环碳的峰。采用MTT细胞活力实验测定聚合物纳米颗粒的细胞相容性。在纳米颗粒浓度范围为0.23至56微克每毫升时，纳米颗粒不会使细胞活力降低至对照组的90%以下。

通常，细胞活力降低不超过20%被视为可接受。一旦掌握相关技术，单体的合成约需一周时间，纯化另需一周，而纳米颗粒的制备和纯化则不到一天即可完成。从细胞接种到实验结束，细胞毒性研究可在两个半小时内完成。

进行体外细胞实验时，必须遵循正确的无菌操作技术。通过本方案制备的纳米颗粒，还可进一步开展活/死细胞染色检测、显微镜观察、体内生物分布以及光热诱导排卵等研究，以更深入地评估其作为癌症光热治疗剂的潜力。