Name: 母体免疫激活诱导小鼠的病毒性模仿聚妊娠中期阶段（I:C） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 了解如何通过腹腔注射病毒模拟物poly(I:C)在小鼠妊娠中期诱导母体免疫激活。该方法用于研究免疫功能障碍对神经发育和行为的影响，为自闭症和精神分裂症研究提供可重复的实验模型。

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我们谨向已故的 Paul H. Patterson 博士致以敬意，以表彰他在线粒体功能障碍（MIA）模型、自闭症及精神分裂症研究领域所做出的重要贡献。我们感谢 Sarkis K. Mazmanian 对本实验方案的大力支持；感谢 Ruben M. Bayon、Yvette Garcia-Flores、Karen C. Lencioni 和 Leslie A. Neumann 提供的行政协助；感谢 Ali Khoshnan 和 Jan C. Ko 在拍摄过程中提供的帮助；感谢 Elaine Y. Hsiao 和 Natalia Malkova 在 MIA 诱导方面的建议；感谢 Jeffrey S. Cochrane、Joaquin Gutierrez、Kwan F. Lee、Jaime Rodriguez、Lorena C. Sandoval 和 Natalie A. Verduzco 在动物饲养管理方面的专业支持。本研究得到了以下资助：NIH Conte 中心奖（NIH 5P50MH086383-04，授予 Paul H. Patterson）；Autism Speaks 基金（#7670，授予 Paul H. Patterson）；Simons 基金会（#322839，授予 Sarkis K. Mazmanian）；NIH 培训基金（NIH/NRSA T32GM07616，授予 K.-H.C.）；加州理工学院暑期本科生研究奖学金（SURF，授予 Z.Y.）；加州理工学院 Amgen 学者项目（授予 Z.Y.）；以及中国台湾国家科学委员会博士后奖学金（NSC 101-2917-I-564-039，授予 W.-L.W.）。

所有实验方案均经加州理工学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后实施。
1. 准备定时交配对
<ol>
	<li>行为学实验至少使用6只母鼠，基因表达分析使用3只。 
	注意：应使用估计数量两倍的雌性小鼠，因为定时交配后仅有约50%的小鼠会形成阴栓。</li>
	<li>使用无既往妊娠史、年龄在8至16周之间的雌性小鼠。 
	注意：曾与雄性小鼠发生过性接触但未妊娠的雌性小鼠也可接受。</li>
	<li>将雌性小鼠共同饲养，并将笼子并排放置，以同步其动情周期。使用高度超过5.5英寸、内部底面积为75平方英寸的标准小鼠笼，可容纳5只成年小鼠。使用耳标法对每只雌性小鼠进行标记。</li>
</ol>
2. 设置定时交配对
<ol>
	<li>在黑暗周期开始前0-2小时设置定时交配。每笼放入两只雌性小鼠。取出小鼠并分别称重。记录每只雌性小鼠的体重。</li>
	<li>将一只雄性小鼠放入每笼与两只雌性小鼠共同饲养。采用三只交配法以尽量减少父系混杂效应。</li>
</ol>
3. 阴道栓检查（E0.5）
<ol>
	<li>在暗周期结束后的0-4小时内检查雌性小鼠。轻轻抓住雌性小鼠尾部基部，使其能够抓住金属网格、笼盖或笼子边缘。</li>
	<li>寻找阴道栓存在的迹象：阴道栓表现为阴道开口处可见的白色团块。若栓塞不明显，可将200 µl移液器吸头轻轻插入阴道开口。若感到凝结物阻力，则确认阴道栓已形成。每天检查一次阴道栓。 
	注意：阴道栓仅表明已发生交配行为，因此不能保证一定怀孕。在某些品系的小鼠中，阴道栓可能较难识别。建议向有经验的小鼠饲养人员寻求帮助，以提高识别准确性。</li>
	<li>将发现阴道栓的小鼠转移至新笼，并可进行合笼饲养。将发现阴道栓的当天定为胚胎发育0.5天（E0.5）。</li>
</ol>
4. 在 E10.5-11.5 天检查妊娠情况
<ol>
	<li>轻轻提起小鼠尾部基部，让小鼠抓住金属网格、笼盖或笼边。观察腹部区域，检查是否有妊娠迹象，例如，腹部隆起（图1）。 
	注意：在E11.5时，妊娠迹象通常比E10.5时更明显。</li>
	<li>称量小鼠体重以确认妊娠。与未妊娠小鼠相比，妊娠小鼠在E10.5时通常体重增加约20%，在E12.5时体重增加约30%（图2）。将妊娠小鼠单独饲养于清洁的笼具中。</li>
</ol>
5. 20 mg/kg 聚肌胞苷酸（Poly(I:C)）的配制
<ol>
	<li>行为学实验每组至少使用6只母鼠，基因表达分析每组使用3只。准备相应剂量的聚肌胞苷酸（poly(I:C)）溶液。</li>
	<li>称取聚肌胞苷酸（poly(I:C)）粉末至50 ml锥形管中，配制成终浓度为40 mg/ml的溶液。为尽量减少并标准化注射体积带来的应激，按每克小鼠体重注射5 µl poly(I:C)溶液（5 µl/g，即5 ml/kg）进行注射。为诱导母体免疫激活（MIA），我们给予每公斤体重20 mg的poly(I:C)。 
	注意：所需poly(I:C)溶液的浓度为(20 mg/kg)/(5 ml/kg) = 4 mg/ml。由于poly(I:C)粉末中含有10%的poly(I:C)，因此需配制终浓度为(4 mg/ml)/0.1 = 40 mg/ml的poly(I:C)溶液。 
	注意：poly(I:C)粉末非常轻，从药匙转移至锥形管时需小心，避免损失。</li>
	<li>向锥形管中加入相应体积的0.9%氯化钠溶液（生理盐水），盖紧管盖。通过轻轻滚动盐水液滴使poly(I:C)粉末充分溶解，直至溶液澄清。在800 × g条件下离心1分钟（图3C）。使用0.22 µm滤器过滤poly(I:C)溶液。&#160;将poly(I:C)溶液转移至1.5或2 ml微量离心管中。可选步骤：使用分光光度计测定poly(I:C)溶液的260/280比值，确保其在1.54–1.82之间（图3），具体参考生产商说明。&#160;注意：用于溶解poly(I:C)粉末及作为对照注射用的生理盐水应为无菌、药用级产品。</li>
</ol>
6. E12.5 时期的生理盐水或聚(I:C)注射
<ol>
	<li>将小鼠放在天平上称重，然后放回笼中。根据以下公式计算生理盐水组和聚肌胞苷酸（poly(I:C)）组小鼠的注射体积：体重（g）乘以 5 = 所需注射体积（µl）。使用 0.3 ml 胰岛素注射器抽取计算好的生理盐水或 20 mg/kg poly(I:C) 溶液，例如，&#160;一只 30 g 小鼠需注射 150 µl。</li>
	<li>轻轻抓住小鼠尾根部，将其放置在笼盖上。操作时动作轻柔，以避免应激引起干扰效应。将针头斜面向上，与小鼠体表呈约 20° 角，插入其两前乳头中央位置（图 4），并注射生理盐水或 poly(I:C) 溶液。&#160;注意：每次注射后应为每只小鼠更换新的针头。&#160;</li>
	<li>将小鼠放回其原居住笼中，并将笼子置于安静、人员走动较少的房间，以避免其他干扰因素的影响。</li>
</ol>
7. 聚肌胞苷酸注射后的第二天（E13.5）
<ol>
	<li>于次日早晨检查注射后的小鼠，使用天平测量其体重。 
	注意：与注射生理盐水的小鼠相比，注射聚肌胞苷酸（Poly(I:C)）的妊娠小鼠通常在注射后第一天体重增加较少。</li>
	<li>在子代出生前不要打扰小鼠。</li>
</ol>
8. MIA 后代的评估
<ol>
	<li>为尽量减少MIA诱导带来的混杂效应，请遵循以下指南评估MIA后代的使用。
	<ol>
		<li>排除早产或延迟分娩的窝仔，或窝仔数量少于5只的窝仔。</li>
		<li>若窝仔数量超过10只，应使用CO2对多余仔鼠实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 可选：检测 MIA 后的急性炎症反应
<ol>
	<li>在给予生理盐水或聚肌胞苷酸（poly(I:C)）注射3小时后，按照本机构动物护理委员会批准的方案中所述方法处死妊娠小鼠。 
	注意：颈椎脱位法通常更受青睐，因其可最大程度减少 CO 对实验结果的影响2安乐死药物对母体和胚胎的影响</li>
	<li>从成年妊娠小鼠中取出脾脏，并在体视显微镜下分离胎盘和胎鼠脑组织。
	<ol>
		<li>对于脾脏采集，将小鼠置于解剖板上，并在孕鼠腹部区域喷洒70%乙醇。使用无菌剪刀在肋骨下方腹部区域的中央沿垂直方向穿过皮肤剪开。</li>
		<li>脾脏位于左上腹象限。使用镊子分离脾脏。用精细擦拭纸轻轻滚动脾脏，以去除器官周围的脂肪组织。取约50 mg脾组织，分别放入含有500 µl RNA稳定液或TRIzol的Eppendorf管中，防止核酸降解。将样品储存于-80 °C冰箱中，直至使用。</li>
		<li>收集胎盘时，轻轻将子宫角从体内拉出，放入盛有经高压灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，并将培养皿置于冰上。用两把镊子撕开子宫壁，暴露羊膜囊。
		<ol>
			<li>使用镊子小心打开羊膜囊，避免损伤胎盘和胎儿。将胎盘与胎儿分离，并尽可能靠近胎盘处剪断脐带。清除胎盘上的羊膜囊残留物。将胎盘分别放入含有500 µl RNA稳定液或TRIzol的Eppendorf管中。样本置于-80 °C冰箱中保存，直至使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用于胎儿脑组织采集时，将胎儿保存在9.2.2步骤中的RNA稳定缓冲液中直至进行解剖。在体视显微镜下，使用精细#5镊子从脑室处轻轻剥离软脑膜。仔细清除胎儿脑组织上的所有膜结构。将胎儿脑组织分别放入含有500 µl RNA稳定缓冲液或TRIzol的Eppendorf管中。样本置于-80 °C冰箱中保存，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从组织中提取RNA，并将RNA反转录为cDNA。分析 Il6 通过实时PCR检测cDNA中的基因表达。</li>
	<li>按照TRIzol试剂盒说明书操作，从组织中提取RNA。若组织保存于RNA稳定化缓冲液中，先将样本解冻并离心去除缓冲液。用移液枪头将组织转移至另一含有500 µl TRIzol的离心管中，继续进行RNA提取。</li>
	<li>使用分光光度计测定RNA的浓度、260/280和260/230比值，确保比值均高于2.0。</li>
	<li>用DNase I处理RNA以消除DNA污染。将1 µg RNA、1 µl 10X反应缓冲液、1 µl无RNase的DNase以及无核酸酶水混合，总体积为10 µl。将混合液在37 °C孵育30分钟。加入1 µl DNase终止液以终止反应。将混合物在65 °C孵育10分钟。</li>
	<li>将RNA逆转录为cDNA。使用20 µl反应体系，每反应最多加入1 µg总RNA。在每个反应中混合4 µl 5x逆转录（RT）反应缓冲液、1 µl逆转录酶、DNase I处理后的11 µl RNA模板以及4 µl无核酸酶的H₂O。2O，使终体积为20 µl。设置逆转录热循环仪程序，通用条件如下：第一步：25 °C 反应5 min；第二步：42 °C 反应30 min；第三步：85 °C 反应5 min；第四步：4 °C 保存。将cDNA稀释5倍。短期保存可置于4 °C，长期保存需于-20 °C 冻存。</li>
	<li>分析 Il6 通过实时PCR检测cDNA中的基因表达，并进行归一化处理 Il6 基因表达到 β-actin 基因表达
	<ol>
		<li>配制主混合液 Il6 和 β-actin 检测。使用25 µl反应体系，每个基因的混合液包括12.5 µl SYBR Green Mix、0.5 µl 10 µM正向引物、0.5 µl 10 µM反向引物和6.5 µl无核酸酶水2O.</li>
		<li>将5 µl 5倍稀释的cDNA加入光学96孔反应板的孔底。每孔加入20 µl预混液，使最终PCR反应体系为25 µl。每个样本的每个基因设三个复孔。使用光学粘性封膜密封反应板，在4 °C、800 × g条件下离心3分钟。采用实时荧光定量PCR标准程序：第一步：50 °C孵育2分钟；第二步：95 °C预变性10分钟；第三步：95 °C变性15秒、60 °C退火延伸1分钟，共40个循环。增加熔解曲线分析步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 检测MIA成年子代的行为异常（可选）：
<ol>
	<li>在8至12周龄时进行行为学测试。测试前至少3天更换笼具垫料。测试前至少将小鼠在行为测试室中适应30分钟。</li>
	<li>进行前脉冲抑制（PPI）测试时，将小鼠置于亚克力圆柱形装置中，装置底部装有压电传感器。让小鼠在PPI测试舱内适应5分钟。给予小鼠6次120 dB白噪声刺激（惊跳反应）。</li>
	<li>随后，随机给予小鼠以下刺激组合：14次背景噪声、14次惊跳刺激（Startle）、14次前脉冲5 dB（比背景噪声高5 dB）加惊跳刺激（PPI5），以及14次前脉冲15 dB（比背景噪声高15 dB）加惊跳刺激（PPI15）。</li>
	<li>计算前6次120 dB刺激的惊跳反应平均值。分别计算其他各组刺激的惊跳反应平均值。通过公式（Startle - PPI5 或 PPI15）/ Startle 将数值转换为前脉冲抑制率。</li>
	<li>进行旷场实验时，将小鼠放置于方形开阔场地（50 x 50 x 50 cm3）的角落。通过顶部安装的摄像机记录小鼠10分钟内的运动轨迹。将场地中心区域定义为中央区（17 x 17 cm2）。通过手动或基于图像的自动分析软件，量化小鼠的总移动距离、进入中央区的次数以及在中央区停留的时间。</li>
	<li>进行弹珠埋藏实验时，先将小鼠放入测试笼中，笼内铺有5 cm厚的压缩干净白杨木屑，适应10分钟。随后将小鼠放回其饲养笼。轻轻将20颗深蓝色直径1.5 cm的玻璃弹珠以4×5阵列方式放置于垫料表面。再将小鼠放回含有弹珠的测试笼中，持续10分钟。记录在10分钟测试期间被埋藏的弹珠数量。</li>
</ol>
11. 检查MIA成年子代的小脑神经病理学（可选）：
<ol>
	<li>通过麻醉处死生理盐水组和MIA成年子代小鼠。经心血管系统用50 ml PBS灌注小鼠，随后用50 ml 4%多聚甲醛灌注。</li>
	<li>小心取出脑组织，并在4%多聚甲醛中4 °C条件下后固定过夜。用PBS冲洗脑组织三次，然后将脑组织置于含0.02%叠氮化钠的PBS中，4 °C冰箱保存备用。 
	注意：后固定的脑组织可在含0.02%叠氮化钠的PBS中4 °C冰箱内保存长达一个月。</li>
	<li>使用振动切片机将脑组织切成50 µm厚的矢状切片。用软毛刷笔收集脑切片。在室温下用0.6%过氧化氢孵育30分钟，以终止内源性过氧化物酶活性。</li>
	<li>将切片在封闭缓冲液（含10%山羊血清、0.1% Triton X-100和0.02%叠氮化钠的PBS）中稀释的一抗抗钙结合蛋白（calbindin）抗体中室温孵育过夜。随后将切片在封闭缓冲液中稀释的相应生物素化二抗中室温孵育2小时。</li>
	<li>将切片在亲和素DH-生物素化辣根过氧化物酶复合物缓冲液中孵育1小时（室温），以检测生物素信号。使用过氧化物酶底物显色以显示抗原。各步骤之间用PBS洗涤切片三次。将切片贴附于显微镜载玻片上，在显微镜下成像。</li>
</ol>

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<li>Abazyan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+interaction+of+mutant+DISC1+and+immune+activation+produces+adult+psychopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology.</a> Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).</li>
<li>Meyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+behavioral+and+pharmacological+dysfunctions+following+disruption+of+the+fetal+brain+balance+between+pro-inflammatory+and+IL-10-mediated+anti-inflammatory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling.</a> Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).</li>
<li>Vuillermot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+immune+activation+interacts+with+genetic+Nurr1+deficiency+in+the+development+of+attentional+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments.</a> J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).</li>
<li>Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Litter+size+predicts+adult+stereotypic+behavior+in+female+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).</li>
<li>Harvey, L., Boksa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereological+comparison+of+GAD67+and+reelin+expression+in+the+hippocampal+stratum+oriens+of+offspring+from+two+mouse+models+of+maternal+inflammation+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy.</a> Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在不同时间窗口诱导母体免疫激活（MIA）会干扰啮齿类动物大脑发育的不同事件，从而导致子代出现不同的行为异常和神经病理学改变。本文描述了一种在胚胎发育第12.5天（E12.5）通过注射聚肌苷酸：聚胞苷酸［poly(I:C)］在小鼠中诱导MIA的实验方案。该MIA诱导方法可导致子代出现与自闭症和精神分裂症相关的行为、神经、免疫及胃肠道异常8,10,11,16。需要注意的是，由于MIA是一种环境风险因素，子代表型的变异程度预期会高于神经发育障碍遗传模型小鼠。因此，为了通过MIA稳定且可重复地产生与自闭症和精神分裂症相关的表型，尤其重要的是要尽量减少可能干扰实验结果的额外变量。
应严格遵循本方案中描述的时间线。正确的注射时间窗口可确保母体免疫激活（MIA）在子代大脑发育的特定阶段产生干扰。在小鼠中，E12.5 时期诱导 MIA 相当于人类妊娠第一孕期末期的干扰阶段21，此阶段发生显著的大脑发育过程，包括浦肯野细胞和尾状壳核的发育，以及皮质层的神经发生。未来还需进一步研究，以证实 MIA 小脑中浦肯野细胞丢失与早期脑发育干扰之间的关联。
<...

母体免疫激活（MIA）的概念源于关于母体感染与自闭症及精神分裂症关联的流行病学研究1。由于在母体病毒感染后，胎盘或胎儿大脑中均未检测到可复制的病毒病原体2,3，因此推测感染对子代的影响是由母体免疫系统的激活所致，而非病原体本身直接引起。
为了阐明母体免疫激活（MIA）与精神疾病之间的因果关系，向妊娠期啮齿类动物体内注射化学合成的、模拟病毒的双链RNA——聚肌苷酸:聚胞苷酸（poly(I:C)）——已被广泛用作MIA的动物模型4,5。Poly(I:C)可被Toll样受体3（TLR3）识别，其全身给药可诱导类似病毒感染的急性炎症反应。Poly(I:C)导致子代出现行为异常和神经病理改变的机制之一，是引起母体-胎盘-胎儿轴中促炎与抗炎细胞因子的失衡6。多个研究团队已采用MIA模型来探究精神疾病的病因7，由于不同研究团队的关注点各异，已使用多种不同的免疫激活时间点，以实现对大脑发育和行为产生不同的干扰效应7。
加州理工学院 Paul H. Patterson 实验室采用在胚胎发育第12.5天（E12.5）向怀孕小鼠注射聚肌胞苷酸（poly(I:C)）的策略，已成功证明母体免疫激活（MIA）可诱导子代出现与自闭症和精神分裂症相关的行为、神经及免疫学改变8-11。我们先前的研究表明，MIA子代表现出行为异常（例如，&#160;社交障碍、沟通缺陷、重复行为、类焦虑行为以及潜伏抑制缺陷8,10,12）、免疫失调和细胞因子失衡8,13,14、胎儿脑基因表达改变15、小脑第VII叶小脑浦肯野细胞丢失11、海马突触特性改变9、基因与环境相互作用13、肠道通透性改变以及肠道微生物组成变化16。此外，该模型系统还被用于开发治疗性和预防性策略13,16,17。在E12.5诱导MIA后，其他研究也发现MIA可导致胎儿小胶质细胞活化以及基底前脑胆碱能系统的发育改变18、品系特异性相互作用19、大脑突触体超微结构异常、脑线粒体呼吸链功能亢进异常、脑突触体分子下调17、类抑郁行为、认知功能受损和海马长时程增强（LTP）障碍，以及成年海马神经发生缺陷20。
本文详细介绍了如何在E12.5时期通过聚肌胞苷酸（poly(I:C)）诱导母体免疫激活（MIA），以及如何应用该模型研究自闭症和精神分裂症病因的实验范式。需要注意的是，MIA是多种疾病的风险因素4，其结果对诱导的时间、方法以及妊娠母鼠的饲养管理极为敏感。因此，不同实验室之间即使存在微小的差异，也常常导致子代结果的可重复性低和/或表型不同。本方法专为致力于研究MIA作为自闭症和精神分裂症环境风险因素的科研人员设计，所提供的详细操作描述将有助于提高研究数据的可重复性。

<table><tbody><tr><td>聚肌苷酸&amp;ndash;聚胞苷酸钾盐</td><td>SIGMA</td><td>P9582</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠注射液 USP</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT 胰岛素注射器 3/10 ml 29 G x 1/2&quot;</td><td>COVIDIEN</td><td>8881600145</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形螺口管</td><td>USA SCIENTIFIC</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1000</td><td>可选</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>M5A</td><td>可选</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子，不锈钢尖端，尺寸 0.10 × 0.06 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td>可选</td></tr><tr><td>RNAlater RNA稳定试剂</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>可选</td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026&amp;nbsp;</td><td>可选</td></tr><tr><td>RQ1 无RN酶的DNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td>可选</td></tr><tr><td>iScript cDNA合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td>可选</td></tr><tr><td>FastStart universal SYBR green master mix with ROX&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>4913922001</td><td>可选</td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR</td><td>ABI</td><td>7300</td><td>可选</td></tr><tr><td>引物：Il6 正向</td><td>Life Technologies</td><td>TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC</td><td>可选</td></tr><tr><td>引物：Il6 反向</td><td>Life Technologies</td><td>TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC</td><td>可选</td></tr><tr><td>引物：β-actin 正向</td><td>Life Technologies</td><td>AGAGGGAAATCGTGCGTGAC</td><td>可选</td></tr><tr><td>引物：beta-actin 反向</td><td>Life Technologies</td><td>CAATAGTGATGACCTGGCCGT</td><td>可选</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 96 孔反应板</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td>可选</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘性封膜&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4311971</td><td>可选</td></tr><tr><td>EthoVision</td><td>Noldus</td><td>EthoVision</td><td>可选</td></tr><tr><td>SR-LAB装置（PPI）</td><td>圣迭戈仪器公司&amp;nbsp;</td><td>SR-LAB</td><td>可选</td></tr><tr><td>弹珠</td><td>PENN-PLAX</td><td>蓝色宝石弹珠</td><td>可选</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Life Technologies</td><td>21600-069</td><td>可选</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>MACRON</td><td>2621-59</td><td>可选</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td>可选</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>可选</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>可选</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma</td><td>18312</td><td>可选</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td>可选</td></tr><tr><td>兔抗钙结合蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11426</td><td>可选</td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗兔IgG抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td>可选</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC 试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>可选</td></tr></tbody></table>

使用病毒模拟物聚胞苷酸在妊娠中期诱导小鼠母体免疫激活

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

母体免疫激活（MIA）模型作为一种模拟多种精神疾病环境风险因素的啮齿类动物模型，日益受到重视。大量研究表明，MIA模型在自闭症和精神分裂症相关研究中具有良好的表型效度、构念效度和预测效度。为了建立MIA模型，研究人员通常使用病毒模拟物——聚胞苷酸：聚肌苷酸（poly(I:C)）来激活妊娠期啮齿类动物的免疫系统。一般而言，经免疫激活母体所产的子代会表现出与自闭症和精神分裂症相关的行为异常和生理改变。然而，不同剂量和不同时间点注射poly(I:C)可能在脑发育的不同阶段产生干扰，从而导致不同的结果。本文提供了一种在妊娠中期胚胎12.5天（E12.5）通过腹腔（i.p.）注射20 mg/kg poly(I:C)诱导MIA的详细方法。该方法已被证实可在母体-胎盘-胎儿轴线上引发急性炎症反应，最终导致与自闭症和精神分裂症相关的大脑功能紊乱及行为表型。

在E12.5时注射20 mg/kg聚肌胞苷酸（poly(I:C)）可诱发母体-胎盘-胎儿轴的急性炎症反应，并引发对脑发育和行为表型的慢性影响12,13. 促炎性细胞因子白细胞介素（IL）-6水平升高是MIA后急性炎症反应的可靠指标。其峰值时间 Il6 胎盘和胎儿大脑中的基因表达在注射聚肌胞苷酸（poly(I:C)）后3小时进行检测12,13我们已证明，poly(I:C) 可诱导出更高的 Il6 母体脾脏-胎盘-胎儿大脑间的基因表达图5）（数据改编自 Wu 等, 2015)13研究人员可将此范式与其他治疗方法相结合，以研究可能改变MIA后急性炎症反应的因素， 例如， 母体饮食、遗传突变小鼠、抗炎药物 等等.
另一方面，行为学改变也是母体免疫激活（MIA）模型的重要特征...

母体免疫激活（MIA）是自闭症和精神分裂症环境风险因素的一种模型。本文旨在提供在妊娠小鼠中诱导MIA的逐步操作流程，以提高该模型的可重复性。

母体免疫激活（MIA）模型作为一种模拟多种精神疾病环境风险因素的啮齿类动物模型，其重要性日益受到认可……

本实验的总体目标是通过在妊娠中期胚胎阶段对小鼠进行腹腔注射病毒模拟物poly，诱导母体免疫激活（MIA）。该方法有助于我们回答神经免疫学领域的关键问题，例如，免疫功能障碍如何导致大脑发育和行为的异常。该技术的主要优势在于，它专为研究MIA作为自闭症和精神分裂症环境风险因素的研究人员而设计。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为MIA诱导方法中的微小差异可能会显著改变子代的下游反应。为建立定时交配组合，首先将五只雌性小鼠按每笼五只分组，相邻放置于标准小鼠笼中，以同步其动情周期，并使用耳标标记每只动物。在黑暗周期开始前0至2小时，将雌性小鼠按每笼两只分组，称重并记录每只小鼠的体重，然后在每笼两只雌性小鼠中加入一只雄性小鼠。在暗周期结束后的0至4小时内，轻轻抓住每只雌性小鼠尾根部，使其前肢能够抓住笼具网格，检查阴道口是否存在白色团块。若未明显观察到阴栓，可轻轻将200微升移液器吸头插入阴道口。若感到凝固物阻力，则表明已形成阴栓。将发现阴栓的小鼠分组放入新笼中，因为阴道栓的存在仅能确认已发生交配行为。在胚胎发育第10.5至11.5天，抓住每只带有阴栓的雌性小鼠尾根部将其提起，观察腹部是否有隆起，随后称量小鼠体重以确认是否怀孕，并将确认怀孕的动物单独饲养在清洁的笼具中。在50毫升锥形管中称取聚(I:C)粉末。在胚胎发育第12.5天，将适量的0.9%氯化钠溶液加入含有聚(I:C)的锥形管中，盖紧管盖。轻轻滚动盐水液滴，使其覆盖粉末，直至溶液澄清。然后离心该管，将聚(I:C)溶液转移至微量离心管中。使用分光光度计测量聚(I:C)溶液的260与280 nm处吸光度比值。该比值应介于1.54至1.82之间，具体如制造商所述。随后，称量第一只小鼠的体重，并根据计算出的相应体积，用胰岛素注射器（0.3 毫升）吸取聚(I:C)溶液。然后，抓住小鼠尾巴将其提起，将其固定在笼盖上，并捏住其颈部皮肤。现在将针头斜面朝上，与小鼠体表呈约20度角，插入两个上部乳头中心位置，注射聚肌胞苷酸（poly(I:C)）溶液。随后将小鼠放回笼中。在完成所有小鼠的注射后，将笼子安置在安静且人员走动较少的房间内，以避免其他干扰因素，并于次日早晨称量小鼠体重。在行为学测试前至少三天，更换8至12周龄成年母体免疫激活（maternal immune activation，MIA）后代的小鼠笼具垫料。测试前30分钟，将小鼠置于测试房间内进行环境适应。进行脉冲前抑制测试时，将小鼠固定在压电传感器上方的有机玻璃圆筒内。让小鼠在脉冲前抑制测试舱中适应五分钟，期间给予六次120分贝的白噪声刺激。随后，按照表格中列出的方案，对小鼠施加随机混合的声音刺激，并将其反应与基线惊跳反应进行比较，以确定母体免疫激活（MIA）动物的脉冲前抑制效应。进行旷场实验时，将小鼠放置在开放方形旷场的一个角落，旷场内设有明确划定的17厘米×17厘米中心区域，通过安装在顶部的摄像头记录小鼠10分钟内的运动轨迹。随后量化小鼠进入中心区域的次数以及在中心区域停留的时间。进行弹珠埋藏实验时，先让小鼠在装有5厘米厚压缩白杨木屑垫料的实验笼中适应10分钟，然后将小鼠放回其居住笼中，并在实验笼内将20颗深蓝色、直径1.5厘米的玻璃弹珠以4行×5列的网格形式轻轻摆放整齐。现在将小鼠放回测试笼中10分钟，然后将其放回饲养笼中，并记录在测试期间被掩埋的弹珠数量。在胚胎第12.5天注射聚肌胞苷酸（Poly(I:C)）可引发母体-胎盘-胎儿轴的急性炎症反应，并对大脑发育和行为表型产生慢性影响。事实上，注射Poly(I:C)后3小时，母体脾脏、胎盘和胎儿大脑中的Il6基因表达水平显著升高。通常情况下，与生理盐水处理的成年子代相比，母体免疫激活（MIA）成年子代在开放旷场实验中表现出更少的中心区域进入次数和更短的中心区域停留时间。聚肌胞苷酸（poly(I:C)）注射动物在弹珠埋藏实验中也表现出更频繁的埋藏行为，并且前脉冲抑制水平较低。小脑第七叶浦肯野细胞的丢失是MIA子代的另一显著特征，与生理盐水注射对照组动物相比，这些动物的小脑第七叶中钙结合蛋白阳性浦肯野细胞数量更少。在进行该操作时，重要的是要注意在MIA诱导后不要干扰怀孕的小鼠。之后，可诱导产后应激或感染等其他因素，以研究额外的环境相互作用。

induction-maternal-immune-activation-mice-at-mid-gestation-stage-with

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

母体免疫激活诱导小鼠的病毒性模仿聚妊娠中期阶段（I：C）

来源： Lutz, D., et al. 在子宫内转导发育中小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估。 J. Vis. Exp.

子宫内小鼠病毒转导

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使用 体内 利用成像技术监测新生小鼠巨细胞病毒感染进展

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一种用于研究急性绒毛膜羊膜炎对新生儿肠道发育影响的小鼠母体炎症致胎儿暴露模型

母体感染是神经发育障碍的一个风险因素。母体免疫激活（MIA）的小鼠模型有助于阐明感染对大脑发育和功能的影响。本文提供了通用指南和一项实验方案，用于稳定地产生对MIA具有抗性或易感性的子代小鼠。...

使用聚胞苷酸（Poly(I:C)）建立可重复的中期妊娠母体免疫激活模型以研究子代的易感性与韧性

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本文提供了一种全面的方案，用于建立母体免疫激活（MIA）小鼠模型，以研究妊娠早期炎症对神经发育的影响，包括确保实验可靠性和可重复性的关键指标。...

建立早孕期母体免疫激活小鼠模型以评估产前炎症对神经发育的影响

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