培养人多能性和神经干细胞的基本和临床前研究一个封闭的细胞培养系统

使用该设备的总体目标是在规定的大气条件下以最大的无菌性培养干细胞。我们今天要演示的是封闭式细胞培养设施的使用，该设施可以对细胞培养参数进行精细控制。在我们的实验室中，我们正在使用该设施来培养多能干细胞和多能干细胞。

这种方法的主要优点是，在处理细胞时，无论它们位于何处，它们都会暴露在恒定的环境中。无论是作细胞，还是在培养箱中或在显微镜上作，它们在整个周期中都暴露在温度恒定的氧气 CO2 中。演示该程序的是我实验室的科学家 Alexander Stover。

要开始此过程，请单击模块以调整气体浓度。在显示当前设置的新窗口中，单击 Setpoint 下方的现有氧气设定值，然后输入此模块所需的氧气浓度。接下来，单击绿色复选标记以确认设定值。

对二氧化碳重复此状态，并为除缓冲室外的所有模块输入 5% 二氧化碳的设定值，缓冲室只能调节氧气。然后，监测标记为"过程值"的当前气体浓度，以确保它们达到新的设定值。然后，将所有模块的气体设定值调整到适当的值。

匹配将相互暴露的腔室的二氧化碳和氧气水平。例如，在打开在 5% 氧气下培养细胞的培养箱之前，将工艺室调整为 5% 氧气。此外，将用于将物品添加到工艺室中的缓冲室调整为 5% 氧气。

随后，使用相同的屏幕将工艺室的温度设置为 37 摄氏度以进行气体调整。之后，将工艺室地板温度设置为 37 摄氏度。单击每个培养箱下方的孵化模块组，并将组的温度调整到 37 摄氏度。

在层流罩中，用 70% 乙醇喷洒所有进入系统的材料，并让它们干燥。用浸有 70% 乙醇的无菌纱布海绵轻轻擦拭任何烧瓶或细胞板。接下来，确保缓冲室的外门和内门都已牢固关闭，然后打开外门并将物品放入其中，然后再关闭。

使用软件，选择缓冲液模块，然后单击 Dilution Factor（稀释因子）选项卡。在 Log Factor（对数因子）框中输入 1，然后单击 start（开始）。图形界面停止闪烁稀释因子后，打开缓冲室的内门，将材料转移到工艺室。

为了从工艺室中取出物品，首先确保缓冲液室已经过稀释因子。然后，打开内门，将要移除的物品放入其中，然后关闭。之后，打开外门并取出物品。

将三个培养皿放入每个培养箱底部的水盘中。用无菌水填充这些培养皿并保持这些培养皿中的水位，因为它们对于维持培养箱中的相对湿度设定值至关重要。在图形界面中，单击 incubator。

随后，单击设定点下的现有相对湿度值并输入 85%然后，单击绿色复选标记以接受此值。接下来，将缓冲液室、工艺室和培养箱调整到所引入的细胞类型所需的气体设定点。用无菌纱布和不易燃的消毒剂（如苯扎氯铵基产品）清洁工艺室的表面。

然后，清洁手套和经常接触的表面，例如门把手。随后，用 70% 乙醇清洁层流罩和缓冲室的表面并使其干燥。之后，将培养瓶或细胞板放入通风橱中，并用浸有乙醇的无菌纱布海绵短暂擦拭其外表面。

然后，将培养瓶或板放入缓冲液室中，并运行稀释因子。完成后，立即将培养瓶或板转移到适当的培养箱中。由于培养箱位于工艺室的后部，因此将搁板拉出到工艺室中进行细胞放置，并避免不必要地长时间打开培养箱门。

在此步骤中，准备细胞培养基。将培养基容器稍微打开盖子 20 分钟，让培养基与系统内的二氧化碳和氧气水平保持平衡。然后，从孔中取出旧培养基。

对于多能干细胞，去除几乎所有的旧培养基，并保留少量的旧培养基，以防止在补料过程中干燥。对于神经干细胞，去除一半的旧培养基。然后，向细胞培养板中加入新鲜培养基，并将板放回指定的培养箱中。

此处显示的是 iPSC 的图像。以下是用 AF594 标记的试验 160 活染色的 iPSC，在培养基中稀释 1 至 100。所有 iPSCs 均在细胞生产设施中用 5% 氧气与仙台病毒转导。

这是 iPSC 衍生的神经干细胞的相差图像，这些细胞在腔室载玻片中以 5% 氧气生长。然后将细胞固定在 4% 多聚甲醛中，并用抗人 Nestin 一抗和 Alexa Fluor 488 二抗染色。一旦掌握，如果执行得当，这套技术可以在两个小时内完成。

在尝试此过程时，请务必记住在开始之前正确设置气体浓度。按照该程序，可以执行其他方法，如重编程和分化，以回答其他问题，例如缺氧对多能性或多能性的影响。该技术发展后，为干细胞生物学领域的研究人员探索临床细胞生产治疗儿科神经退行性疾病铺平了道路。