Name: 使用酶法，化学（甲基化）和物理（质谱，核磁共振）技术，植物墙Heteroxylans测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学习使用酶法、甲基化和质谱及核磁共振技术对植物细胞壁heteroxylans进行测序分析。该方法结合2-aminobenzamide标记与内切木聚糖酶水解，可解析多糖还原端及内部糖基序列的精细结构。

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本项目得到了联邦科学与工业研究组织旗舰合作研究计划的资金支持，该资金通过食品未来旗舰计划提供给高纤维谷物研究团队。AB 还感谢澳大利亚研究理事会（ARC）对植物细胞壁卓越研究中心（CE110001007）提供的资助。

1. 使用2-氨基苯甲酰胺（2AB）标记水溶性阿拉伯木聚糖（W-sol AXs）的还原端糖残基
<ol>
	<li>将W-sol AXs与2AB（0.2 M）在1 M NaBH3CN（氰基硼氢化钠）存在下于pH 5.5条件下在65 °C孵育2小时，以将多糖主链的还原端转化为其荧光衍生物。 
	注意：以下步骤应在通风橱中进行，因为NaBH3CN在接触水时会释放有毒的氰化物气体。
	<ol>
		<li>称取NaBH3CN（62.8 mg），溶于1 ml水中，置于1.5 ml微量离心管中，配制1 M NaBH3CN溶液。将2AB试剂（27.2 mg）溶于1 M NaBH3CN溶液（1 ml）中，在65&#160;°C加热溶解，并用10%乙酸将反应混合物（0.2 M 2AB，1 M NaBH3CN）的pH调节至5.5。</li>
		<li>在带盖玻璃管中，向W-sol AXs（1 mg）加入200 µl反应混合物（0.2 M 2AB，1 M NaBH3CN），使用涡旋混合器混匀。在通风橱中于65&#160;°C孵育2小时。将悬浮液冷却至室温&#160;，加入4倍体积的无水乙醇。</li>
		<li>将悬浮液置于4 °C冰箱中过夜（O/N），以沉淀多糖。</li>
		<li>离心（1,500 × g，10分钟，室温）去除上清液。用无水乙醇（4次）、丙酮（1次）和甲醇（1次）反复洗涤沉淀，每次洗涤后均进行离心。在40 °C下真空干燥过夜。 
		注：充分洗涤也可去除残留的2AB。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 由2-AB标记的W溶性AXs制备木寡糖
<ol>
	<li>在微量离心管（1.5 ml）中，将2AB标记的W-sol AXs（1 mg）溶解于500 µl醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 5）中。加入4单位的内切木聚糖酶（GH 11，[M1]），在37&#160;°C下孵育16小时。</li>
	<li>将反应混合物置于沸水浴中加热10分钟以灭活酶活性。冷却悬浮液至室温，转移至带盖玻璃管中。加入4倍体积的无水乙醇，将悬浮液置于4 °C冰箱中过夜&#160;，以沉淀未消化的多糖。</li>
	<li>离心（1,500 × g，10分钟，室温）以分离未消化的多糖（沉淀）和内切木聚糖酶生成的木寡糖（上清液）。将上清液倾入洁净的玻璃管中，并置于40 °C温水浴中。</li>
	<li>在氮气流下蒸发乙醇至终体积约500 µl。将上清液在-80 °C冷冻4小时，随后在冷冻干燥机中干燥冷冻样品，以回收木寡糖。</li>
</ol>
3. 从KOH可溶性阿拉伯木聚糖制备木寡糖及2AB标记
<ol>
	<li>按照上述方法（第2.1-2.4节），用内切木聚糖酶（GH 11，[M1]）处理KOH可溶性阿拉伯木聚糖（KOH-sol AXs），以生成木寡糖。</li>
	<li>按照上述方法（第1.1.1-1.1.2节），将来自KOH可溶性阿拉伯木聚糖（KOH-sol AXs）经内切木聚糖酶处理所得的木寡糖与2AB反应液（0.2 M 2AB，1 M NaBH3CN）进行反应。</li>
	<li>将上清液倾入洁净的玻璃试管中，并置于40 °C温水浴中。用氮气流吹干乙醇，浓缩至终点体积（约500 µl）。于-80 °C冷冻上清液4小时，随后在冷冻干燥机中干燥冷冻样品，以回收木寡糖。</li>
</ol>
4. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）
<ol>
	<li>基质辅助激光解吸电离（MALDI）基质溶液的制备
	<ol>
		<li>将少量2,5-二羟基苯甲酸（DHB）加入含有0.1%甲酸的50%乙腈溶液（500 ml）中，置于离心管内（即MALDI基质溶液）。使用涡旋振荡器混匀；若DHB迅速溶解，则再加入另一小勺。注意：理想的MALDI基质溶液浓度为10 µg/µl-1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MALDI靶板的制备
	<ol>
		<li>将水相寡糖（天然）样品（5–10 µg）（W-sol和/或KOH-sol）点样至MALDI靶板上。使用新的枪头加入0.3 µl MALDI基质溶液，并通过反复吹打混匀。于室温下自然干燥。 
		注意：干燥良好的样品应形成细长针状晶体，且晶体朝向点样区域中心聚集。若样品残留黏性或呈 smear 状，可能因样品浓度过高或含有盐分；此类样品通常难以获得良好质谱信号，需进一步纯化。</li>
		<li>将靶板插入质谱仪离子源，设置为正离子（+ive）模式。调节离子源1的加速电压为19.0 kV，离子源2为16.3 kV。将激光能量调至70%以上。在MALDI靶板上选择样品点，点击“开始”以启动激光扫描。 
		注意：靶板上并非所有区域均可产生信号。某一特定位置通常仅在数次激光照射后即不再出峰，原因可能是样品/基质混合物耗尽或晶体特性所致。
		<ol>
			<li>在数据采集过程中移动激光至靶板不同区域，平均采集约200次随机谱图，以获得满意的信噪比。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. ESI-QTOF-MS
<ol>
	<li>使用纳米高效液相色谱（nano-HPLC）联用配备在线反相C-18色谱柱（75 µm x 150 mm；3.5 µm 填料粒径）的电喷雾离子化（ESI）四极杆飞行时间（QTOF）质谱仪，分析内切木聚糖酶生成的寡糖（天然状态）。
	<ol>
		<li>将内切木聚糖酶反应生成的水相寡糖混合物转移至进样瓶中，并置于HPLC自动进样器内。设定洗脱梯度程序：流动相A为含0.1%（v/v）甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液，梯度从5% B升至80% B，历时60分钟。</li>
		<li>调节流速至0.2 µl/min。在正离子模式下设置质谱扫描范围为300–1,600 m/z，扫描速率为0.5次/秒，ESI离子源参数如下：帘气（curtain gas）为10，气源1（GS1）为4，源温100 °C，离子喷雾电压2,300 V，去簇电位50 V。运行LC色谱程序以洗脱寡糖。所得总离子流色谱图（TIC）由软件自动保存。</li>
		<li>打开已保存的TIC图谱，选择提取离子色谱图功能。在命令行中输入预期质荷比（例如，271、403、535、667、799 和 931 m/z），按回车键进行扫描。根据仪器制造商的操作说明14，使用配套软件处理ESI-QTOF MS色谱图数据中的选定离子扫描结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 电喷雾电离质谱n
<ol>
	<li>使用注射器将1至2 µl溶于50%乙腈中的全-O-甲基化寡糖样品（甲基化方法参照Pettolino et al.1所述）注入纳米喷雾尖端。使用玻璃切割器修剪纳米喷雾尖端，使其适配质谱仪上连接的独立纳米喷雾支架。</li>
	<li>根据预期质量范围（200–1,500 m/z）设定质量，将帘气设为10，离子喷雾电压设为1,900 V，极性设为正。</li>
	<li>按下采集按钮以打开相应窗口，输入数据文件名，获取总离子流图（ESI-MS1），然后按下停止按钮。</li>
	<li>将扫描类型从产物离子扫描更改为对目标峰进行碎裂。输入待碎裂的目标质量（例如，885 m/z），并调整质量范围（200–900 m/z）。按下采集按钮，并在化合物选项卡中调节碰撞能量（升高和/或降低），以实现母离子（885 m/z）的完全碎裂，并采集碎片离子扫描图谱（ESI-MS2）。</li>
	<li>输入目标碎片离子的质量（例如，711 m/z），并调整质量范围（200–720 m/z）。按下采集按钮，并调节碰撞能量，以实现前体离子（711 m/z）的完全碎裂，采集碎片离子扫描图谱（ESI-MS3）。</li>
</ol>
7. 1H 核磁共振波谱法
<ol>
	<li>将内切木聚糖酶反应生成的寡糖混合物（KOH 溶液，天然形态）（约 500 µg）溶解于 D2O（1.0 ml，99.9%）中，置于塑料离心管（15 ml）内。在 -80 °C 冷冻 4 小时，随后在冷冻干燥机中干燥冷冻样品，以回收木寡糖。</li>
	<li>重复步骤 7.1 两次，以确保完全将 H2O 置换为 D2O。</li>
	<li>将干燥后的寡糖溶解于 D2O（0.6 ml，99.9%）中，并加入 0.5 µl 丙酮（5% 的 D2O 溶液）作为内标。将氘代寡糖转移至核磁共振（NMR）样品管中。</li>
	<li>用手握住装有样品的 NMR 管顶部，将其插入塑料转子中。将转子放入样品深度规中，上下推动样品管以调节其深度，确保样品顶部与底部深度规的中心线对齐。</li>
	<li>取出深度规，将样品插入配备低温探头的 600 MHz NMR 波谱仪的自动进样器中。</li>
	<li>登录并打开波谱仪控制软件。输入样品文件名。打开一个已有数据集，然后使用 &#34;edc&#34; 命令将其另存为新名称。输入样品在自动进样器中的位置编号，然后按下 &#34;ENTER&#34; 键。 
	注意：按下 &#34;ENTER&#34; 键后，样品管将被轻柔地送入磁体孔道，并定位在探头顶部。</li>
	<li>在命令行中输入 &#34;edte&#34; 以设定所需样品温度。在进入下一步前，等待样品温度达到设定值。在命令行中输入 &#34;lock&#34;，并选择合适的溶剂（D2O）。等待窗口底部出现 &#34;lock finished&#34; 提示信息。</li>
	<li>在命令行中输入 &#34;atmm&#34;，然后点击 atmm 菜单栏顶部的 &#34;optimize&#34; 按钮。选择“start”以对选定通道（本实验为 1H）进行探头调谐与匹配。</li>
	<li>在命令行中输入 &#34;topshim&#34; 以开始匀场过程，该过程通过微调磁场，使样品周围磁场均匀化。在命令行中输入 &#34;zg&#34; 并回车，以采集信号。</li>
	<li>按照制造商说明，使用软件15 分析谱图，其中 1H 化学位移以丙酮内标（2.225 ppm）为参考。</li>
</ol>

<ol><li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).</li>
<li>Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reducing+end+sequence+of+wheat+endosperm+cell+wall+arabinoxylans%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans.</a> Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).</li>
<li>Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBacic%2C+A+%22The+Biochemistry+of+Plants%2C+Vol.+14%2C+Carbohydrates%22">The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates</a>. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).</li>
<li>York, W. S., O'Neill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+control+of+xylan+biosynthesis+-+which+end+is+up%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up?</a> Plant Biol. 11, 258-265 (2008).</li>
<li>Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolutionary+times+in+our+understanding+of+cell+wall+biosynthesis+and+remodeling+in+the+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses.</a> Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).</li>
<li>Faik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylan+Biosynthesis%3A+News+from+the+Grass%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xylan Biosynthesis: News from the Grass.</a> Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).</li>
<li>Scheller, H. V., Ulskov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemicelluloses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Hemicelluloses.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).</li>
<li>Bacic, A., Stone, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%281%E2%86%923%29-+and+%281%E2%86%924%29-linked+%CE%B2-D-glucan+in+the+endosperm+cell-wall+of+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat.</a> Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).</li>
<li>Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+soluble+and+insoluble+cell+wall+fractions+from+rye%2C+wheat+and+hull-less+barley+endosperm+flours%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Hydrocolloids%22%5BJournal%5D)">Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours.</a> Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).</li>
<li>Pena, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+irregular+xylem8+and+irregular+xylem9%3A+Implicationsfor+the+Complexity+of+Glucuronoxylan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis.</a> Plant Cell. 19, 549-563 (2007).</li>
<li>Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+reducing+end-groups+in+Spruce+xylan%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan.</a> Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).</li>
<li>Mazumder, K., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+arabinoxylans+isolated+from+ball-milled+switchgrass+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass.</a> Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).</li>
<li>Kulkarni, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+of+land+plants+to+synthesize+glucuronoxylans+predates+the+evolution+of+tracheophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiol%22%5BJournal%5D)">The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes.</a> Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Agilent+MassHunter+Workstation+Software+-+Quantitative+Analysis+Familiarization+Guide%22">Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide</a>. , Agilent Technologies. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf</a> (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Topspin+User+Manual%22">Topspin User Manual</a>. , Bruker. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf ">http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf </a> (2010).</li>
<li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+nomenclature+for+carbohydrate+fragmentation+in+FAB-MS%2FMS+spectra+of+glycoconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate.+J%22%5BJournal%5D)">A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates.</a> Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).</li>
<li>Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+by+1H-n.m.r.+spectroscopy+of+oligosaccharides%2C+derived+from+arabinoxylans+of+white+endosperm+of+wheat%2C+that+contain+the+elements+----4%29%5Balpha-L-Araf-%281----3%29%5D-beta-D-Xylp-%281----+or+----4%29%5Balpha-+L-Araf-%281----2%29%5D%5Balpha-L-Araf-%281----3%29%5D-beta-D-Xylp-%281----%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----.</a> Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).</li>
<li>Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+by+1H+NMR+spectroscopy+of+enzymically+derived+oligosaccharides+from+alkali-extractable+wheat-flour+arabinoxylan%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan.</a> Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).</li>
<li>Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+enzymatic+cleavage+of+cellulose+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+%28PACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

大多数基质相细胞壁多糖的骨架上似乎随机地连接了糖基和非糖基残基，其结构高度可变，具体取决于植物种类、发育阶段和组织类型3。由于多糖是基因的次级产物，其序列并非由模板决定，因此目前尚无类似于核酸和蛋白质测序的单一分析方法可用于多糖测序。特异性识别糖苷键的水解酶的获得为多糖研究提供了有力工具，可将多糖降解为寡糖，随后通过色谱法进行分离；当与化学和物理技术结合使用时，可实现寡糖的完全测序。接下来的挑战在于如何将这些复杂的混合物重新组装成原始的多糖序列——这一难题至今尚未被成功解决。
本文描述了一种可变顺序应用的方法，该方法结合了已建立的酶法、化学和物理技术，用于表征杂合木聚糖还原端（RE）及内部区域的糖基序列。另一种未在此详述但已被证明对寡糖表征非常有用的技术是PACE（多糖碳水化合物凝胶电泳分析），由Dupree19团队开发，若具备相应设备，可轻松整合到本方案中。此外，液相色谱（LC）的变通方法也可能具有实用性，例如串联在线亲水相互作用色谱（HILIC）后接反相色谱（RP），可在单一步骤中实现未标记/已标记寡糖的分离。该方法依赖于在木聚糖链还...

异源木聚糖是一类多糖，是禾本科植物初生细胞壁以及所有被子植物次生细胞壁中主要的非纤维素多糖3-6。木聚糖骨架上的取代基类型和取代模式因组织类型、发育阶段和物种的不同而有所差异，这些取代基包括糖基类（葡萄糖醛酸（GlcA）、阿拉伯糖（Araf））和非糖基类（O-乙酰基、阿魏酸）残基7。
小麦（Triticum aestivum L.）胚乳细胞壁主要由阿拉伯木聚糖（AXs）（70%）和（1→3）（1→4）-β-D-葡聚糖（20%）组成，纤维素和杂合甘露聚糖含量较少（各占2%）8。木聚糖主链可呈现不同程度的取代状态，主要为未取代、单取代（主要在O-2位，其次为O-3位）以及双取代（O-2和O-3位），取代基为α-L-阿拉伯呋喃糖（Araf ）残基9。双子叶植物（例如拟南芥（Arabidopsis thaliana））10和裸子植物（例如云杉（Picea abies））11来源的杂合木聚糖的还原端（RE）含有一个特征性的四糖糖基序列：-β-D-Xylp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-GalpA-(1→4)-D-Xylp。为了理解杂合木聚糖的生物合成及其功能（生物学和工业应用），完整测定木聚糖主链的序列至关重要，这有助于明确取代基的类型与分布模式，以及还原端（RE）的序列结构。
本文描述了用于表征杂合木聚糖还原端（RE）及内部区域糖基序列的特定技术。这些技术依赖于在酶解（内切木聚糖酶）之前，用荧光标记物（2-氨基苯并酰胺（2AB））对杂合木聚糖链的还原端（RE）进行标记。该方法最初由York实验室报道10,12-13，主要用于还原端测序，现已被扩展至包括内部区域测序，并结合了多种成熟技术，适用于所有来源的杂合木聚糖。该方法也可应用于其他多糖类别，前提是存在相应的内切水解酶。
在本研究中，将脱淀粉的小麦胚乳细胞壁分离为酒精不溶性残渣（AIR），并依次用水（W-sol Fr）和含1% NaBH₄的1M KOH进行提取。4 （KOH-溶 Fr），如 Ratnayake 所述 等 (2014)2从W-和KOH-可溶性Frs中释放的寡糖随后进行甲基化处理，并结合MALDI-TOF-MS、ESI-QTOF-MS联用HPLC以及在线反相C-18柱色谱分离和ESI-MS，对天然状态及甲基化后的寡糖进行详细的结构分析。n采用核磁共振（NMR）对经内切木聚糖酶消化的KOH可溶性阿拉伯木聚糖进行了表征。

<table><tbody><tr><td>2-氨基苯甲酰胺 (2AB)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A89804</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠 (NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>247677</td><td>危险品，请小心操作</td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠 (NaBH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CN)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>156159</td><td>危险品，请小心操作</td></tr><tr><td>内切-1,4-&amp;beta;-木聚糖酶 M1（源自绿色木霉）(120101a)</td><td>Megazyme (www.megazyme.com)</td><td>E-XYTR1</td><td></td></tr><tr><td>重水 (D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机 (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>反相 C18 Zorbax Eclipse Plus 色谱柱&amp;nbsp;</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td></td><td>(2.1&amp;times;100 mm；1.8 &amp;micro;m 填料粒径)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MicroFlex MALDI-TOF 质谱仪&amp;nbsp;&amp;nbsp;（型号：MicroFlex LR）</td><td>(Bruker Daltonics, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ESI) -(QTOF) 质谱仪&amp;nbsp;&amp;nbsp;（型号 # 6520）</td><td>(Agilent, Palo Alto, CA )</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MS&lt;sup&gt;n &lt;/sup&gt;&amp;nbsp;-离子阱&amp;nbsp;（型号 # 1100 HCT）</td><td>(Agilent, Palo Alto, CA)。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 600 MHz 核磁共振波谱仪</td><td>Bruker Daltonics, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topspin（版本 3.0）-Biospin- 软件&amp;nbsp;</td><td>Bruker&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，型号 # 7890B）</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用酶法、化学（甲基化）及物理（质谱、核磁共振）技术测定植物细胞壁杂聚木聚糖序列

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

本实验方案描述了用于表征杂合木聚糖还原端（RE）及内部区域糖基序列的特定技术。按照Ratnayake et al.（2014）2所述方法，将脱淀粉的小麦胚乳细胞壁分离为醇不溶性残渣（AIR）1，并依次用水（W-sol Fr）和含1% NaBH4的1 M KOH（KOH-sol Fr）进行连续提取。采用两种不同的方法（见图1中的总结）。第一种方法中，将完整的W-sol AXs用2AB处理，以标记原始的还原端主链糖残基，随后用内切木聚糖酶处理，分别生成带有2AB标记的还原端和内部区域的还原性寡糖混合物。第二种方法中，先用内切木聚糖酶水解KOH-sol Fr，生成寡糖混合物，再用2AB进行标记。从W-sol Fr和KOH-sol Fr中经酶解释放的（已标记或未标记）寡糖随后进行甲基化处理，并结合使用MALDI-TOF-MS、RP-HPLC-ESI-QTOF-MS和ESI-MSn对天然及甲基化后的寡糖进行详细的结构分析。此外，对经内切木聚糖酶消化的KOH-sol AXs还采用核磁共振（NMR）进行表征，以获得有关异头构型的信息。这些技术也可通过使用适当的内切水解酶应用于其他类别的多糖研究。

内切木聚糖酶消化2AB标记的W-可溶性AXs，产生一系列2AB标记的还原端（RE）寡糖和一系列未标记（无2AB标记）的来自木聚糖链内部区域的寡糖混合物（图1；来自Ratnayake et al.2）。随后采用一系列色谱方法对这一复杂的异构体混合物进行分级分离。最后利用质谱（MS）技术鉴定异构体结构，并通过MSn技术进行序列分析。本文展示的是该方法的一个代表性而非全面性的示例。
2AB 标记的天然 W-sol AXs 衍生的寡糖在 MALDI-TOF-MS 谱图中（图 2A）显示出一系列丰度很高的准分子离子峰，其 m/z 值分别为 701、833 和 965，代表含有 5–7 个戊糖基残基（P5-7）的未标记中性内部区域寡糖序列。在 m/z 745、877 和 1009...

本方案描述了通过在酶解（内切木聚糖酶）前用2-氨基苯甲酰基标记还原端（RE），然后利用质谱（MS）和核磁共振（NMR）分析产生的寡糖，从而对异木聚糖的还原端及内部区域糖基序列进行结构表征的具体技术。

本方案描述了用于表征还原端（RE）及内部区域糖基序列的特定技术……

总体目标是通过标记水溶性黑麦草异木聚糖的原始还原端糖残基，并利用内切木聚糖酶处理，生成带有标记的寡糖混合物，从而表征异木聚糖还原端及内部区域的糖链序列。该方法有助于解答糖组学领域的关键问题，例如在植物生长发育过程以及非生物和生物胁迫条件下，寡糖或多糖精细结构的变化。该方法的主要优势在于，它提供了一种综合策略，可用于解析任何糖类或多糖的还原端序列以及内部区域序列。在1毫升水中配制1摩尔的氰基硼氢化钠溶液。然后，将27.2毫克2AB试剂溶解于该氰基硼氢化钠溶液中，在65摄氏度加热，并用10%乙酸调节反应混合物的pH至5.5。取200微升该反应混合物加入含有1毫克水溶性阿拉伯木聚糖的带盖玻璃管中，使用涡旋混合器混匀。在通风橱中，将样品于65摄氏度孵育两小时。孵育结束后，将悬液冷却至室温，并加入四倍体积的无水乙醇。将悬液置于低温环境中过夜，以沉淀多糖。然后，离心样品并弃去上清液。用无水乙醇、丙酮和甲醇反复洗涤沉淀，在每次洗涤之间进行离心。在40°C下真空干燥沉淀过夜。在微量离心管中，将一毫克已制备的2AB标记水溶性阿拉伯木聚糖溶解于500微升醋酸钠缓冲液中。加入4单位的内切木聚糖酶，在37摄氏度下孵育16小时。将反应混合物置于沸水浴中加热10分钟，以灭活酶活性。将悬浮液冷却至室温，转移至带盖玻璃管中。加入四倍体积的无水乙醇后，于低温环境中放置过夜，以沉淀未消化的多糖。通过离心将未消化的多糖与内切木聚糖酶生成的寡糖分离开，收集沉淀。然后，将上清液倾入干净的塑料管中，并置于温水浴中。在氮气流下将乙醇蒸发至终点体积。将上清液在-80摄氏度下冷冻4小时，随后在冷冻干燥机中对冷冻的上清液进行干燥，以回收木寡糖。如需从KO8可溶性阿拉伯木聚糖制备木寡糖并进行2AB标记，请参见文字版实验方案。制备MALDI基质溶液时，取少量DHB加入含有0.1%甲酸的50%乙腈溶液500 µL于离心管中，使用涡旋振荡器混匀。如果迅速溶解，则再加入一小勺DHB。将天然水相寡糖样品点样到MALDI靶板上。使用单独的枪头加入0.3 µL MALDI基质溶液，并通过上下吹打混合均匀。将混合物在室温下晾干。将目标板插入质谱源中，并在正离子模式下运行。将离子源一的加速电压调节至19千伏，离子源二的加速电压调节至16.3千伏。将激光功率调整至70%以上。在MALDI靶板上选择样品点，点击“开始”以启动激光照射。采用纳米液相色谱与电喷雾电离四极杆飞行时间质谱仪联用，通过反相C18色谱柱实现在线分离，分析天然内切木聚糖酶生成的寡糖产物。将内切木聚糖酶反应生成的水相寡糖混合物转移至样品瓶中，并放入HCLC自动进样器。设置洗脱梯度，在60分钟内使用流动相分别为含0.1%甲酸的水溶液和含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度从5%升至80%。运行液相色谱程序，洗脱寡糖组分。点击“添加样本”，输入样本名称，然后按“确定”按钮。选择质谱分析方法文件，点击“提交”按钮，然后开始运行样本。软件会自动保存所得的总离子色谱图（TIC）。打开已保存的TIC，选择提取色谱图功能，在命令行中输入预期的质量数。在使用软件处理选定的离子扫描之前，单击“Enter”以扫描色谱图，具体操作请遵循制造商的说明。使用注射器将一到两微升溶于50%乙腈中的O-甲基化寡糖样品注入纳米喷雾尖端。使用玻璃切割器修剪纳米喷雾尖端，使其适配连接至质谱仪的独立式纳米喷雾支架。根据预期的质量范围设置质谱参数，帘气设为10，离子喷雾电压设为1900伏特，极性设为正离子模式。按下采集按钮以打开相应窗口。然后输入数据文件名，在按下停止按钮前获取总离子扫描。将扫描类型从子离子更改为碎片扫描以分析感兴趣的片段。输入目标质量以进行碎裂，并调整质量范围。按下采集按钮，调节碰撞能量以实现母离子的完全碎裂，并采集碎片离子扫描图谱。将内切木聚糖酶反应生成的寡糖混合物溶解于10 mL塑料试管中的1 mL重水（deuterium oxide）中。将悬浮液在负80摄氏度下冷冻四小时，然后在冻干机中干燥冷冻的悬浮液以回收木寡糖。接着，将干燥的寡糖溶解于0.6毫升氘代水（deuterium oxide）中，并加入0.5微升5%丙酮氘代溶液作为内标。将氘代后的寡糖转移至核磁共振（NMR）样品管中。用手握住装有样品的核磁管顶部，将样品管插入塑料转子中。将转子放入样品深度量规中。推或拉样品管以调节样品的深度，确保样品上下深度量规的中心线对齐。取下深度规，将样品插入配备低温探头的600兆赫核磁共振波谱仪的自动进样器中。按照文本方案所述进行核磁共振实验并分析所得谱图。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）谱图中来自2AB标记的天然水溶性阿拉伯木聚糖的寡糖信号，包含一系列未标记的内部区域中性和酸性寡糖，以及最初在其还原端用2AB标记的寡糖。图中显示的是经内切木聚糖酶处理2AB标记的水溶性阿拉伯木聚糖后，所得内部区域寡糖衍生的天然寡糖的ESI截止质谱色谱图中选定离子的扫描结果。同时展示的还有以相同方式生成的还原性末端寡糖和酸性区域寡糖衍生的天然寡糖的扫描图谱。在质谱气相裂解过程中，全-O-甲基化寡糖产生的未甲基化羟基会导致14道尔顿的质量差异“标记”，该标记可用于鉴定分支模式及糖苷序列。碎片化事件产生的每条裂解峰以实线标记，因为特定质量可能对应多种异构结构。Y-离子以红色标注，B-离子以黑色标注。对全-O-甲基化还原性中性糖醇（由四个戊糖残基和木糖醇组成）在质荷比885处的电喷雾电离串联质谱图进行分析，结果表明其还原端糖链序列包含连接在还原端木糖醇残基上的阿拉伯糖侧链，和/或同时包含还原端木糖醇残基与倒数第二个木糖基残基。在完成该操作后，还可进行染色质构象捕获分析和电穿孔等其他方法，以回答抗体表位特异性及精细结构变化的快速筛选等问题。该技术建立后，为糖组学领域的研究人员探索聚糖结构特征开辟了道路，包括在不同组织类型、发育阶段和物种中聚糖或非聚糖残基的取代类型与模式。通过使用适当的内切水解酶，该方法也可应用于其他类型的多糖研究。请注意，操作金属氢化物和氰基硼氢化钠可能极为危险，进行本实验操作时，必须采取适当的预防措施，例如佩戴合适的手套，并在通风橱中操作。

sequencing-plant-wall-heteroxylans-using-enzymic-chemical-methylation

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

使用酶法，化学（甲基化）和物理（质谱，核磁共振）技术，植物墙Heteroxylans测序

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利用酶法、化学（甲基化）及物理（质谱、核磁共振）技术测定植物细胞壁杂聚木聚糖序列

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