Name: 评估抗癌药物的特异性体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习使用混合肿瘤细胞和成纤维细胞培养体系评估抗癌药物特异性。该方法通过数字PCR精确分析肿瘤细胞比例变化，为药物筛选和个性化癌症治疗提供可靠的体外遗传学工具。

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感谢Alster女士、Honrath先生和Jiang博士提供的出色技术协助。同时感谢Volz博士以及Dandri博士研究团队提供使用其数字PCR仪的机会。

1. 准备包含肿瘤细胞和非肿瘤细胞的混合培养物
<ol>
	<li>使用已建立的 MPNST S462 细胞系的肿瘤细胞5。使用成纤维细胞作为非肿瘤细胞6,7</li>
	<li>将肿瘤细胞和成纤维细胞均在标准 DMEM 培养基中培养，培养基含 10% 胎牛血清（BSA）、3 mM 谷氨酰胺、0.1 mM 2-巯基乙醇、500 U/ml 青霉素、500 g/ml 链霉素和 1 mM 丙酮酸钠，于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养5-7。在细胞达到亚汇合状态时，用 0.05% 胰蛋白酶消化收获细胞，并使用血细胞计数板进行计数。</li>
	<li>在 96 孔培养板的每孔中，将 400 个肿瘤细胞与 1,600 个非肿瘤细胞混合于 0.2 ml 培养基中。考虑到在 5 天处理期间肿瘤细胞生长较快，初始肿瘤细胞比例设定为 25%。每种药物浓度设置 4 个重复孔。于 37 °C 和 5% CO2 条件下过夜培养。</li>
</ol>
2. 药物处理
<ol>
	<li>使用尼洛替尼作为待测药物。用DMSO配制浓度分别为0、2、4和20 mM的尼洛替尼储备液。将每种储备液在5 ml DMEM培养基中稀释200倍，得到浓度分别为0、10、20和100 µM的2倍浓缩药物溶液6.7。</li>
	<li>从每个孔中移除0.1 ml培养基，加入含有药物的0.1 ml培养基。最终药物浓度分别为0、5、10和50 µM。继续在含药培养基中培养细胞5天。</li>
	<li>处理结束后，使用相差显微镜观察贴壁细胞并拍照。吸去培养基，用0.2 ml PBS洗涤存活的贴壁细胞一次。</li>
</ol>
3. 数字PCR的DNA准备
<ol>
	<li>使用 HotShot8 裂解细胞。
	<ol>
		<li>向每个孔中加入 50 µl 碱性裂解液（25 mM NaOH，0.2 mM EDTA）。用铝箔密封各孔，在烘箱或加热板上于 95 °C 孵育 30 分钟。在显微镜下检查，确保孔表面无完整细胞残留。&#160;若细胞未完全裂解，可延长加热时间或添加去污剂。在 -20 °C 冻存一次也有助于细胞破碎。</li>
		<li>向每个孔中加入 50 µl 中和液（40 mM Tris-HC，pH 4.0）。将所有裂解液转移至 PCR 板的 U 型孔中，并在 PCR 仪中于 95 °C 干燥 10 至 30 分钟。用 20 µl 蒸馏水重新溶解裂解液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Drop-Dialysis9 进行脱盐
	<ol>
		<li>使用平均孔径为 0.025 µm 的膜滤器。&#160;</li>
		<li>将滤膜光面朝上漂浮于 12 孔板各孔内的蒸馏水上，润湿 5 分钟。注意避免滤膜与水之间产生气泡。</li>
		<li>小心地将步骤 3.1.4 中重新溶解的各样品裂解液分别加至滤膜的 4 个区域上。盖上板盖，透析 30 至 60 分钟。</li>
		<li>在不翻转滤膜且不扰动液滴的情况下，吸去滤膜下方的水。</li>
		<li>将滤膜上的裂解液液滴转移至新的 PCR 板孔中。在 PCR 仪中于 95 °C 加热 10 至 30 分钟，使 DNA 液滴干燥。用 10 µl 水重新溶解裂解液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数字PCR
<ol>
	<li>将冷冻的组分（如DNA、缓冲液和检测混合液）在室温下解冻，于可用离心机的最大转速下离心10秒（例如VWR小型离心机），然后置于冰上保存。</li>
	<li>配制主混合液，包含除DNA外的所有组分（表1）。考虑死体积，主混合液的总量应比实际需要量多约10%。 
	注意：使用商业试剂盒中提供的引物和探针。</li>
	<li>涡旋混匀主混合液，在可用离心机的最大转速下离心10秒，然后向96孔PCR板的每孔中加入15 µl。向含有主混合液的各孔中加入每个样本的全部裂解液（含DNA）。在室温下，将每份反应混合液20 µl转移至微滴生成卡盒样品侧的对应孔中。</li>
	<li>向微滴生成卡盒油相侧的每个孔中加入70 µl微滴生成油。用垫圈密封卡盒，并将整个装置放入微滴生成仪中，启动微滴生成程序。</li>
	<li>将40 µl的微滴溶液转移至96孔PCR板的各孔中。用铝箔密封PCR板，并将其放入PCR仪中。设置加热盖温度为105 °C，升降温速率为2 °C/sec。按照&#160;表2中的参数进行PCR扩增。PCR完成后，将PCR板转移至微滴读取仪中开始读取数据；或者，可将PCR板在4 °C保存最多24小时后再读取。</li>
</ol>
5. 计算肿瘤细胞比例
<ol>
	<li>加载数字PCR数据并进行自动分析。</li>
	<li>通过检查阳性与阴性液滴的一维和二维分布，手动控制每个检测的结果，确保其分离清晰且阈值线位置正确。排除不符合标准的结果（例如阳性与阴性液滴无明显分离）进入后续分析。将得到的 NF1/RPP30 比值复制到Excel表格中。</li>
	<li>计算肿瘤细胞所占比例： 2 x&#160;(1-NF1/RPP30)。</li>
</ol>
6. 肿瘤细胞比例的剂量依赖性变化
<ol>
	<li>针对每种药物浓度，根据4个重复样本计算平均值和标准差。以药物浓度为横坐标，绘制均值及标准差的图表。</li>
</ol>

<ol><li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li>
<li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li>
<li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li>
<li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li>
<li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography-Methods%22%5BJournal%5D)">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li>
<li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li>
<li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome%3A+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li>
</ol>

该方法受专利保护（10 2013 221 452，德国）

评估药物特异性的基因与细胞工具中的关键步骤 体外 是利用一种或多种肿瘤特异性遗传特征来确定肿瘤细胞比例的方法。与传统的表型特征相比7，遗传特征具有特异性、稳定性和易于量化的优点。例如，肿瘤特异性的突变或拷贝数变异仅存在于肿瘤细胞中，而不存在于非肿瘤细胞中。此类遗传标志物可通过数字PCR等方法进行可靠且精确的定量，本研究即展示了这一应用。
对于数字PCR而言，DNA的高纯度并非必需。然而，必须进行脱盐并去除抑制性分子，这可以通过使用合适滤膜的液滴透析法实现。裂解与液滴透析联合操作简便、快速，无需特殊仪器，因此可在任何标准实验室中进行。&#160;如果细胞裂解不充分，可考虑额外处理措施，例如将细胞在-20 °C冷冻、添加去垢剂和/或使用蛋白酶。&#160;
在本研究中，该基因的杂合性缺失 NF1 基因被用作肿瘤特异性特征进行定量。同样，其他基因或位点的缺失也可被采用。此外，突变也可以&#160;也可用于肿瘤细胞的定量。在此情况下，需要对突变型和野生型等位基因的数字PCR检测方法进行充分验证，以确保各自检测的特异性。
肿瘤细胞比例的剂量依赖性可提示药物的特异性或选择性。此外，该方法还能从混合培养物中总细胞对药物的反应中，分离出肿瘤细胞的特异性反应（图4）。这种分离策略为在药物测试中使用原代培养物（包含肿瘤细胞和非肿瘤细胞）所面临的技术难题提供了解决方案。
基于基因与细胞的 体外 因此，本研究中展示的工具可能具有以下应用潜力：(1) 在药物发现领域，可作为评估药物特异性或选择性的平台 体外 以及（2）在个体化癌症治疗中，它能够用于原代培养物的药物测试，从而可能有助于辅助化疗中的药物选择4此外，由于可在药物处理过程中追踪特定的基因改变或多种基因改变，因此可利用该工具研究药物的药理学机制。
使用个体化原代培养物的一个难点在于缺乏可用于定量肿瘤细胞的通用遗传特征。然而，随着当今全基因组测序技术的进步，常见肿瘤中最常发生改变的基因和区域已被明确。例如，在头颈部肿瘤中，71%、23% 和 22% 的病例分别存在 TP53、FAT1 和 CDKN2A 基因的突变，而 60%、34% 和 26% 的病例则分别在 CDKN2A、STK11 和 PTEN 基因区域存在缺失10。因此，通过靶向测序和/或数字PCR对5至10个此类基因和/或区域进行筛查，很可能鉴定出一个或多个可用于定量原代培养物中肿瘤细胞的遗传改变。另一个局限性是切除的肿瘤组织量常常不足以建立原代培养。
尽管基因和细胞治疗具有诸多优势和广阔的应用前景 体外 工具，应牢记其局限性并加以考虑 体外 应强调自然属性。例如，某种药物对肿瘤细胞的不同效应或细胞毒性可能更多归因于细胞类型的差异（成纤维细胞 vs. 施万细胞）或其来源不同（来自不同个体）。药物对肿瘤细胞的作用强于非肿瘤细胞，也可能是因为前者增殖速度比后者更快。最重要的是，细胞 体外 行为与人体内的细胞不同，因此结果也不同 体外 评估结果通常无法或仅能部分反映真实的临床情况。因此，针对培养细胞获得的药物疗效、细胞毒性和特异性数据更倾向于生物标志物性质，而不具备抗生素临床前疗效测定所具有的可靠性。然而，从细胞系转向混合培养和/或原代培养，是在评估药物效应及特异性/选择性方面迈出的重要一步。 体外经过大量努力， 体外 可找到能够实现合理关联的条件 体外 至少针对某些药物，包含患者真实反应的数据。

抗癌药物对肿瘤细胞的治疗作用常伴随对非肿瘤细胞的各种不期望的毒性效应。由于缺乏合适的工具，这些毒性效应在实验室中难以评估。1同时包含肿瘤细胞和非肿瘤细胞的细胞培养物将提供一种潜在的 体外 用于评估药物特异性或选择性的资源，可为临床毒性提供线索。然而，传统方法 体外 增殖或存活率等检测方法可测量药物对总体细胞的作用效果，但无法将该效应区分为对肿瘤细胞的作用和对非肿瘤细胞的作用。例如，在由50%肿瘤细胞和50%非肿瘤细胞组成的培养体系中，总体细胞数量减少50%可能意味着所有肿瘤细胞死亡、所有非肿瘤细胞死亡，或更可能的情况是，两类细胞以不同比例部分死亡。 
也由于这一技术难题，包含肿瘤细胞和非肿瘤间质细胞的原代培养物通常不适合用于药物测试。另一方面，由于这种细胞异质性，原代培养物比已建立的细胞系中的克隆细胞更能真实地模拟其原始肿瘤2。更重要的是，原代培养物具有患者特异性，可能实现个体化药物测试2-4。
因此，一个关键问题在于开发一种方法，用于确定包含原代培养物在内的混合培养物中肿瘤细胞所占的比例。针对这一挑战，人们提出了一种基于遗传学的解决方案，即通过测定肿瘤特异性遗传特征与通用参考序列之间的定量比值，由此计算出混合培养物中肿瘤细胞的比例。
本研究阐述了一种用于评估抗癌药物特异性的遗传学与细胞学工具的操作流程，包括：（1）制备由已建立细胞系的肿瘤细胞和非肿瘤成纤维细胞组成的混合培养物；（2）用待测药物处理混合培养物；（3）提取DNA用于数字PCR；（4）利用双探针微滴数字PCR检测方法，测定肿瘤特异性杂合缺失序列与参考序列的比值；（5）计算每个药物浓度下肿瘤细胞所占比例；（6）绘制肿瘤细胞比例随药物剂量变化的依赖曲线。

<table><tbody><tr><td>25 mm 直径的膜滤器</td><td>Merk-Millipore</td><td>VSWP 02500</td><td>用于液滴透析</td></tr><tr><td>NF1 的数字滴定 PCR 检测</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP1000177</td><td>FAM 标记</td></tr><tr><td>RPP30 的数字滴定 PCR 检测</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP2500350</td><td>HEX 标记</td></tr><tr><td>QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4001</td><td>本研究中使用的是前一代 QX 仪器，目前已不再供应。其替代型号为 QX200</td></tr><tr><td>液滴油</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>微滴生成卡盒&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>密封垫圈</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>卡盒支架</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>可穿刺箔膜</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

评估抗癌药物的特异性 体外

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

一种评估抗癌药物特异性的方法 体外 使用包含肿瘤细胞和非肿瘤细胞的混合培养物进行实验。关键步骤是通过双探针数字PCR检测方法，定量测定肿瘤特异性遗传变异相对于一个通用序列的水平，并据此计算肿瘤细胞所占比例。本实验采用已建立的肿瘤细胞系与添加的非肿瘤细胞共同培养的体系，在混合培养物中加入不同浓度的待测药物进行处理。处理结束后，直接从96孔板中存活的贴壁细胞提取DNA，所用方法简便且成本较低，随后进行双探针数字PCR检测，以测定肿瘤特异性遗传变异和参考通用序列。在本实验示例中，检测的是一个杂合性缺失 NF1 基因被用作肿瘤特异性的遗传改变以及一个 RPP30 基因作为参考基因。使用该比值 NF1/RPP30，计算了肿瘤细胞的比例。由于肿瘤细胞比例的剂量依赖性变化提供了 体外 药物特异性的指征，该遗传学和细胞水平基础 体外 该检测方法在药物发现中可能具有应用潜力。此外，对于个体化癌症治疗而言，这种基于基因和细胞的工具可通过利用个体肿瘤的原代培养物来测试候选药物的有效性和特异性，从而有助于优化辅助化疗方案。

采用联合HotShot/液滴透析法提取的DNA质量足以满足数字PCR的检测要求（图1B）。对于2,000个成纤维细胞，可获得约3,000 ± 500个阳性液滴，相当于预期4,000拷贝的75%（每个细胞含两个拷贝）。在本研究中，肿瘤细胞来源于已建立的MPNST S462细胞系，该细胞系已知存在NF1基因的杂合性缺失5。双通道数字PCR检测可清晰检出该基因剂量减少50%的现象（图1B）。相比之下，成纤维细胞中该基因的拷贝数为两个。这种肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的遗传差异，使得能够计算混合培养物中肿瘤细胞所占比例（图2）。通过测定NF1基因相对于RPP30基因的相对基因剂量，可确定不同药物浓度下混合培养物中肿瘤细胞的比例（图3）。
<img alt="采用荧光检测的数字PCR装置及细胞中NF1、RPP30的比较柱状图。" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 数字PCR。（A）原理示意图。（B）双探针检测显示，在肿瘤细胞MPNST S462中，目标基因（NF1）的含量相对于参考基因（RPP30）减少。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤细胞比例与设定误差条形图，显示细胞计数结果的数据分析。" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 计算得到的肿瘤细胞比例。 将肿瘤细胞与非肿瘤细胞以不同比例混合后接种至96孔板的各个孔中。贴壁过夜后，使用HotShot/Drop-dialysis法裂解细胞，对去盐后的裂解液进行数字PCR检测，获得NF1/RPP30的比值。根据该比值，计算每个孔中肿瘤细胞的比例。每个设定比例设置4个重复，据此计算肿瘤细胞比例的均值和标准差。将计算得到的肿瘤细胞比例（Y轴）对设定的比例（X轴）作图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用不同剂量尼洛替尼处理的肿瘤细胞显微镜图像及细胞反应图。" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 肿瘤细胞比例的剂量依赖性变化。 （A）可见活细胞数量随剂量增加而减少。（B）根据NF1与RPP30比值计算的肿瘤细胞比例（4次重复实验的平均值及标准差），在0–10 µM范围内呈下降趋势。在最高剂量50 µM时，几乎无活细胞残留，可能由于该剂量对所有细胞均产生毒性作用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤细胞与非肿瘤细胞活力随药物浓度变化的曲线图、dPCR 数据、活力计算" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 区分肿瘤细胞与非肿瘤细胞的反应。（A）使用常规检测方法可测量总细胞的活力和/或增殖能力；本研究所展示的方法可用于确定肿瘤细胞所占比例。（B）利用这两个参数，可将混合培养物中总细胞对药物的反应分解为肿瘤细胞的反应和非肿瘤细胞的反应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<colgroup>
		<col>
		<col>
		<col>
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 个反应</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">2 x ddPCR 超混合液</td>
			<td style="width:171px;">12</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">NF1 检测混合液</td>
			<td style="width:171px;">1.2</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">RPP30 检测混合液</td>
			<td style="width:171px;">1.2</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">HaeIII</td>
			<td style="width:171px;">0.6</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:147px;">小计</td>
			<td style="width:171px;">15</td>
			<td style="width:99px;">主混合液</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">DNA</td>
			<td style="width:171px;">9</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:147px;">总计</td>
			<td style="width:171px;">24</td>
			<td style="width:99px;">最终 PCR 混合液</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1 建立双重数字PCR反应
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>操作</td>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
			<td>循环次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>聚合酶激活</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>DNA变性</td>
			<td>94 °C</td>
			<td>30 sec</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>退火/延伸</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>聚合酶失活</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>保存（可选）</td>
			<td>4 °C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2 PCR扩增仪设置

本实验方案的目的是评估抗癌药物的特异性 体外 使用包含肿瘤细胞和非肿瘤细胞的混合培养物。

一种利用包含肿瘤细胞和非肿瘤细胞的体外培养体系评估抗癌药物特异性的方法。该关键步骤……

本实验的总体目标是评估在含有肿瘤细胞和非肿瘤细胞的混合培养物中，肿瘤细胞比例随药物剂量变化的情况。该方法提供了一种基于遗传学的工具，用于评估抗肿瘤药物在体外的作用效果及其特异性。该技术在药物研发及个体化肿瘤治疗中具有潜在应用价值。该方法的主要优势在于，当在同时含有肿瘤细胞和非肿瘤细胞的培养体系中测试抗癌药物时，可以将肿瘤细胞的反应与非肿瘤细胞的反应区分开来。本次实验操作将由本实验室的技术员 Eena 进行演示。首先，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，于标准DMA培养基中将肿瘤细胞和成纤维细胞共同培养过夜。在亚汇合状态下，用0.05%胰蛋白酶消化收集细胞，并使用血细胞计数板进行计数。随后，将400个肿瘤细胞与1,600个非肿瘤细胞混合，加入含0.2 mL培养基的96孔培养板中，每孔为一个处理，每个药物浓度设置四个重复。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下孵育过夜。然后，用DMSO配制浓度分别为0、2、4和20 mM的尼洛替尼储备液。将每种储备液在5 mL DMA培养基中稀释200倍，得到浓度分别为0、10、20和100 µM的两倍浓缩药物溶液。接着，从每个孔中移除0.1 mL培养基。加入0.1 mL含有药物的培养基，继续培养细胞5天。处理结束后，使用相差显微镜观察贴壁细胞并拍照。吸除培养基，用0.2 mL PBS洗涤存活的贴壁细胞一次。采用 HotSHOT 法裂解细胞时，向每个孔中加入 50 µL 碱性裂解液。用铝箔密封各孔，然后将板置于 95 °C 的烘箱或加热板上孵育 30 分钟。30 分钟后，在显微镜下检查，确保孔板表面无完整细胞残留。如果细胞未完全裂解，可延长加热时间或添加去垢剂。在 20 摄氏度下冷冻一次也有助于细胞破碎。随后，向每个孔中加入 50 uL 中和溶液，然后将所有裂解液转移至 PCR 板的 U 型孔中，并在 PCR 仪中于 95 摄氏度下干燥 10 至 30 分钟。之后，用 20 uL 去离子水重新溶解裂解液。若需通过液滴透析法对 DNA 进行脱盐，可将直径为 25 mm 的膜滤器分为四个区域，并对各区域进行编号。将滤膜光泽面朝上漂浮于12孔板孔内的蒸馏水中。然后小心地将20 µL重悬的裂解液加到滤膜上。盖上孔板，透析30至60分钟。随后，在不翻转滤膜或扰动液滴的情况下，用抽吸法吸去滤膜下方的水分。将裂解液液滴转移至新的PCR板的孔中。接着，将PCR板置于PCR仪中，于95摄氏度加热10至30分钟，使DNA液滴干燥。然后在10 µL水中重悬裂解物。接着配制主混合液，其中包含双重探针数字PCR反应所需的所有组分，但不加入DNA。涡旋混匀后，在离心机中以最大速度离心10秒，随后将15 µL混合液分装至96孔PCR板的每个孔中。将每个样本的裂解液加入含有主混合液的孔中。在室温下，将每种反应混合物的 20 µL 转移至微流控芯片样品侧的孔中。然后，向微流控芯片油相侧的每个孔中加入 70 µL 乳滴生成油。用垫圈封闭 cartridge，将整个装置放入微滴生成仪中，然后开始生成微滴。随后将 40 µL 微滴溶液转移至 96 孔 PCR 板的每个孔中。用铝箔封膜密封 PCR 板，并将板放入 PCR 仪中。接下来，将盖子温度设置为105摄氏度，升降温速率为每秒2摄氏度。完成后，将反应板转移至液滴读取仪中并开始读取数据。或者，可将反应板在4摄氏度下保存最多24小时。现在加载数字PCR数据并进行自动分析。手动检查样本，确保阳性与阴性液滴分离良好。将阳性与阴性液滴无明显分离的样本排除在进一步分析之外。将NF1与RPP30的比值结果复制到Excel表格中。接着，计算肿瘤细胞所占比例。针对每个药物浓度，根据四个重复样本计算平均值和标准差，然后将平均值及标准差对药物浓度作图。此处显示的是可见活细胞数量随剂量增加而减少的情况。从NF1与RPP30的比值计算得到的肿瘤细胞比例在0至10 µM范围内下降。在最高剂量50 µM时，仅剩少量活细胞，可能由于该浓度对所有细胞产生了毒性作用。总细胞的活力和增殖能力可使用常规检测方法进行测量，而肿瘤细胞所占比例则可通过本研究中展示的实验步骤来确定。利用这两个参数，可将混合培养体系中总细胞对药物的反应分解为肿瘤细胞的反应和非肿瘤细胞的反应。整个检测过程可在一周内完成，其中包括五天的处理期。在进行该实验操作时，需注意目标基因与逆转基因之间的比例存在差异。我们观察到的比例范围非常狭窄，介于0到1之间，因此精确性至关重要。应尽可能减少样品间以及操作过程中的误差。采用此方法，也可利用包含肿瘤细胞和非肿瘤细胞的原代培养物来检测抗癌药物的效果和特异性。此外，可特异性地评估药物对具有特定基因改变的细胞亚群的作用。希望本视频能帮助您理解如何利用基因特征来确定样本或培养物中肿瘤细胞的比例，尤其是在同时含有肿瘤细胞和非肿瘤细胞的情况下。

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评估抗癌药物的特异性<em&gt;体外</em

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