定向进化法酿酒酵母:突变体库的创建和筛选
April 1st, 2016
我们提出了一个详细的方案来构建和筛选酿酒酵母定向进化活动的突变文库。
该协议的总体目标是展示如何在酿酒酵母中构建和筛选突变文库以进行定向进化实验。该方法可以帮助回答实验室创建中使用重点定向进化实验中的关键问题，例如如何在组装和克隆中分配重叠区域。这种技术的主要优点是它的简单性和健壮性，因为只需一个转换步骤，就可以分配具有良好质量的级别。
这种用于创建和筛选突变文库的方案将针对真菌芳醇氧化酶或 AAO 进行演示。首先在基于酶的可用晶体结构或同源模型的计算算法的帮助下选择聚焦定向进化的区域。AAO 的两个区域将靶向随机诱变和重组：M1 区和 M2 区。
将进行诱变 PCR 以扩增目标区域。为了促进酵母中的体内剪接，通过叠加定义区域的 PCR 反应，将在大约 50 个碱基对的片段之间产生重叠区域。制备 50 微升体积的诱变 PCR，每个模板含有 46 ng DNA 模板、正义引物和反义引物各 90 纳摩尔、0.3 毫摩尔的 DNTP、3% 的 DMSO、1.5 毫摩尔的氯化镁、05 毫摩尔的氯化锰和每微升 05 单位的粘性 DNA 聚合酶。
使用以下 PCR 程序。95 摄氏度 2 分钟，95 摄氏度 45 秒，50 摄氏度 45 秒，74 摄氏度 45 秒 28 个周期，74 摄氏度 10 分钟。AAO 基因的其余部分，即 HF 区域，将通过高保真 PCR 扩增，相应的区域与诱变片段重叠，和/或包括线性化载体突出端。
制备最终体积为 50 μL 的高保真 PCR，每 μL 含有 10 ng DNA 模板、250 纳摩尔的正义和反义引物、0.8 毫摩尔的 DNTP、3% 的 DMSO 和 02 单位的 iProof 超高保真 DNA 聚合酶。使用以下 PCR 程序。98 摄氏度 30 秒，98 摄氏度 10 秒，55 摄氏度 25 秒，72 摄氏度 45 秒 28 个周期，72 摄氏度 10 分钟。
然后根据制造商的方案，使用市售凝胶提取试剂盒纯化所有 PCR 片段。下一步是将载体线性化，以创建与靶基因的 5 个主要和 3 个主要末端同源的大约 50 个碱基对的侧翼区域。制备一种 20 微升线性化反应混合物，其中包含 2 微克 DNA、7.5 单位 BamH-one、7.5 单位 XHO-one、20 微克 BSA 和 2 微升 10x 缓冲液 BamH-one。
将反应混合物在 37 摄氏度下孵育 2 小时 40 分钟。之后，在 80 摄氏度下灭活反应 20 分钟。为了纯化线性化载体以避免被残留的环状质粒污染，将消化反应混合物加载到半制备型低熔点琼脂糖凝胶的巨孔中。
将 5 μL 反应混合物作为报告基团加载到相邻孔中。在 4 摄氏度和 5 伏/厘米的电极之间运行 DNA 电泳。然后分离对应于巨孔的琼脂糖凝胶，并将其储存在 4 摄氏度的一个 XTAE 中。
用分子量标准和报告基因对泳道进行染色。在紫外光下可视化条带，并划定线性化向量的位置。在没有紫外线的情况下，利用染色报告基因泳道中缺口的引导，识别巨孔片段中的线性化载体并将其切除。
从琼脂糖中提取线性化载体，并根据制造商的方案使用市售凝胶提取试剂盒进行纯化。随后，将纯化的线性化载体与 PCR 片段混合，并根据制造商的说明使用商业试剂盒使用该 DNA 混合物转化感受态酵母细胞。将转化的细胞接种在 SC 辍学板上，并在 30 摄氏度下孵育三天。
为了准备该检测，从 SC 脱落板中挑选单个菌落，并将其转移到每孔含有 50 μL 最小培养基的 96 孔板中。在每个板中接种第 6 列，以母体类型作为内标。作为阴性对照，将填充有补充有尿嘧啶的 SC 培养基的 H-one 接种到没有质粒的 URA3 阴性 ESI 内脏细胞中。
用盖子盖住板，用封口膜包裹，然后在 30 摄氏度下在潮湿摇床中孵育 48 小时。48 小时后，向每个孔中加入 160 μL 表达培养基并重新密封板。再孵育 24 小时。
离心板后，使用液体处理机器人多站将 20 μL 上清液从每个板的孔中转移到复制板中。向每个孔中加入 20 微升 2 微米对甲氧基苯甲醇和 100 微米磷酸钠缓冲液，pH 值为 6.0。用 96 孔板混合器短暂搅拌板，并在室温下孵育 30 分钟。
接下来，向每个复制板中加入 160 μL FOX reagant，并用混合器短暂搅拌。在读板器上读取 560 纳米的板。在室温下孵育板，直到颜色显现。
再次测量吸收情况。相对活性是根据孵育后的吸收值与标准化为每个板的亲本类型的初始测量值之间的差值计算的。该代表性凝胶图像显示了泳道 2 中的线性化载体、泳道 3 中的 M1 PCR 片段、泳道 4 中的 M2 PCR 片段、泳道 5 中的 HF PCR 片段，以及泳道 6 中与 NHE 1 线性化的体内重组载体。
下一个凝胶显示了泳道 2 中重组载体的质粒小量制备，泳道 3 中用 NHE 1 线性化的质粒，泳道 4 中用 BamH 1 和 XHO 1 线性化的质粒，以及在泳道 5 中通过凝胶提取和纯化获得的线性化质粒。通过对具有不同景观的突变文库进行采样来调整突变负载，计算亲本酶活性小于 10% 的克隆数量，并通过对活性和非活性变体的随机样本进行测序来进一步验证。对该测定的检测限的评估表明，在山梨糖醇存在（以黑圈表示）的情况下，该测定是线性的。
在没有白色方块表示的山梨醇的情况下，线性更持久，但响应更弱。观察到 AAO 浓度和吸光度之间存在线性相关性。构建 2， 000 个克隆的突变文库，并用该测定进行筛选。
阴影方块表示 AAO 突变体对 P-甲氧基苯甲醇的分泌和活性显着改善。一旦掌握，如果执行得当，可以在大约四个小时内制作突变文库。尝试此程序时，请务必记住在单个转化步骤中为每个 PCR 家族和线性化载体分配适当的重叠区域，以进行体内剪接和克隆。
遵循类似的方法，可以进行其他方法，如体内 DNA 采样、饱和诱变文库或 DNA 组装，以构建突变文库和/或代谢途径。发展之后，这项技术为生物工程领域的研究人员探索活动、稳定性，甚至发明无限种类的交互铺平了道路。看完这个视频后，你应该对如何利用这种酿酒酵母设备进行文库构建和筛选有一个很好的了解
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概述
本协议概述了在酿酒酵母中构建和筛选突变体文库用于定向进化实验。它强调了一种允许有效诱变和重组的简单方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 基因工程
- 微生物学
背景
- 定向进化是一种用于开发具有理想特性的蛋白质的方法。
- 酿酒酵母作为这些实验的模式生物。
- 随机诱变和重组是这一过程的关键技术。
- 计算算法有助于选择用于诱变的目标区域。
研究目的
- 展示创建和筛选突变体文库的协议。
- 识别定向进化中的组装和克隆的重叠区域。
- 针对真菌芳基醇氧化酶（AAO）的特定区域进行增强。
使用的方法
- 使用计算算法选择目标区域。
- 对AAO的M1和M2区域进行随机诱变。
- 通过单次转化步骤筛选突变体文库。
- 评估所得突变体的质量。
主要结果
- 在酿酒酵母中成功构建突变体文库。
- 识别具有所需特性的有效突变体。
- 展示了该协议的稳健性。
- 对AAO的定向进化过程的见解。
结论
- 该协议为定向进化研究提供了可靠的方法。
- 针对特定区域增强了诱变的效率。
- 这种方法可以应用于AAO之外的各种蛋白质。
常见问题
Executive Industry Relevance
Directed evolution in yeast enables rapid generation of functional enzyme variants for biotechnological applications, reducing reliance on in vitro steps and accelerating protein engineering timelines. This approach supports target validation by linking genetic modifications to measurable activity improvements in a eukaryotic host. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, secretion-linked activity readouts relevant to industrial enzyme production.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of structure-guided regions (M1, M2) to clarify functional contributions to enzyme activity.
- Operational Value: Uses overlapping ~50 bp homology arms for seamless in vivo reassembly, minimizing cloning steps and transformation burden.
- Scientific Value: Screens mutant libraries in yeast supernatants using a Fenton-based assay, directly correlating genotype with secreted enzyme function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Employs a high-throughput, sensitive assay based on P-methoxybenzyl alcohol oxidation to quantify aryl-alcohol oxidase activity in 96-well format.
- Operational Value: Normalizes activity to parental type and uses internal controls (parental strain, negative control) to ensure assay robustness across plates.
- Scientific Value: Detects improved secretion and activity, enabling identification of variants with enhanced performance under screening conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates linearity of assay response with enzyme concentration, supporting reliable quantification across mutant libraries.
- Operational Value: Confirms assay performance in presence/absence of sorbitol, defining working range for accurate hit selection.
- Scientific Value: Validates hits through sequencing of active and non-active clones, linking phenotype to genotype for downstream characterization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates library construction and functional screening into a discovery workflow from target region selection to hit identification, enabling iterative enzyme optimization campaigns.
- Discovery Biology: Uses computational algorithms to select mutagenesis sites based on AAO structure, focusing evolution on functionally relevant regions.
- Screening: Delivers quantitative, supernatant-based activity readouts that support reproducible, plate-to-plate comparison of mutant function.
- Analytics: Measures relative activity via absorbance shift at 560 nm, normalized to parental strain, enabling objective variant ranking.
- Translational Research: Secretion-linked screening in yeast provides early insight into expressibility and function, relevant for biologics and industrial enzyme development.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other eukaryotic genes, avoiding repeated optimization of PCR, recombination, and screening steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking targeted mutagenesis to measurable changes in enzyme activity and secretion.
- Operational Value: Achieves library construction and screening in ~4 hours post-transformation, enabling rapid design-build-test cycles.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enriching libraries with functional variants and minimizing false negatives through sensitive detection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying mutants with improved activity, guiding investment toward promising enzyme candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, PCR optimization, and agarose gel purification for linearized vector preparation.
- Dependent on thermocyclers, gel electrophoresis systems, plate readers, and liquid-handling robots for supernatant transfer and reagent addition.
- Necessitates standardization of overlapping regions (~50 bp) and transformation efficiency to ensure consistent in vivo reassembly across projects.
- Adaptation to other genes may require re-evaluation of homology arm length, mutagenic conditions, and assay compatibility with target enzyme activity.
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on substrate choice and buffer conditions; optimization may be needed for enzymes with low activity or alternative reaction mechanisms.
