Name: 方法发现小鼠BCRP1的另类用法子和转录调控 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 了解如何利用生物信息学方法检测小鼠Bcrp1基因的替代启动子，并通过荧光素酶报告基因实验验证其功能活性。该技术为研究基因转录调控机制提供了有效框架。

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本工作获得了美国退伍军人事务部授予 Douglas D. Ross 和 Arif Hussain 的优异评审奖支持。

1. 利用小鼠 EST 数据库的 BLAST 分析对 Bcrp1 基因的替代性第一外显子进行in silico预测
注意：本实验方案描述了如何搜索小鼠表达序列标签（EST）数据库，以寻找与Bcrp1基因第2外显子（包含翻译起始位点）具有序列相似性的EST，并进一步将匹配的EST序列与基因组序列进行比对，从而确定这些EST在小鼠Bcrp1基因中的位置，相对于Bcrp1第2外显子5'端的位置。
<ol>
	<li>通过在 Ensembl 基因组浏览器的搜索窗口中输入小鼠 Bcrp1 外显子 2 的 mRNA 参考序列编号（NM_011920.3）获取该序列17，点击 &#34;GO&#34; 在下一个界面中，选择一个全长序列（包含16个外显子）：
	<ol>
		<li>在下一个界面中（&#34;基于转录本的展示&#34;），选择 &#34;16个外显子&#34; 这将显示包含 Bcrp1 所有外显子序列的界面。Bcrp1 的第 2 外显子序列为 &#34;5'-AAAGGC…TATCAA-3'&#34; 所得结果将与参考文献中所示结果相似 18.</li>
		<li>点击 &#34;下载序列&#34; 选项。在下一个界面中，选择 FASTA 格式，然后点击 &#34;预览。&#34; 在下一个界面中，将外显子2的预览序列复制到剪贴板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进入 BLAST 主页19 在美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站上20.
	<ol>
		<li>选择 &#34;小鼠&#34; 基因组。将外显子2序列从剪贴板粘贴到查询框中。</li>
		<li>选择 &#34;表达序列标签&#34; 从数据库下拉菜单中，优化以 &#34;高度相似的序列，&#34; 然后选择 &#34;BLAST&#34; 运行时间需要几分钟。当BLAST运行完成后， &#34;结果&#34; 页面将出现。</li>
		<li>在……之下 &#34;描述&#34; 小标题 &#34;结果&#34; 页面，选择 &#34;急性淋巴细胞白血病&#34; 然后 &#34;下载，&#34; 然后 &#34;FASTA（完整序列）&#34; 在下拉菜单中，然后选择 &#34;继续。&#34; 将出现一个 .txt 文件；打开并复制整个文件内容到剪贴板。该 .txt 文件包含所有与小鼠 Bcrp1 外显子 2 具有高序列相似性的 EST 序列，但不包含这些序列在 Bcrp1 基因中外显子 2 相对位置的信息。 
		注意：2015年4月15日进行的一项分析鉴定出14条与Bcrp1外显子2比对上的小鼠EST序列。这些序列列于 表1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定位于 Bcrp1 基因第2个外显子5'端的EST序列位置。小鼠 Bcrp1 基因位于染色体6的contig NC_000072.6（GI:372099104）上。
	<ol>
		<li>在BLAST主页的下方 &#34;特化的爆炸&#34; 小标题，选择 &#34;使用 BLAST（bl2seq）比对两个（或多个）序列。&#34;</li>
		<li>将剪贴板中的文本文件粘贴到查询框中，并在“主题序列”框内输入 372099104。优化以 &#34;高度相似序列&#34; 在程序选择下运行BLAST。</li>
		<li>结果窗口出现后，通过点击查看比对的图形化结果 &#34;图形&#34; 在 &#34;序列比对&#34; 窗口。使用左右箭头并缩放以聚焦于 Bcrp1/Abcg2 及其序列比对。</li>
		<li>保存序列比对结果：选择 &#34;急性淋巴细胞白血病&#34; 在 &#34;描述&#34; 盒，然后在下方的 &#34;下载&#34; 下拉选择 &#34;命中表（CSV），&#34; 然后点击 &#34;继续。&#34; 该文件包含 Bcrp1 外显子 2 的序列比对结果，以及所有与 Bcrp1 外显子 2 具有序列相似性的 EST 序列相对于小鼠 6 号染色体 contig 核苷酸编号的比对结果。每条完整的 EST 序列可能产生多个比对结果，覆盖外显子 2 的 5' 和 3' 区域，包括与 Bcrp1 外显子 2 重叠的序列。</li>
		<li>由于外显子2的5'端位置对应于6号染色体contig的第58,655,638位核苷酸，因此将该位置指定为+1，然后计算各EST序列5'端位于58,655,638之前的片段位置。14条EST的结果如下所示 表1. 
		注意：务必仔细分析位于 +1 位点 5' 端的 EST 序列即，具有负的核苷酸值）作为潜在的第一个外显子。例如，在两条与所示Bcrp1外显子2比对上的EST中 表1 （AI647825 和 AI664571）其余序列位于第2个外显子的3'端。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Bcrp1 替代启动子功能的评估
<ol>
	<li>Bcrp1 E1U、E1A、E1B 和 E1C 启动子报告基因载体的构建设计 
	<ol>
		<li>根据从 EST 数据库中获得的 E1U 序列，将 E1U 的第一个 5' 核苷酸指定为 +1。</li>
		<li>获取包含小鼠6号染色体上Bcrp1/Abcg2基因序列及其上游至少100 kb序列的细菌人工染色体（BAC）克隆（参见材料与设备清单）。
		<ol>
			<li>选择一种合适的报告基因载体，例如荧光素酶报告基因质粒 pGL3-Basic。</li>
			<li>确定报告载体中的多克隆位点。在pGL3-Basic载体的多克隆位点中，按5'至3'方向依次为KpnI、SacI、MluI、NheI、SmaI、XhoI、BglII和HindIII限制性内切酶位点。 
			注：限制性内切酶消化位点的序列可从生产该酶的公司产品目录中获得。</li>
			<li>使用DNA5等软件程序鉴定E1U外显子及E1U上游5'端2 kb区域内的所有酶切位点。在pGL3-Basic载体的多克隆位点中鉴定至少两个未出现在E1U或其上游2 kb区域内的酶切位点。 
			注意：选择正向引物的多克隆位点限制性酶切位点时，应确保其位于反向引物所选酶切位点的上游，以保证插入片段的正确方向。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备用于PCR的正向和反向引物，引物中应包含针对所选pGL3-basic载体多克隆位点限制性内切酶识别序列的序列，可通过商业基因/引物合成服务或引物设计软件完成（见材料与设备列表）。选择一个位于E1U序列上游约2 kb处的正向引物，以及一个位于E1U序列内部的反向引物。作者在先前研究中使用的引物在正向引物中引入了SacI酶切位点，在反向引物中引入了NheI酶切位点，扩增的基因组区域约为−1,906至+64（以E1U序列的第一个5'核苷酸定义为+1，见上述步骤2.1.1），相关引物信息参见参考文献 16.
		<ol>
			<li>使用这些引物、0.01至1 µg的BAC以及含有高保真DNA聚合酶的PCR预混液，对E1U基因组区域进行PCR扩增 Taq 聚合酶（见材料与设备清单），95 °C 变性 30 秒，随后进行 35 至 40 个 PCR 循环，72 °C 延伸（2 分钟），退火和变性温度根据所用引物的熔解特性设定。 
			注意：高保真酶的使用 Taq 聚合酶对于测序高GC含量的启动子区域至关重要。当使用较大的基因组DNA片段（如BAC）作为模板时，基因组DNA的二级结构可能会阻碍PCR引物的结合。如果出现这一问题，可在PCR反应前通过超声处理轻柔剪切长片段基因组DNA模板，以获得更佳的PCR结果。</li>
			<li>通过使用0.8% TAE琼脂糖凝胶电泳，并与1 kb DNA ladders比较，验证扩增的PCR产物长度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用限制性内切酶对获得的PCR产物和pGL3-Basic载体进行酶切消化，所用酶应针对正向和反向引物中引入的限制性酶切位点，并按照限制性内切酶产品说明书提供的条件操作。
		<ol>
			<li>使用市售 SV 凝胶和 PCR 纯化系统试剂盒（见材料与设备列表），按照试剂盒说明书纯化消化反应产物21.
			<ol>
				<li>通过琼脂糖凝胶电泳将载体与未切割的载体进行比较，以验证其消化和线性化，随后切下并纯化已消化的载体DNA条带。使用紫外分光光度法测定纯化的PCR产物和纯化载体的浓度（参见材料与设备列表）。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过连接纯化的、经限制性内切酶消化的PCR产物与pGL3-Basic萤光素酶报告载体（包含于报告基因检测试剂盒中；见材料与设备列表），按照插入片段:载体比例为11、21和31进行E1U报告构建体的制备，使用 &#34;T4 DNA连接酶快速连接试剂盒&#34; 按照试剂盒说明书操作22，从而构建出E1U报告基因质粒，命名为pGL3-E1U。
		<ol>
			<li>使用pGL3-E1U质粒按照TA克隆试剂盒说明书（见材料与设备列表）转化细菌，以实现pGL3-E1U的克隆扩增。</li>
			<li>通过序列分析确认插入片段的方向性和保真度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用与E1U相同的方法制备E1A、E1B和E1C的报告基因构建体。通过2.1.5.2节所述的测序方法确认插入片段的准确性。 
		注意：E1A、E1B 和 E1C 的启动子插入片段应分别约为相对于 E1A、E1B 或 E1C 的第一个 5' 核苷酸（指定为 +1）的 −1,875/+10、−1,847/+60 和 −1,904/+83。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>报告基因检测方法 
	注意：报告基因检测的一般策略：将某基因的假定启动子（5'上游区域）插入空载体的多克隆位点 &#34;报告基因&#34; 含有以下成分的载体 &#34;报告基因&#34; (例如，在多克隆位点下游插入萤光素酶（firefly luciferase）。随后将该载体转染至表达目的基因的真核细胞中。在这些细胞中促进目的基因表达的反式作用因子应能激活转染报告载体中的启动子，从而驱动萤光素酶（firefly luciferase）的表达，其表达水平可通过发光检测法进行定量分析。
	<ol>
		<li>选择适用于报告基因检测的适当细胞系。 
		注意：为了评估E1U替代启动子报告基因构建体的活性，必须将该构建体转染至表达由E1U启动子调控的Bcrp1的细胞中。小鼠Sertoli细胞系TM4（见材料与设备清单）表达Bcrp1蛋白以及包含E1U的Bcrp1 mRNA，同时也表达E1A、E1B和E1C5作为阴性对照，可考虑使用不表达 Bcrp1 蛋白或 mRNA 的细胞系。</li>
		<li>在24孔板中培养TM4细胞，初始密度为每孔200,000个细胞，培养基为Ham's F12培养基与Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）等体积混合液，含1.2 g/L碳酸氢钠、15 mM HEPES，并补充5%马血清、2.5%胎牛血清、青霉素（100 IU/ml）和链霉素（100 µg/ml），于37 °C、5% CO₂条件下培养2，如先前所述5.</li>
		<li>细胞接种培养6小时后，使用0.2 µg空pGL3-基础载体或含有−1,906/+64 E1U、−1,875/+10 E1A、−1,847/+60 E1B或−1,904/+83 E1C的0.2 µg pGL3载体进行转染 Bcrp1 缺失构建体以及 4 ng pRL-TK（一种 海肾 荧光素酶表达载体）作为内参对照，使用商用DNA转染试剂盒并按照生产商的说明书进行操作23 （参见材料与设备清单）。</li>
		<li>转染后30小时，从培养的转染细胞中移除生长培养基。用200 µl PBS洗涤细胞一次，然后移除洗涤液。
		<ol>
			<li>测量萤光素酶和 海肾 使用商业试剂盒，按照制造商的说明书检测荧光素酶活性24.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将每根试管的活性表示为萤火虫荧光素酶活性与内参（海肾 荧光素酶）对照；总体结果通常表示为每种报告基因构建体相对于转染空载体pGL3 basic的细胞的活性，后者被设定为1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Bulun, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aromatase+expression+in+breast+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue.</a> Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).</li>
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Douglas D. Ross 和马里兰大学巴尔的摩分校拥有人类 BCRP 的专利权。

大多数方法和代表性结果已在2013年发表的先前研究中描述，该研究题为&#34;Bcrp1在小鼠睾丸中的转录受位于一个新型第一外显子（E1U）上游的启动子调控，该启动子由类固醇生成因子-1调控&#34;5。除了本文所示的代表性结果外，先前的研究还利用5'-RACE PCR和RT-PCR方法估算了替代性第一外显子的使用情况。此外，通过in-silico分析鉴定了E1U上游启动子区中一个假定的SF-1反应元件，并通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实SF-1能够结合该假定的SF-1反应元件。功能研究表明，在小鼠支持细胞中，Bcrp1的转录通过E1U启动子中的SF-1反应元件受到SF-1的调控。这些功能研究包括通过转染或使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（伏立诺他）在TM4细胞中上调SF-1的表达，结果导致Bcrp1 E1U mRNA表达增强，以及Bcrp1蛋白水平升高，并在报告基因检测中观察到Bcrp1 E1U启动子活性增加。最后，这些研究提供了证据表...

超过一半的人类基因受到替代启动子的调控1。每个替代启动子可能包含不同于其他替代启动子的调控元件。在一种组织中使用的启动子可能与在另一种组织中使用的启动子不同。例如，激活特定信号通路可能会触发某一组织中某个基因所使用的替代启动子，但对另一组织中同一基因所使用的另一个替代启动子则可能无影响或产生抑制作用。
Bcrp1 基因的表达受多个替代启动子调控。Bcrp1 是人类乳腺癌耐药蛋白（Breast Cancer Resistance Protein, BCRP）基因的小鼠同源物。BCRP 属于 ATP 结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白家族，正式命名为 ABCG22,3。作为一种位于细胞顶膜的膜蛋白，BCRP/Bcrp1 可介导多种内源性和外源性底物的外排3,4。在人类和小鼠中，BCRP/Bcrp1 在具有重要药理学意义的器官中高度表达，例如肝脏（胆小管）、肠道和肾脏，同时也高表达于具有血液-组织屏障的器官，如胎盘、大脑和睾丸2,5-12。BCRP/Bcrp1 在造血干细胞及其他干细胞（包括肿瘤干细胞）中的表达，可能赋予这些细胞对外源性物质及抗癌化疗药物的耐药性3。
在早期研究正常细胞和肿瘤细胞中BCRP表达调控的工作中，对BCRP mRNA进行了5'端cDNA末端快速扩增（5'-RACE）分析，以确定其精确的转录起始位点13不仅发现了多个转录起始位点，还检测到第一外显子的三种可变形式，这些可变的第一外显子在BCRP中属于非翻译区。这些被命名为E1a、E1b和E1c的可变第一外显子在多种人体组织中表现出不同的表达模式。通过使用BCRP的第二外显子对人类EST数据库进行BLAST搜索，还发现了另外两种第一外显子的变异形式。13. 四个匹配结果显示了第一个外显子 &#62;位于外显子2上游70 kb处，被命名为E1u；另外四个匹配结果显示BCRP mRNA完全缺失第一外显子，被命名为E1-13. 选择性启动子的使用被认为表现为存在可变的5'端外显子14.
在小鼠中，已报道Bcrp1存在四个可变的第一外显子，这些外显子可能对应于调控其表达的可变启动子 Bcrp1 在不同小鼠组织中的转录；这些外显子/启动子被命名为 E1U、E1A、E1B 和 E1C，分别位于 Bcrp1 外显子 2 上游约 70、58、15 和 5 kb 处5,15E1A mRNA 亚型在小鼠造血干细胞、心脏、肺、脾脏和脑组织中占主导地位，而 E1B 亚型则在小鼠肠道、胎肝细胞以及骨髓中的红系前体细胞中表达。5,15. 位于E1B上游的启动子被证实是调控小鼠肠道中Bcrp1转录的主要替代启动子，其调控至少部分依赖于磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（p-CREB）以及该替代性Bcrp1启动子所特有的CREB反应元件16E1C mRNA 亚型主要在成年小鼠的肝脏和肾脏中表达5E1U 亚型在大多数检测组织中均无法检出，仅在小鼠睾丸中可检测到，且为该组织中主要表达的亚型5在大鼠睾丸中表达的 Bcrp1 存在于体细胞（血管内皮紧密连接、管周肌样细胞和塞尔托利细胞）和生殖细胞（位于生精小管上皮，可能对晚期精子细胞具有保护作用）中4E1U上游区域含有类固醇生成因子-1（SF-1）的功能性反应元件5. Bcrp1 mRNA 和蛋白在支持细胞特异性 SF-1 敲除小鼠的睾丸中显著减少，提示小鼠支持细胞中 Bcrp1 的表达受 SF-1 调控5.
所介绍的实验方案详细描述了检测 Bcrp1 基因可变第一外显子的方法 计算机模拟，并建立基于荧光素酶的报告基因检测方法，用于鉴定位于替代性第一外显子上游的潜在启动子。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;商用生物材料与试剂盒：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>First Choice RLM-RACE试剂盒</td><td>Ambion Inc., Austin, TX，现可通过Life Technologies获取</td><td>AM1700</td><td>5'-RACE PCR试剂盒</td></tr><tr><td>TOPO TA克隆试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>K450001</td><td>该试剂盒包含TOP10化学感受态&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;细菌。</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶快速连接试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>Faststart高保真Taq DNA聚合酶</td><td>Sigma-Aldrich/Roche</td><td>3553400001/RMB-4738284001&amp;nbsp;</td><td>包含高保真Taq聚合酶酶混合物</td></tr><tr><td>XtremeGENE HP DNA转染试剂</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>双荧光素酶报告基因检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>包含pGL3-basic空载体（萤火虫荧光素酶）、pRLTK海肾荧光素酶表达载体及其他对照载体。</td></tr><tr><td>QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>用于质粒小量提取——从细菌菌落中分离和纯化质粒DNA</td></tr><tr><td>pCR2.1载体</td><td>TOPO TA克隆试剂盒的组成部分</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含萤火虫荧光素酶的pGL3-basic载体</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td></td></tr><tr><td>pRL-TK海肾荧光素酶表达载体</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>细菌人工染色体</td><td>BACPAC资源中心，Children&amp;rsquo;s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA</td><td>RP23-285A12 和 RP24-314E24</td><td>http://bacpac.chori.org/clones.htm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂/化学品/培养基/耗材&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Wizard&amp;reg; SV凝胶与PCR产物纯化系统&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>适用于限制性内切酶消化后PCR产物的纯化</td></tr><tr><td>CRYOVIALS</td><td>Denville Scientific</td><td>V9012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;软件：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ensembl软件</td><td>Ensembl项目</td><td>http://Ensembl.org&amp;nbsp;</td><td>Ensembl项目为脊椎动物及其他真核生物提供基因组数据库，并在线免费提供这些信息。</td></tr><tr><td>Blast软件</td><td>NCBI</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=&lt;br/&gt; Web&amp;amp;PAGE_TYPE=BlastHome</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3软件</td><td>Simgene</td><td>http://simgene.com/Primer3</td><td>适用于设计5'-RACE PCR引物</td></tr><tr><td>NCBI核苷酸数据库</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;细胞系：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>TM4小鼠Sertoli细胞</td><td>ATCC, Manassas, Virginia</td><td>CRL-1715&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>发光仪</td><td>Turner Biosystems</td><td>TD-20/20</td><td>这是一种相对便宜的手动操作发光仪。同一制造商也提供使用96孔板的自动化系统。</td></tr><tr><td>NanoDrop分光光度计</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>NanoDrop 2000</td><td>分光光度计可使用极少量样品</td></tr><tr><td>DU 800 UV/VIS分光光度计及核酸分析II软件</td><td>BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA</td><td>DU 800</td><td></td></tr></tbody></table>

发现小鼠bcrp1基因替代启动子使用及转录调控的方法

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

不同组织中的基因表达通常由替代性启动子调控，这些启动子可产生具有独特——通常是非翻译区——首外显子的mRNA。Bcrp1（Abcg2）是ABC转运蛋白乳腺癌耐药蛋白（BCRP，ABCG2）的小鼠同源基因，至少具有四个替代性启动子，分别以其对应的四个替代性首外显子命名：E1U、E1A、E1B和E1C。本文介绍了利用in-silico方法预测Bcrp1基因替代性启动子使用的流程。此外，还描述了报告基因检测方法，用于构建针对替代性启动子的报告基因载体，并验证在已鉴定的替代性首外显子上游区域中潜在启动子的功能活性。

通过分析前导外显子鉴定小鼠睾丸中 Bcrp1 替代启动子的利用
当使用方案1中所述步骤在NCBI的EST数据库中进行检索（2015年4月）时，发现了一些与Bcrp1 mRNA第2外显子5'端连续的EST序列，其在基因组DNA中相对于第2外显子起始位置的定位如表1所示。其中一条来源于C57BL/6J小鼠睾丸的EST序列，在基因组DNA中位于第2外显子上游70 kb处，并与Bcrp1 mRNA中的第2外显子相连，对应于E1U（表1）。类似地，还检测到了对应于E1A、E1B和E1C的EST序列。值得注意的是，两条对应于E1C的EST序列还包含E1B与E1C的5'端发生剪接的结构。这些预测的首个外显子在小鼠6号染色体上相对于Bcrp1第2外显子的位置关系如图1</stron...

以小鼠ABC转运蛋白Bcrp1（Abcg2）为例，本文介绍了利用in-silico方法分析在小鼠组织中表达的基因的可变启动子使用情况的流程，并通过报告基因检测方法评估所鉴定出的可变启动子的功能活性。

发现小鼠Bcrp1基因替代启动子使用及转录调控的方法

不同组织中的基因表达通常由替代性启动子调控，这些启动子可导致合成具有独特——通常是组织特异性——5′非翻译区的mRNA。

本套实验方案的总体目标是检测目的基因（如 Bcrp1）mRNA 中的可变第一外显子，并针对这些可变第一外显子上游的潜在启动子建立基于荧光素酶的报告基因检测方法。所采用的生物信息学方法有助于回答转录与调控领域中的关键问题，例如不同组织中 mRNA 表达是如何被调控的。该技术的主要优势在于利用公开可获取的遗传数据来鉴定目的基因 mRNA 中的可变第一外显子，从而提示存在可变启动子的使用。该方法通过构建报告载体并进行报告基因检测，有助于回答基因调控领域中的关键问题，例如假定的替代启动子的功能活性。开始此实验前，将小鼠 Bcrp1 第2外显子的 mRNA 参考序列编号输入 Ensembl 基因组浏览器的搜索窗口，点击“Go”。随后，选择包含16个外显子的全长序列，点击“Download sequence”选项。然后，选择 FASTA 格式并点击预览。在下一个界面中，将外显子 2 的预览序列复制到剪贴板。接着访问 NCBI 网站上的 blast 主页。选择小鼠基因组。将外显子2序列从剪贴板粘贴到查询框中。然后，从数据库下拉菜单中选择EST序列。针对高度相似序列进行优化，然后选择BLAST。当BLAST运行完成后，结果页面将显示。在结果页面的“描述”子标题下，选择“全部”，然后点击“下载”，在下拉菜单中选择FASTA，再点击“继续”。将出现一个 txt 文件。打开并复制整个文件到剪贴板。为了确定 Bcrp1 基因中外显子 2 五端上游 EST 序列的位置，在 BLAST 主页的“专用 BLAST”子标题下，选择“使用 BLAST 比对两条序列”。将剪贴板中的文本文件粘贴到查询框中，并在“目标序列”框中输入 372099104。在“程序选择”中选择“高度相似序列”进行优化，然后运行 BLAST。结果窗口出现后，点击“比对”窗口中的“图形化”以图形方式查看比对结果。使用左右箭头并缩放以聚焦于 Bcrp1/ABCG2 及其序列比对。然后，在“Descriptions”框中选择“All”，在“Download”下拉菜单中选择“Hit Table”，然后点击“Continue”以保存序列比对结果。由于外显子2的5'端位置对应于6号染色体contig上的第58,655,638个核苷酸，因此将该位置指定为+1，然后计算各个EST 5'端部分序列相对于58,655,638的位置。该流程中的关键步骤是预测多个第一外显子，从而在此处鉴定出替代启动子。根据从 EST 数据库中获得的 E1U 序列，将 E1U 的第一个 5' 核苷酸指定为加一。获取包含 Bcrp1/ABCG2 基因序列以及该基因上游至少 100 千碱基序列的小鼠 6 号染色体的反向克隆。然后，选择一个合适的报告载体，例如荧光素酶报告质粒 pGL3-Basic。确定报告载体中的多克隆位点。在pGL3-Basic载体的多克隆位点中，从5'到3'方向的限制性内切酶位点包括KpnI、SacI、MluI、NheI、SmaI、XhoI、BglII和HindIII。接下来，选择E1U外显子上游的两千碱基区域，将该序列粘贴至DNA5中，然后运行程序。将显示单个和多个消化位点的详细信息。随后，在 Excel 表格中比较 E1U 区域上的消化位点列表与 pGL3-Basic 载体上的多克隆位点（MCS）。接下来，使用商业基因引物合成服务或引物选择软件，设计含有限制性内切酶位点的正向和反向 PCR 引物。选择一个位于 E1U 序列上游约两千个碱基的正向引物，以及一个位于 E1U 序列内的反向引物。然后，使用这些引物对 0.01 至 1 微克的 Bak 及含有高保真 Taq 聚合酶的 PCR Master Mix 进行 PCR 扩增，以扩增 E1U 基因组区域。随后，通过 0.8% TAE 琼脂糖凝胶电泳，将扩增的 PCR 产物与 1 千碱基 DNA Ladder 比较，以验证其长度。随后，使用特异性识别引入正向和反向引物中的限制性酶切位点的限制性内切酶，对获得的PCR产物和pGL3-Basic载体进行酶切消化。然后，通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的酶切效果。从琼脂糖凝胶中切下酶切后的载体DNA和两条千碱基大小的PCR条带。接下来，使用商业化的 SV 凝胶和 PCR 产物纯化试剂盒，从凝胶切片中提取已消化的载体 DNA 和两千碱基的 PCR 条带。利用紫外分光光度法测定纯化后的 PCR 产物和纯化载体的浓度。随后，使用 T4 DNA 连接酶快速连接试剂盒，将纯化的经限制性内切酶消化的 PCR 产物与 pGL3-Basic 萤光素酶报告载体进行连接，构建 E1U 报告质粒，所得产物命名为 pGL3 E1U。在此步骤中，将TM4细胞以每孔200,000个细胞的初始密度接种于24孔板中进行培养。细胞接种后6小时，用0.2微克MP pGL3-Basic载体或0.2微克pGL3载体与4纳克pRL-TK（作为内参对照）共同转染细胞。转染后30小时，移除转染细胞的生长培养基。用 PBS 洗涤细胞，然后移除洗涤液。随后使用商用试剂盒检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。将每管的萤火虫荧光素酶活性与内参对照的比值表示为相对活性。该步骤用于验证睾丸特异性启动子的功能活性。此处为Bcrp1启动子E1U、E1A、E1B和E1C在球部中的报告基因检测，所用细胞完全来源于TM4细胞。数据以萤火虫荧光素酶的发光强度相对于海肾荧光素酶的归一化值表示。星号表示与 MP pGL3 载体对照组相比存在显著差异。该图显示了 Bcrp1 E1U 报告基因构建体中 SF-1 反应元件突变对荧光素酶活性的影响。将含有假定 SF-1 结合区域的 Bcrp1 报告基因构建体转染至 TM4 细胞中，并在有或无强制表达 SF-1 的条件下进行检测。图中，a 表示与空载体 pGL3 对照组相比存在显著差异；b 表示与转染载体中的 E1U 启动子构建体相比具有统计学上的显著差异。在进行该实验操作时，需注意选择适合报告基因检测的细胞系。该细胞系应能在报告基因构建体中的启动子调控下表达目的基因。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如定量 RT-PCR）来评估多个组织样本中替代启动子的使用情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何预测目标基因的替代启动子使用，并确定该启动子的功能性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

方法发现小鼠BCRP1的另类用法子和转录调控

本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）实验流程，用于对在组蛋白结合结构域上存在差异的蛋白质亚型进行全基因组定位分析。我们将其应用于ChIP-Seq分析，以鉴定KDM5A/JARID1A/RBP2组蛋白去甲基化酶的作用靶点。...

使用染色质免疫共沉淀进行全基因组分析以鉴定亚型特异性基因靶点

基因报告基因检测是一种成熟且强大的工具，用于解析DNA序列与其基因调控活性之间的关系。将候选调控元件与携带可识别序列标签的报告基因相偶联，可实现这些检测的大规模平行化。...

在培养的哺乳动物细胞中进行大规模平行报告基因分析

本文所述方法用于在特定步骤诱导凋亡信号级联反应，以解析抗凋亡细菌效应蛋白的活性。该方法也可用于诱导表达促凋亡或毒性蛋白，或用于研究对其他信号通路的干扰作用。...

应用可诱导表达系统研究细菌毒力因子对细胞内信号通路的干扰

DNA 调控元件（如增强子）通过与靶基因启动子发生物理接触来调控基因表达，这种接触通常通过跨越较大基因组距离的长距离染色体相互作用实现。启动子捕获...

启动子捕获Hi-C：启动子相互作用的高分辨率全基因组分析

本文介绍了一种显性负性可诱导系统的构建方案，该系统可通过可逆地过表达目标蛋白的显性负性突变体，从而实现对任意蛋白的条件性失活。...

可诱导且可逆的显性负效应（DN）蛋白抑制

本文介绍了一种高效染色质免疫沉淀（ChIP）后接高通量DNA测序（ChIP-seq）的实验方案，适用于从小鼠分离的棕色脂肪组织（BAT）样本。该方案可用于全基因组范围内组蛋白修饰的定位分析，以及非组蛋白目标蛋白的全基因组定位研究。 体内.

小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀

本方案概述了构建一种模型系统所需的步骤，该系统可利用增强型lac阻遏蛋白和/或tet激活蛋白系统，在活体动物或细胞中条件性地调控目的内源基因的转录。...

体内应用REMOTE-控制系统调控内源性基因表达

直接递送预先组装的Cas9/向导RNA核糖核蛋白复合物是实现造血细胞基因组编辑的一种快速高效的方法。在此，我们利用该方法删除RUNX1基因内含子中的沉默子，并检测OCI-AML3白血病细胞中的转录应答。...

利用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在急性髓系白血病细胞中研究 RUNX1 内含子沉默子的转录调控作用

本文介绍了一种用于逆转录病毒过表达及小鼠B-1a细胞过继转移的方法，以研究B-1a细胞在体内的迁移与定位。该方案可进一步扩展用于多种下游功能检测，包括定量分析供体B-1a细胞的定位，或在过继转移后检测供体细胞衍生的分泌因子。...

在小鼠B-1a细胞中通过逆转录病毒过表达CXCR4并进行过继转移，以实现B-1a细胞向骨髓的靶向迁移及IgM的产生

基因表达受到基因启动子与远端调控元件相互作用的调控。本文介绍了低起始量的捕获染色体构象捕获技术（liCHi-C）如何实现对稀有细胞类型中这些相互作用的鉴定，而这些细胞类型在此前是无法测量的。...

一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

了解如何利用生物信息学方法检测小鼠Bcrp1基因的替代启动子，并通过荧光素酶报告基因实验验证其功能活性。该技术为研究基因转录调控机制提供了有效框架。

发现小鼠Bcrp1基因替代启动子使用及转录调控的方法

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