结合光遗传学和冷冻断裂免疫标记副本研究在老鼠杏仁核谷氨酸受体的特定投入安排

该程序将光遗传学与冻结断裂复制免疫标记技术相结合，其目标是分析小鼠杏仁核突触处离子型谷氨酸受体的密度，以及已识别的突触前和突触后元件。当与光遗传学相结合时，这种冷冻断裂复制免疫标记技术的高重现性和多功能性为突触结构和功能特性的相关分析提供了一种非常强大的方法。该程序的主要优点是：突触前和突触后元件的平面视图，以及这些特殊微结构域中蛋白质的定量分析。

不同的技术可以适用于各种不同的组织，以研究整合膜蛋白的分布和组织。通常，这种组合的光遗传学 FRIL 方法对于初学者来说具有挑战性，因为需要大量不同的设备和机器。使用不同的方法开始调制至关重要，因为其他一些步骤很难学习。

例如，破裂和复制冷冻标本 要开始此过程，请将小鼠大脑的冠状块粘在振动切片机的支架上。调整组织块的方向，使新皮层面向振动的刀片。接下来，将含有杏仁核的冠状切片，厚度为 140 微米，放入零点 1 磨牙，冰冷的 PB 中。并将它们收集在相同缓冲液中的六孔培养皿中。

在立体显微镜下，在涂有硅弹性体并填充零点一摩尔 PB 的培养皿中从切片中修剪出感兴趣的区域。然后，将修剪后的块转移到冷冻保护溶液中，并在 6 摄氏度下保存过夜。在此步骤中，准备铜载体以用于 FRIL 程序的后续阶段，用假皮片作为去污剂抛光它们。在显微镜下，将一圈双面胶带贴在铜载体上，该铜载体将用作修剪块的固定孔。

然后，使用铂丝环将修剪后的块放入双面胶带的孔中。使用滤纸或刷子去除多余的冷冻保护剂溶液。然后，用另一个托架盖住固定托架。

使组织块夹在两个载体之间。要冷冻标本，请将载体夹层插入标本夹具座中。随后，将样品架插入高压冷冻装置中。

按下 jet-auto 按钮开始冷冻循环，立即取下样品架，然后将吸头浸入装有液氮的绝缘盒中。然后，小心地从样品架中取出载体三明治，并将其放入预冷的冷冻管中。将含有载体的冻存管储存在低温槽中直至复制。

在插入电子束枪之前，请取下带有导流板的防护罩。将用于使灯丝居中的调整规通过下阴极盖放入筒夹卡盘中。接下来，将新细丝滑过仪表，直到压力层夹住细丝的末端。

然后，取下定型规并插入碳棒。通过拧紧蒸发器杆支架的夹头卡盘来修复它。确保杆端的高度从底部开始位于第二个线圈的中间。

之后，更换导流板，并将电子束枪插入冷冻断裂装置。在此过程中，调整蒸发的电流和电压。接下来，将冷冻载体三明治插入液氮中的双复制表中。

然后，将双复制台转移到杜瓦瓶上，并将其以 45 度角固定在样品台接收器上。使用表纵器拾取双副本表。将其插入冷冻断裂装置中，置于低温台上，等待约 20 分钟，让双复制台的温度调整到零下 115 摄氏度。

然后，通过手动逆时针旋转轮子来破坏组织，该轮子连接到双复制台上方的护罩。当护罩转动时，它会迫使双复制台打开，从而导致组织破裂。将 90 度角的碳层涂在断裂面上。

随后，从双复制台中取出复制的标本，并将它们转移到装有 TBS 的陶瓷 12 孔板中。使用铂环线棒，从标本载体中取出复制的组织。对于 SDS 消化，将复制品转移到装有 1 mL SDS 消化缓冲液的 4 mL 玻璃瓶中。

让它在 18 摄氏度下摇晃消化 80 小时。对于免疫标记，在新鲜的 SDS 消化缓冲液中洗涤复制品 10 分钟。然后，将其与用 2%BSA-TBS 稀释的一抗和二抗在 15 摄氏度的潮湿室中孵育 24 至 72 小时。

之后，将复制品安装在成型远涂层的 100 线双杠网格上。使用 80 或 100 KB 的透射电子显微镜对复制品进行成像。然后，通过 CCD 相机获取数字图像。

当它处于离线状态时，使用不同的地标从副本中查找图像上的相应区域。AAV 注射后 4 周，为了在丘脑后核群中表达通道视紫红质-2，通道视紫红质-2 沿丘脑轴突有效顺行运输，以到达杏仁核插层细胞团。谷氨酸能突触的突触后特化可以在复制品中被识别为质膜 E 面上的一簇膜内颗粒，并且通常伴随着其突触前元件的 P 面。

在这里，使用与二抗偶联的不同大小的金颗粒可视化通道视紫红质-2 和谷氨酸受体。由于缺乏结构或分子工具来检测同一复制品上的突触后膜是否属于插层神经元。相应的复制品被标记了 mu 阿片受体，这是这些神经元的标志物。

作为这些突触处谷氨酸受体密度定量分析的一个例子，以下是 ampa 受体的金颗粒数量与棘和树突突触区域的散点图。这揭示了两种结构中的正相关。在尝试此过程时，请务必记住，各个步骤是高度相互依赖的。

因此，其中一个步骤中的错误可能会危及整个过程。在复制品的二维表面上观察大部分质膜特化，可以检查感兴趣分子的空间分布和物理连续性，而无需费力和耗时地重建连续促营养因子切片。其他研究人员可以使用这种方法来深入了解神经回路中特定突触的结构-功能关系。

它解开了输入的起源和突触后元素的性质。很关键，但有问题。