Name: 结合光遗传学和冷冻断裂免疫标记副本研究在老鼠杏仁核谷氨酸受体的特定投入安排 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习结合光遗传学与冷冻断裂免疫标记技术，定量分析小鼠杏仁核突触中离子型谷氨酸受体的密度与分布。该方法可实现突触结构与功能的关联分析，揭示神经微环路的分子组织机制。

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本研究由奥地利科学基金 FWF 资助，资助编号为 P-22969-B11（授予 F. Ferraguti），以及由慈善赫蒂基金会、Werner Reichardt 神经科学整合研究中心和德国研究基金会（DFG，CIN-Exc. 307）资助（授予 I. Ehrlich）。

<ol><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes%3A+practical+procedure%2C+interpretation+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li>
<li>Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+quantitative+visualization+of+glutamate+and+GABA+receptors+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).</li>
<li>Rash, J. E., Yasumura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+immunogold+labeling+of+connexins+and+aquaporin-4+in+freeze-fracture+replicas+of+liver%2C+brain%2C+and+spinal+cord%3A+factors+limiting+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis.</a> Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).</li>
<li>Emes, R. D., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+synapse+complexity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of synapse complexity and diversity.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).</li>
<li>Matsuzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+geometry+is+critical+for+AMPA+receptor+expression+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).</li>
<li>Rollenhagen, A., Lübke, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+excitatory+central+synapses%3A+from+structure+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The morphology of excitatory central synapses: from structure to function.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).</li>
<li>Tarusawa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-specific+intrasynaptic+arrangements+of+ionotropic+glutamate+receptors+and+their+impact+on+postsynaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses.</a> J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).</li>
<li>Nusser, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).</li>
<li>Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+variability+in+synaptic+N-methyl-D-aspartate+receptor+density+on+interneurons+and+a+comparison+with+pyramidal-cell+spines+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).</li>
<li>Nicholson, D. A., Geinisman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axospinous+synaptic+subtype-specific+differences+in+structure%2C+size%2C+ionotropic+receptor+expression%2C+and+connectivity+in+apical+dendritic+regions+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+cells+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li>
<li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li>
<li>Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+correlates+of+fear+extinction+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.</a> Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).</li>
<li>Duvarci, S., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+microcircuits+controlling+learned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amygdala microcircuits controlling learned fear.</a> Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).</li>
<li>Jüngling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+S-mediated+control+of+fear+expression+and+extinction%3A+role+of+intercalated+GABAergic+neurons+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala.</a> Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).</li>
<li>Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li>
<li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).</li>
<li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition%2C+expression%2C+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li>
<li>Sigurdsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+the+amygdala%3A+a+cellular+mechanism+of+fear+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li>
<li>Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex-vivo+optogenetic+dissection+of+fear+circuits+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53628(2016).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Bienvenu, T. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+intercalated+neurons+of+amygdala+relay+noxious+sensory+information%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information.</a> J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).</li>
<li>Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+aggregations+at+specialized+sites+in+freeze-etched+postsynaptic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes.</a> Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).</li>
<li>Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+intercalated+neurons+are+required+for+expression+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.</a> Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).</li>
<li>Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-synapse-type+and+inter-synapse-type+relationships+between+synaptic+size+and+AMPAR+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).</li>
<li>Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+cytochemistry+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunogold cytochemistry in neuroscience.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).</li>
<li>Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFukazawa%2C+Y+%22Handbook+of+Cryo-Preparation+Methods+for+Electron+Microscopy%22">Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy</a>. Cavalier, A., et al. , CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).</li>
<li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).</li>
<li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li>
<li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subsynaptic+localization+of+type+1+metabotropic+glutamate+receptors+at+glutamatergic+and+GABAergic+synapses+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex.</a> Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

冰冻断裂电子显微镜技术在超微结构研究中已有40多年的历史，是一项重要的研究手段。然而，由于缺乏有效的方法来研究膜的分子组成，该技术的使用曾显著减少。近年来，随着通过免疫胶体金标记揭示整合膜蛋白的有效方法的发展，特别是FRIL技术的出现，冰冻断裂电子显微镜技术得到了重大复兴1, 2。
FRIL 技术相较于其他免疫金超微结构方法具有多项优势。首先，蛋白质对抗体的可及性更高，从而提高了检测灵敏度。其次，质膜特化结构（如突触后膜）的大部分区域暴露于复型的二维表面，使得研究人员能够直接观察目标分子的空间分布和物理连续性，而无需进行繁琐且耗时的连续超薄切片三维重建。第三，由于质膜的两个半部分均可利用，只要存在合适的抗体，就可对每个特定结构标记更多的蛋白质。在膜断裂后，裂面的疏水面会被碳-铂镀膜覆盖，从而固定残留在断裂面上的蛋白质结构域，这会阻止抗体与这些结构域中的抗原结合。例如，在复型的 P 面上，只有朝向胞质空间的抗原表位可被抗体识别；而在 E 面上，只有朝向外胞质空间的抗原表位才能与抗体结合（见图 2）。
另一方面，冷冻断裂免疫标记技术（FRIL）也存在某些局限性2。由于断裂是随机发生的，可能难以针对特定细胞或结构进行观察。这还可能导致取样偏差，例如在突触收集过程中，因不同曲率结构（例如树突棘与树突干）的膜发生断裂的概率不同所致。此外，膜蛋白被分配到两个断裂面之一的结果具有不可预测性。因此，特别是在进行定量研究时，应使用可识别胞内和胞外结构域的抗体，仔细验证蛋白在P面或E面上的分布情况。最后，仅依靠形态学特征时，可能难以在复型样品中识别某些结构，例如突触前轴突终末。然而，使用针对标志蛋白的特异性抗体，或通过病毒载体转导带有标签的整合膜蛋白或通道蛋白，可为断裂膜的识别提供额外工具。例如，本研究利用在丘脑神经元中转导ChR2-YFP，以鉴定其在杏仁核中的轴突投射，或通过标记μ-阿片受体以识别ITC神经元的突触后膜。
为了成功实施FRIL技术，需特别注意组织固定。强组织固定（&#62; 2%多聚甲醛）可能导致较高的断裂率并降低标记灵敏度。另一方面，固定不足会使组织处理和制备（例如， 切片难度增加。还需注意控制修整后样品块的厚度与双面胶带的厚度相匹配。若样品厚度小于胶带厚度，组织表面可能无法与两个金属载片表面充分接触，导致冷冻样品无法断裂；若组织过厚，则在两个铜载片形成三明治结构时会受到挤压，不可避免地造成结构变形。样品断裂时的温度（本方案中为 -115 °C）也对复型结构具有重要影响。较高温度可能导致更多伪影产生，例如在蒸发前或蒸发过程中水蒸气在组织表面冷凝；较低温度（&#60; -125 °C）可能会增加断裂过程中材料剥落的风险。这些剥落的材料可能掉落在样品表面，或仍与样品相连。这些材料碎片也会被镀膜和染色，从而在图像上形成暗斑。在较低温度下断裂还可能影响横断裂的频率，特别是对于树突棘等微小精细结构。复型制备中的另一个关键步骤是去污剂消化。如果消化不完全，未消化的组织会在复型上呈现为暗斑，干扰透射电镜下结构的分析。此外，未消化的组织可能非特异性地捕获或结合抗体，导致背景标记增强。另一方面，使用去污剂进行组织消化可能导致与复型相关的分子变性，改变其二级和三级结构。因此，对于某些抗原，可能需要通过增加洗涤步骤逐步稀释SDS的浓度。
进行免疫标记时，使用不同尺寸的金颗粒标记的二抗可同时检测多种蛋白质，即使是在细胞膜的特定微区（如突触后特化结构）中，也能实现检测，但仅限于定性分析。然而，由于空间位阻效应，定量研究通常仅限于检测一种分子。金颗粒的尺寸还可能影响标记效率。
在解释FRIL中的标记时，应考虑到由于一抗和二抗形成的柔性复合物，免疫金颗粒可能位于距抗原20-25 nm半径范围内的半球空间内的任意位置26。有关FRIL及相关技术的理论与实践的进一步信息，我们还建议读者参考其他方法学文章27, 28。
FRIL 技术最近已被用于对不同类型突触中谷氨酸受体定位进行高分辨率的定量分析29, 30。此外，FRIL 技术对 AMPA 受体（AMPA-Rs）的检测灵敏度估计可高达每个功能性 AMPA 受体通道对应一个免疫金颗粒29。因此，该方法总体上非常适用于对中枢突触中 AMPA-Rs 和 NMDA-Rs 的突触后表达模式进行定量与分析。本文中，我们证明了该技术在 PIN/MGn-ITC 突触上的适用性，该位点极有可能在恐惧条件反射过程中传递非条件刺激（US）信息。使用针对 AMPA 受体亚基 GluA1-GluA4 高度保守的胞外氨基酸残基所制备的抗体，我们发现金颗粒在对应于突触后膜特化结构的膜内颗粒（IMP）簇内呈均匀分布。ITC 树突棘突触中 AMPA-Rs 的密度显著高于 PIN/MGn 丘脑传入纤维所支配的轴突干突触。在树突棘和轴突干突触中，均检测到 AMPA-Rs 标记水平与突触后面积之间存在正相关关系，这一特征也见于其他谷氨酸能突触25。PIN/MGn-ITC 突触中 AMPA-Rs 密度的低变异程度表明其分布具有均一性，类似于其他由丘脑传出纤维形成的突触7，但不同于皮层突触25。相反，NMDA-Rs 的密度变异程度更高，且在树突棘与轴突干突触之间无显著差异，提示其调控机制与 AMPA-Rs 不同。未来，FRIL 技术的高度可重复性不仅有助于评估中枢突触的基础分子组成，还可能促进在恐惧学习后对离子型谷氨酸受体数量及其突触下分布变化的检测，从而补充这些传入通路突触前和突触后特性的离体（ex-vivo）电生理记录研究。
总之，这种方法可被其他研究者用于深入探究多种其他神经回路中特定输入性兴奋性突触的结构-功能关系，尤其适用于那些需要区分输入来源以及明确突触后成分的性质与组成、但目前仍存在困难的研究场景。

近年来，随着多种适用于透射电子显微镜的免疫标记技术的发展，对生物膜在纳米尺度上功能结构的解析面临新的挑战。然而，这些技术 例如， 免疫金标技术（包括包埋前和包埋后标记）存在若干重要局限性，例如抗原检测效率低和/或对膜结合蛋白的定量评估受限。这些局限性在神经系统精细结构的研究中尤为突出，因为神经系统具有高度的细胞多样性和突触异质性。这种异质性源于突触前和突触后成分在结构与功能上的差异，以及信号蛋白（如受体、转运蛋白和效应分子）在表达水平、富集程度或相互作用方面的差异。
二十年前，Fujimoto 首次提出了一种直接对去垢剂溶解的冰冻断裂复型（FRIL）中整合性或交联膜蛋白进行免疫标记的新方法。 1. 然而，这一原始方法存在若干局限性， 即， 复制品严重碎片化，阻碍了在脑等复杂组织中将标记分子与单个定位细胞进行有意义的相关性分析。大约10年前，Shigemoto和Fukazawa逐步改进了该技术 2这一进展与科罗拉多州立大学博尔德实验室的另一组科学家所开展的工作相呼应，他们也显著改进了该技术，特别是在间隙连接的研究方面。 3.
随着冷冻断裂技术方案和设备的改进，以及快速冷冻（高压下）技术的引入，研究人员现在能够制备出较大尺寸且高质量的完整复型样品，并获得大多数细胞组分的高分辨率图像，从而避免了强化学固定所带来的局限性和人工假象。
FRIL 技术具有高度定量化的显著优势 原位 在复杂组织（如脑组织）中，对经过组织学定位和细胞学鉴定的细胞内一种或多种蛋白质进行（同时）鉴定，此外还可通过单个复制品获得突触前和突触后结构元件的平面视图。因此，尽管冷冻断裂复制免疫标记技术（FRIL）面临诸多技术挑战，仍有望在多个重要科学领域实现突破，尤其在关联单个突触的结构与功能特性方面具有重要意义。在过去的几十年中，研究人员已获得了大量关于突触结构、分子组成及其生理功能的信息；然而，突触在形态和分子水平上具有高度异质性，其特征取决于突触前和突触后神经元的类型。 4迄今为止，仅有少数几种突触类型完成了结构与功能的研究 5-7这主要是由于技术限制，无法精确鉴定突触前和突触后成分的性质。
超微结构分析在突触后膜特化结构的多样性方面提供了关键见解，揭示了不同突触连接在突触大小以及神经递质受体含量方面的差异6，这些差异对突触传递的强度和可塑性具有重要影响。此外，大量研究表明，在不同类型突触处表达的离子型谷氨酸受体数量受到传入纤维和靶细胞依赖性方式的调控7-10。
本文介绍了一种方法，可用于分析具有明确突触前成分和功能的突触后膜特化结构及其受体组成。该方法结合了突触前表达新型光敏感藻类蛋白（如通道视紫红质2，ChR2）的技术与冷冻断裂复制免疫标记法（FRIL），以研究突触后膜上α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA-Rs）和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA-Rs）谷氨酸受体的分布模式。该方法在后丘脑-内侧膝状体核（PIN/MGn）轴突与杏仁核内侧间质细胞群（ITC）神经元之间形成的突触上进行了验证。ITC神经元是小而有棘的GABA能神经元，成簇分布于基底外侧杏仁核复合体（BLA）周围11, 12。已知ITC神经元接收来自BLA主神经元的兴奋性输入，并投射至中央杏仁核（CeA），因此在BLA与CeA之间的信息传递中起抑制性门控作用12-15。
最近，我们证明了位于基底外侧杏仁核（BLA）与中央杏仁核（CeA）之间内侧背侧簇中的小胶质细胞间质神经元（ITC神经元）也直接接收来自感觉丘脑和颞叶皮层区域的兴奋性输入，这些输入在经典条件性听觉恐惧学习过程中会发生改变16。恐惧条件化是脑机制研究中最清楚的联想学习形式之一。在恐惧条件化中，一个原本中性的条件刺激（CS，例如，一种音调）与一种令人厌恶的非条件刺激（US，例如，轻微足底电击）配对，从而形成CS-US关联并引发条件性恐惧反应17, 18。已知分别携带代表CS和US信息的丘脑和新皮层区域的兴奋性输入会汇聚到杏仁核外侧核（LA）的锥体神经元上，并发生可塑性变化19。我们先前的研究揭示，感觉输入信息也会平行地传递至ITC神经元16。
为了对投射到ITC神经元的单个感觉输入突触进行机制性的分子分析，我们使用腺相关病毒（AAV）表达与黄色荧光蛋白（YFP）标记的ChR2。将AAV注射到PIN/MGn区域，并通过ChR2-YFP的表达来鉴定轴突末梢。我们利用FRIL技术获得的两个切面，评估PIN/MGn轴突末梢与ITC神经元形成的突触处突触后AMPA受体（AMPA-Rs）和NMDA受体（NMDA-Rs）的密度。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;手术&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>可由其他小鼠用立体定位仪替代</td></tr><tr><td>小鼠适配器（用于立体定位仪）</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>小鼠用气体麻醉面罩</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>已停产，由货号 51609M 替代</td></tr><tr><td>压力注射装置，Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>可使用其他压力注射装置（例如 Picospritzer）</td></tr><tr><td>Kwik Fill 玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>麻醉机，IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>直流温度控制器及加热垫</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>水平式微电极拉制仪 P-1000 型</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>外科器械灭菌器，Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP（血清型 2/9）</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>快绿染料</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉剂，Isofuran CP（1 ml/ml）</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消毒剂，Betadine（聚维酮碘）</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>可由其他消毒剂替代</td></tr><tr><td>镇痛药，Metacam 溶液（5 mg/ml 美洛昔康）</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>可由其他镇痛药替代</td></tr><tr><td>Bepanthen 眼膏</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>可由其他眼膏替代</td></tr><tr><td>钻机 NM3000（SNKG1341 和 SNIH1681）</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox 缝合针</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>编织丝线缝合线</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜级甲醛</td><td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>饱和苦味酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>硫喷妥钠</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure 超纯水系统</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>50131235</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>ISMATEC, Germany</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机，VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼科手术刀</td><td>Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>可由其他眼科手术刀替代</td></tr><tr><td>灌注套管</td><td>Vieweg, Germany</td><td>F560088-1</td><td>可由其他公司类似产品替代</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;高压冷冻&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铜载样器</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol 抛光剂</td><td>Henkel, Germany</td><td></td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>麂皮</td><td>家用商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>打孔器，1.5 mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>变性乙醇</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Roth, Germany</td><td>9372.5</td><td>注意！</td></tr><tr><td>高压冷冻机 HPM 010</td><td>BalTec, CH；现为 Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>已停产，由 LeicaEM HPM100 替代</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td>注意！</td></tr><tr><td>冷冻管</td><td>Roth, Germany</td><td>E309.1</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>液氮储存罐</td><td>Cryopal, France</td><td>GT38</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>非离子型去污剂（Lavocid）</td><td>Werner &amp;amp; Mertz Professional, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;冷冻断裂与复型&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>喷砂机，Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>SANDURET 2-K</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>碳化硅 SIC 360，粒径 25 - 21&amp;micro;</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>冷冻断裂系统 BAF 060</td><td>BalTec, CH；现为 Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>陶瓷 12 孔板</td><td>Gr&amp;ouml;pel, Austria</td><td>14511</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>Trizma 盐酸盐</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck, Germany</td><td>1,064,041,000</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>SDS，十二烷基硫酸钠</td><td>Roth, Germany</td><td>5136.1</td><td>注意！；&amp;nbsp;可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Merck, Germany</td><td>1,076,871,000</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>5429.3</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>通用杂交炉</td><td>Binder, Germany</td><td>7001-0050</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫标记&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>抗-GFP 抗体</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>抗-泛AMPA受体抗体</td><td>Frontier Institute, Japan</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>抗-NMDAR1 抗体，克隆号 54.1</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>阿片受体-μ（MOR）抗体</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>电镜用山羊抗豚鼠二抗，5 nm</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAG5</td><td></td></tr><tr><td>电镜用山羊抗兔二抗，15 nm</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAR15</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔二抗，10 nm</td><td>AURION, Netherlands</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>铜网，100 目平行条纹</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>火棉胶粉末</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Roth, Germany</td><td>3313.1</td><td>注意！；&amp;nbsp;可由其他公司同类产品替代</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;电镜分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 透射电镜</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD 相机</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2 图像软件</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

结合光遗传学与冰冻断裂复制免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

冰冻断裂电子显微技术在超微结构研究中已有40多年的历史，是一项重要的研究手段。然而，由于缺乏有效的方法来研究膜的分子组成，该技术的使用曾显著减少。近年来，随着能够通过免疫金标记揭示整合膜蛋白的有效方法的发展，冰冻断裂电子显微技术得到了重大复兴。其中一种方法称为去垢剂溶解冰冻断裂复型免疫标记法（FRIL）。
将FRIL技术与光遗传学相结合，可实现对中枢突触结构与功能特性的关联分析。利用该方法，可通过标记的通道视紫红质和特异性分子标记物的表达，分别鉴定并表征突触前和突触后神经元。谷氨酸能突触突触后膜特化结构的独特形态，使得在标记离子型谷氨酸受体后，能够定量分析这些受体在突触内的分布情况。本文将逐步描述制备成对复型样品及其免疫标记所需的操作流程。同时，我们也将讨论FRIL技术的注意事项与局限性，特别是与潜在取样偏差相关的问题。FRIL技术具有高度可重复性和广泛适用性，当其与光遗传学结合时，为在脑内已知神经微环路中表征突触传递的多个方面提供了一种极为强大的研究手段。
本文举例说明了该方法如何被用于研究小鼠杏仁核内侧间质细胞群神经元兴奋性突触的结构与功能关系。具体而言，我们研究了源自丘脑后内侧板内核和内侧膝状体核的特定输入中离子型谷氨酸受体的表达情况。这些突触被证实可传递与恐惧学习相关的感觉信息，并在恐惧条件反射过程中发生可塑性变化。

FRIL 技术与微生物来源的光遗传学效应蛋白的表达相结合时 21, 即， 整合于质膜并能沿轴突有效进行顺向运输的通道，可实现对特定突触亚群中AMPA受体和NMDA受体突触后表达的定量检测。本文展示了来自不同丘脑核团的轴突中的应用实例。例如， 将PIN/MGn投射至杏仁核内的ITC神经元。该方法能够对单个感觉传入突触在ITC神经元上的连接进行分子水平分析，而ITC神经元群至今仍难以通过详细的解剖学与分子特征进行表征。
在将rAAV-ChR2-YFP立体定位注射至PIN/MGn区四周后，ChR2-YFP阳性轴突密集支配了杏仁核的外侧杏仁核（LA）、杏仁核纹状体过渡区（Astria）以及内侧被囊旁ITC簇，该分布模式与先前的示踪研究结果完全一致16, 22。我们还在注射rAAV-ChR2-YFP小鼠的冰冻断裂复型样本中，在轴突和终末的P面观察到强烈的ChR2-YFP金标免疫反应信号（图5A），而在未注射小鼠的复型样本中则未检测到该信号。在复型样本中，兴奋性谷氨酸能突触的突触后膜特化结构表现为质膜E面上的一簇膜内颗粒（IMPs）2, 23，通常伴随其突触前质膜的P面出现7（图5B-C）。这些特征使我们能够识别由PIN/MGn轴突终末形成的谷氨酸能突触的突触后特化结构（图5和图6）。我们使用一种可识别全部四个亚基（GluA1-4）的抗体标记AMPA受体（AMPA-Rs），而NMDA受体（NMDA-Rs）则通过针对关键NR1亚基的抗体进行检测。
由于缺乏在同一复制品上检测这些突触是与ITC神经元的树突棘还是树突干形成的工具，我们对相应的复制品表面进行了μ-阿片受体标记，因为ITC神经元在突触后表达高水平的这类受体24。这需要利用参照标记（图4E）的策略，在两个复制品中识别相同的突触后结构（图5C-F 和 图6A-D）。
<img alt="冰冻断裂电镜、突触小泡融合、PSD、E面、P面、电子显微镜结果。" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 通过免疫金颗粒在复型膜上检测 ChR2-YFP 和离子型谷氨酸受体。 （A）一个横断的轴突末梢（浅蓝色）及其部分 P 面被 15 nm 金颗粒标记以检测 ChR2-YFP。在末梢内可见多个突触小泡的膜（sv）。注意免疫标记主要局限于质膜，具有较高的特异性。ChR2 的标记表明该末梢起源于 PIN/MGn。该末梢与一个树突棘形成不对称突触。在 E 面上的突触后膜特化结构（PSD）显示出成簇的膜内颗粒，并被 5 nm 金颗粒标记，显示 AMPA 受体的存在。（B）表达 ChR2 的轴突 P 面（以 15 nm 金颗粒标记）与两个树突相邻，其中一个树突含有两个被 5 nm 金颗粒标记的 PSD，显示 NMDA 受体的存在。（C-D）PIN/MGn-ITC 突触的突触前和突触后膜的相对面。（C）末梢的 P 面表达 ChR2（以 15 nm 金颗粒标记），覆盖在两个树突干的 E 面上，其中一个树突干含有两个被标记 AMPA 受体的 PSD（5 nm 金颗粒）。（D）两个树突相应的 P 面被标记为 μ-阿片受体（10 nm 金颗粒）。（E-F）虚线框区域的放大视图。比例尺：500 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在PIN/MGn-ITC突触的IMP簇内各处均发现有AMPA受体的免疫标记颗粒，提示其在突触后特化区域呈均匀分布（图5E）。与投射至ITC树突的突触（590±44 个金颗粒/µm2，n = 32）相比，投射至ITC树突棘的PIN/MGn-ITC突触中AMPA受体标记密度显著更高（非配对t检验，p&lt;0.018），达到715±38 个金颗粒/µm2（n = 32）。总体而言，PIN/MGn-ITC突触中AMPA受体的密度变异程度相对较低（变异系数CV = 0.37），符合其均匀分布的特征。
在PIN/MGn-ITC突触的突触后膜致密区（postsynaptic IMP）簇内，常观察到NMDA受体（NMDA-Rs）的免疫颗粒分布不均（图5B）。PIN/MGn传入至ITC树突棘的突触中NMDA受体标记密度（1070±153 个金颗粒/µm2，n=8）与传入至ITC树突的突触（812±183 个金颗粒/µm2，n=9）相比无显著差异（非配对t检验，p=0.39）。与AMPA受体（AMPA-Rs）的观察结果不同，PIN/MGn-ITC突触中NMDA受体的密度变异程度较高（变异系数CV = 0.54）。
<img alt="显示具有金颗粒的突触结构的电子显微镜图像，以及数据分析图表的示意图。" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 在鉴定出的PIN/MGn-ITC突触处AMPA受体和NMDA受体的免疫标记。 
(A-B) PIN/MGn-ITC突触的突触前和突触后膜相对面，该突触形成于树突棘上，其中终末的P面表达ChR2（用15 nm金颗粒标记），而树突棘上的PSD标记了AMPA受体（5 nm金颗粒）。(C-D) 虚线框出区域的放大视图。这些区域已逆时针旋转约45°，以便更清晰地观察PSD。(E) ITC树突棘和树突中AMPA受体颗粒数量与突触面积的散点图。在两种结构中均观察到正相关关系。(F) ITC树突棘和树突中NMDA受体颗粒数量与突触面积的散点图。仅在树突棘中检测到显著的正相关关系。比例尺：500 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
由于突触前质膜的P面常常部分覆盖在突触后IMP簇上，我们仅能估算出30%突触的突触面积（树突棘：平均面积0.032 µm2，范围：0.007至0.063 µm2，n = 8；树突：0.047 µm2，范围：0.024至0.166 µm2，n = 11）。这些数值与先前分析的端脑谷氨酸能突触范围相似25。
在树突棘和树突中，单个突触内AMPA受体的胶体金免疫颗粒数量与突触面积呈正相关（Spearman法，树突棘：r = 0.88，树突：r = 0.60，p&lt;0.0001）（图6E）。相反，NMDA受体的胶体金免疫颗粒数量仅在树突棘中与突触面积相关（Spearman法，树突棘：r = 0.90，p&lt;0.002），而在树突中无此相关性（r = 0.21，p = 0.29）（图6F）。

本文阐述了如何通过光遗传学工具的病毒转导与冰冻断裂复型免疫标记技术相结合，对具有已鉴定的突触前和突触后成分的突触处神经递质受体的表达进行定量，并分析其分布模式。

冷冻断裂电子显微镜技术在超微结构研究中已作为一种主要技术超过40年。然而，由于缺乏有效的手段来……

该实验方法结合了光遗传学与冰冻断裂复型免疫标记技术，旨在分析小鼠杏仁核中具有明确突触前和突触后结构的突触处离子型谷氨酸受体的密度。将该冰冻断裂复型免疫标记技术与光遗传学相结合，因其高度可重复性和多功能性，为突触结构与功能特性的关联分析提供了一种极为强大的方法。该实验方法的主要优势在于：能够获得突触前和突触后结构的平面视图，并可对这些特化微区中的蛋白质进行定量分析。不同的技术可适用于多种不同组织，以研究整合膜蛋白的分布与结构。通常，这种结合光遗传学的冷冻蚀刻免疫标记（FRIL）方法对初学者具有挑战性，因其需要使用多种不同的设备和仪器。采用不同方法开始调控至关重要，因为某些后续步骤较难掌握。例如断裂和复制冷冻样本。开始此操作时，将小鼠脑的冠状切块粘附到振动切片机的持刀架上。调整组织块的方向，使新皮层面向振动刀片。接着，在0.1摩尔、冰冻的磷酸缓冲液中，将包含杏仁核的冠状切片切成140微米厚度，并用同一缓冲液收集到六孔板中。在体视显微镜下，将切片置于涂有硅橡胶并盛有0.1 M磷酸缓冲液的培养皿中，裁剪出感兴趣的区域。随后，将裁剪好的组织块转移至冷冻保护液中，在6°C下保存过夜。在此步骤中，通过使用麂皮布擦拭铜载片以去除表面污渍，从而为后续的FRIL实验步骤准备铜载片。在显微镜下，将一圈双面胶带粘附到铜载片上，该胶带将作为容纳裁剪组织块的固定凹槽。然后，用铂金丝环将修整好的样品块放置在双面胶带的孔中。使用滤纸或刷子去除多余的冷冻保护液。随后，用另一个持样载体盖住当前的持样载体。使组织块夹在两个载样器之间。为冷冻样品，将载样器夹心结构插入样品 holder 中。随后，将样品 holder 插入高压冷冻仪中。按下喷射自动按钮启动冷冻循环，立即取出样品台，并将尖端浸入装有液氮的绝缘盒中。然后，小心地从样品台上取下载网夹心结构，放入预冷的冻存管中。将装有载网的冻存管置于液氮罐中保存，直至进行复型操作。在插入电子束枪之前，取下带有偏转板的屏蔽罩。将用于灯丝对中的定心规通过下部阴极盖插入卡盘中。接着，将新灯丝沿定心规滑入，直至压力片夹紧灯丝两端。然后，取下设定规，插入碳棒。通过拧紧蒸发器杆夹头的夹套，固定碳棒，确保碳棒末端的高度位于从底部数第二圈线圈的中部。随后，装回偏转板，并将电子束枪插入冷冻断裂装置中。在此步骤中，调节蒸发所需的电流和电压。接着，将冷冻的载网夹心样品插入液氮中的双复型载台。然后，将双复制载网转移至杜瓦瓶中，并以45度角固定在样品台接收器上。使用载网操作器拾取双复制载网，将其插入冷冻断裂装置的冷台上，等待约20分钟，使双复制载网的温度适应至零下115摄氏度。随后，手动逆时针旋转与双复型台上方遮罩相连的转轮，使遮罩转动，从而驱动双复型台打开，导致组织断裂。对断裂面以90度角喷镀一层碳。随后，从双份复制表中取出复制的样本，并将其转移至盛有TBS的陶瓷12孔板中。使用铂金环丝棒从样本载体上取下复制的组织。进行SDS消化时，将一份复制品转移至含有1毫升SDS消化缓冲液的4毫升玻璃小瓶中。在80摄氏度下振荡消化18小时。进行免疫标记时，用新鲜的SDS消化缓冲液洗涤复制品10分钟。然后在湿润环境中，于15摄氏度下，用含2% BSA-TBS稀释的一抗和二抗孵育24至72小时。随后，将复型样品装载到经 Formvar 包被的 100 格平行栅格上。使用透射电子显微镜在 80 或 100 千伏电压下对复型样品进行成像。然后，通过 CCD 相机采集数字图像。当处于离线状态时，利用不同的解剖标志，在复制品图像上找到对应的区域。腺相关病毒（AAV）注射后四周，在丘脑后核群中表达的通道视紫红质-2（Channelrhodopsin-2）可沿丘脑轴突有效顺行运输，到达杏仁核中间带细胞团。在复制品中，兴奋性谷氨酸能突触的突触后特化结构可识别为质膜E面（E-face）上的一簇膜内颗粒，且通常伴有其突触前成分的P面（P-face）。在此，使用与二抗偶联的不同尺寸的金颗粒对通道视紫红质-2和谷氨酸受体进行可视化。由于缺乏可在同一复制品上检测突触后膜是否属于中间神经元的结构或分子工具，因此对相应的复制品进行了μ型阿片受体标记，后者是这类神经元的标志物。作为在这些突触上对谷氨酸受体密度进行定量分析的一个示例，以下是树突棘和树突上 AMPA 受体的金颗粒数量与突触面积的散点图，结果显示在这两种结构中均存在正相关关系。在进行该实验操作时，必须牢记各个步骤之间具有高度的相互依赖性。因此，任何一个步骤的失误都可能危及整个实验流程。通过在复型的二维表面观察大范围的质膜特化结构，可无需繁琐且耗时的连续超薄切片重建，即可检测目标分子的空间分布与物理连续性。该方法可被其他研究者用于深入探究神经回路中特定突触的结构与功能关系。其中，解析输入信号的来源以及突触后成分的性质至关重要，但却存在困难。

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神经科学

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我们介绍一种用于评估成年小鼠急性脑片中单个皮质-纹状体谷氨酸能突触处谷氨酸释放与清除之间平衡的实验方案。该方案采用谷氨酸荧光探针 iGluu 进行谷氨酸检测，利用 sCMOS...

正常与亨廷顿病小鼠急性脑切片中谷氨酸释放与摄取的单突触指示剂

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。...

光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

在体微型内窥镜钙成像是一种不可或缺的工具，可实现对自由活动动物神经元活动的实时监测。然而，将该技术应用于杏仁核一直存在困难。本方案旨在为在小鼠中成功利用微型显微镜靶向杏仁核细胞提供一项实用的操作指南。...

在自由活动小鼠杏仁核中使用头戴式微型显微镜成功实现活体钙成像

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

学习结合光遗传学与冷冻断裂免疫标记技术，定量分析小鼠杏仁核突触中离子型谷氨酸受体的密度与分布。该方法可实现突触结构与功能的关联分析，揭示神经微环路的分子组织机制。

结合光遗传学与冰冻断裂复制免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布

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