Name: 一种混合的3D组织工程体外 /在硅片肺肿瘤模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 探索一种结合体外实验与计算机模拟的3D肺癌模型，利用胶原蛋白支架研究非小细胞肺癌对靶向治疗的敏感性，并预测新药的疗效。该方法整合生物实验与计算预测，为临床前药物测试提供更接近生理环境的评估平台，有助于优化基于特定突变背景的药物治疗方案。

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本研究由维尔茨堡大学医院跨学科临床研究中心（IZKF，项目编号 BD247）和巴伐利亚适配计划（授予 Heike Walles）资助。

1. 二维（2D）细胞培养
<ol>
	<li>从DSMZ商业获取肿瘤细胞系HCC827。在添加20%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养基中培养肺腺癌细胞系HCC827（EGFR突变型，KRAS野生型）。每2至3天更换一次培养基，每周传代两次。细胞使用至第20代为止。</li>
	<li>从DSMZ商业获取肿瘤细胞系A549。在添加10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养基中培养肺癌细胞系A549（EGFR野生型，KRAS突变型）。培养操作同上。细胞使用至第20代为止。</li>
	<li>定期（每4至6周）检测细胞是否存在支原体等污染。</li>
	<li>在玻璃盖玻片上培养A549或HCC827细胞
	<ol>
		<li>使用镊子将1片无菌玻璃盖玻片放入24孔板的每个孔中。</li>
		<li>分别在含有玻璃盖玻片的孔中接种两种细胞系各50,000个肿瘤细胞，接种体积为500 µl。</li>
		<li>在标准培养条件（37 °C；5% CO2）下培养细胞，直至细胞融合度达到70%。在此期间，每隔2至3天用巴斯德吸管吸除旧培养基，并加入500 µl新鲜培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在生物胶原支架上构建肿瘤测试系统
<ol>
	<li>静态培养条件
	<ol>
		<li>制备脱细胞小肠黏膜下层加黏膜（SISmuc），并如先前文献所述25，将其固定在两个金属环之间，即所谓的细胞环（cell crowns）。</li>
		<li>将100,000个HCC827或A549细胞，以总体积500 µl接种至固定在细胞环中肠组织原腔面一侧。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时，使肿瘤细胞贴壁。在细胞环内加入1 ml培养基，外侧加入1 ml培养基。</li>
		<li>将肿瘤模型置于培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下静态培养14天，每2–3天更换一次培养基。操作时，使用巴斯德吸管吸除原有培养基，向细胞环内加入1 ml含适当浓度FCS的新鲜RPMI培养基（A549：10%，HCC827：20%），外侧加入1.5 ml相同培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动态培养条件
	<ol>
		<li>按照第2.1.1至2.1.3小节所述方法，将脱细胞基质置于细胞环内并进行细胞接种，建立肿瘤测试系统。</li>
		<li>将肿瘤模型在培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下静态培养3天。</li>
		<li>组装已高压灭菌的生物反应器，并如先前发表的方法25将接种了细胞的SISmuc插入其中。</li>
		<li>向培养瓶中加入45 ml含适当浓度FCS的RPMI培养基（A549：10%，HCC827：20%），并将无针取样装置连接至生物反应器与培养基瓶之间的管路系统。</li>
		<li>将生物反应器放入培养箱，连接至泵，以恒定流速（3 ml/min）在37 °C、5% CO2条件下继续培养肿瘤模型14天。</li>
		<li>在培养第7天更换全部培养基。操作时，将生物反应器从培养箱转移至超净工作台，使用巴斯德吸管吸除培养瓶中的培养基。在吸除过程中抬起生物反应器，以排空管路系统中的残留培养基。随后向培养瓶中加入45 ml新鲜培养基，将生物反应器放回培养箱并重新连接至泵。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 吉非替尼对静态肿瘤模型的处理
<ol>
	<li>按照第2.1节所述方法培养肿瘤模型。</li>
	<li>在培养的第11天，配制含1 µM吉非替尼的RPMI/FCS培养基（每 inserts 需2.5 ml）。使用巴斯德吸管吸除孔中旧培养基，向 inserts 内加入1 ml新配制的RPMI/FCS/吉非替尼培养基，inserts 外侧加入1.5 ml相同培养基。 
	注意：解冻后的吉非替尼储备液可在4 °C保存一周。</li>
	<li>在第13天按照3.2小节所述方法更换培养基。</li>
</ol>
4. 使用TGF-beta-1刺激静态肿瘤模型以诱导EMT
<ol>
	<li>按照第2.1节所述方法培养肿瘤模型。</li>
	<li>在培养的第3天，用含载体的RPMI/FCS培养基配制含2 ng/ml TGF-beta-1的溶液（每个细胞环需2.5 ml）。使用巴斯德吸管吸除孔中旧培养基，向细胞环内加入1 ml上述配制的RPMI/FCS/TGF-beta-1培养基，环外加入1.5 ml相同培养基。自第3天起，每2–3天更换一次含TGF-beta-1的培养基，直至第14天，具体操作见4.2节。</li>
</ol>
5. 检测指标
<ol>
	<li>用于ELISA检测的取样方法
	<ol>
		<li>在培养的第11至14天，按照第3节中吉非替尼处理的指示，分别从静态（第2.1节）和动态（第2.2节）培养的上清液中取样 图2此外，在治疗前（T0）采集样本。</li>
		<li>在静态培养条件下，取 100 µl 从细胞冠部内侧取样。在动态培养条件下，将注射器旋接到取样装置上，从生物反应器系统中取出1 ml培养基。将所有收集的上清液储存在-80 °C。80 °C 直到进行ELISA检测为止。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M30-ELISA 法用于细胞凋亡定量
	<ol>
		<li>为了定量上清液中的细胞凋亡，根据制造商说明书进行细胞死亡检测。在进行检测前，确保所有试剂均已升至室温。</li>
		<li>涡旋混匀所有试剂。将洗涤片剂溶解于500 ml新鲜去离子水中。用9.2 ml结合物稀释缓冲液稀释HRP结合物，并混匀。移液 25 µl 每孔加入标准品或样品</li>
		<li>添加 75 µl 每孔加入稀释的HRP缀合物溶液。盖上板子，在室温下于摇床上孵育4小时。手动洗板5次，使用 250 µl 已配制的洗涤液。</li>
		<li>添加 200 µl 向每孔加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物。室温避光孵育20分钟。加入 50 µl 每孔加入终止液。将微孔板振荡10秒，室温静置5分钟后测定吸光度。使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度。采用适合处理ELISA数据的软件（如Origin）计算标准曲线及样品中目标物的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品染色
	<ol>
		<li>3D模型的固定、石蜡包埋与切片制备
		<ol>
			<li>使用每孔细胞插件2.5 ml 4%多聚甲醛（PFA）固定接种的SISmuc，时长2小时，随后将其包埋于石蜡中</li>
			<li>准备 3 µm 用于染色的组织切片，如先前已发表的方法所述 25.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>二维培养条件下细胞的固定
		<ol>
			<li>当细胞在24孔板的玻璃盖玻片上生长至70%汇合度时，用PBS洗涤一次，并用 500 µl 每孔加入4% PFA，孵育10分钟。</li>
			<li>去除PFA，将玻璃盖玻片置于含PBS的孔板中保存 4 °C 直到进行染色为止。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>H&amp;E染色
		<ol>
			<li>根据标准方案，使用苏木精/伊红对复水后的切片进行常规染色以获得总体染色效果。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>三维模型的免疫荧光染色
		<ol>
			<li>进行免疫荧光染色时，将脱蜡并复水的切片放入盛有预热柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）的蒸汽锅中，加热20分钟以进行抗原修复。 
			注意：有关柠檬酸盐缓冲液的制备，请参见材料与设备表。</li>
			<li>将切片转移至洗涤缓冲液（0.5 M PBS 缓冲液 + 0.5% Tween）中，用 PAP 笔圈出组织区域以减少染色液所需用量，并将切片置于湿盒中。</li>
			<li>用5.3.4.6小节中所用二抗宿主物种的5%血清在室温下封闭组织切片20分钟。</li>
			<li>轻轻将载玻片上的封闭血清甩至纸巾上，然后根据生产商说明书，将一抗抗体按相应稀释比例加入画圈区域（兔抗 Ki67 1:100，兔抗 vimentin 1:100，鼠抗 pan-cytokeratin 1:100）。4℃孵育过夜 4 °C进行双重染色时，必须使用来自不同宿主物种的一抗。</li>
			<li>用洗涤缓冲液小心洗去未结合的抗体，每次5分钟，共洗三次。</li>
			<li>为检测特定抗原-抗体结合，将二抗按1:400稀释后加入切片，室温孵育1小时。</li>
			<li>用洗涤缓冲液洗涤三次，每次5分钟，以去除未结合的抗体。</li>
			<li>使用含 DAPI 的水性封片剂封片以复染细胞核，并于室温下避光过夜干燥。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>二维培养细胞的免疫荧光染色
		<ol>
			<li>移除 PBS，加入含 0.2% Triton-X100 的 PBS 溶液覆盖接种有细胞的玻璃盖玻片，孵育 5 分钟以进行透化处理。用洗涤缓冲液（0.5 M PBS 缓冲液 + 0.5% Tween）洗涤玻璃盖玻片 5 分钟。</li>
			<li>执行步骤 5.3.4.3 至 5.3.4.7。所有步骤均在摇床上的孔板中进行，并通过倒置孔板去除试剂。</li>
			<li>封片时，取一滴含DAPI的水性封片剂滴于未处理的载玻片上，用镊子将带有细胞的盖玻片转移至封片剂上，使细胞面朝向封片剂。待其干燥后进行成像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>增殖指数的测定
	<ol>
		<li>根据第5.3.4节或5.3.5节进行Ki67免疫荧光染色。</li>
		<li>使用倒置显微镜对组织切片或二维培养细胞进行荧光成像。针对DAPI染色和Ki67染色分别使用不同的滤光片进行图像采集。定量分析时，每种条件下选取标本非重叠区域的10张三维切片图像或5张二维培养图像（放大倍数20倍）。</li>
		<li>确定二维条件下细胞核数量及Ki67阳性细胞核数量
		<ol>
			<li>使用 Fiji 软件的 Cell Counter 插件手动计数 Ki67 阳性细胞核 26因此，打开图像后，点击“Plugins” → “Analyze” → “Cell Counter”。按下“Initialize”按钮，并选择一种计数器类型。逐一点击每个Ki67阳性细胞核，点击次数将显示在所选计数器类型旁边。</li>
			<li>使用 Fiji 软件创建宏以实现细胞核总数的自动计数 27,28根据每种染色方法和细胞系调整宏。以下为创建宏的示例。
			<ol>
				<li>启动宏记录器。打开一张DAPI图像，通过点击“图像” → “类型” → “8位”将其转换为8位格式。点击“增强对比度”，将“饱和度”设置为“1”，并进行归一化。</li>
				<li>设置“非锐化掩膜”以增强图像清晰度，使用“1”的“半径”和“0.60”的“掩膜强度”。点击“自动阈值”，选择“RenyiEntropy”方法，并设置为“黑背景上的白对象”以对图像进行二值化处理。</li>
				<li>点击“Plugins” → “BioVoxxel” → “watershed irregular features”，设置侵蚀半径为“5”以分离细胞。点击“Analyze” → “Analyze Particles”，并将“size”设置为“0.02-Infinity”。 
				注意：总结表中显示的颗粒/细胞数量以计数值表示。</li>
				<li>单击“Create”以保存宏，用于进一步图像的分析。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据第5.4.3.1小节所述方法，手动确定三维结构中细胞核总数及Ki67阳性细胞核数量。</li>
		<li>根据以下公式计算平均增殖指数（PI）： 
		<img alt="增殖指数公式 Σ（Ki67/DAPI 阳性细胞核数量），数学方程。" src="/files/ftp_upload/53885/53885equation1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式1"> 
		n = 图像数量（3D：10，2D：5）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 计算机模拟 肿瘤模型构建与抗肿瘤治疗模拟EGFR HCC827细胞中的治疗
<ol>
	<li>使用网络分析软件生成网络
	<ol>
		<li>利用不同的已知数据库，基于HCC827细胞系的重要实验读出参数及其突变背景，构建肿瘤网络。</li>
		<li>打开网络分析软件 21 以可视化该网络。
		<ol>
			<li>单击“文件” → “新建” → 输入“JoVE_tumor models” → 单击“确定”以生成新网络。单击“方形近北视图” → “确定”以在双层膜中可视化受体。单击“通用蛋白”以将节点（=蛋白）显示为矩形 → 输入“EGFR” → 单击“确定”；对网络中的每个节点重复此操作。</li>
			<li>标记网络中的节点：右键单击 → “更改颜色” &amp; 形状……” → 选择节点 EGFR 和 (EGF-EGFR)，颜色代码为“255,0,0”（红色）；节点 c-MET 和 (c-MET)，颜色代码为“0,255,0”（绿色）；gefitinib，颜色代码为“255,255,0”（黄色）；PI3K-Inh，颜色代码为“204,204,204”（浅灰色）；MEK-Inh，颜色代码为“102,102,102”（深灰色）；网络中所有其他节点，选择颜色代码“255,255,255”（白色）。</li>
			<li>单击“表型”以六边形形式可视化读出参数 → 输入“proliferation” → 单击“确定” → 右键单击 → “更改颜色” &amp; 形状……” → 选择颜色代码“255,204,204”（鲑鱼色）；对参数凋亡重复此操作 → 选择颜色代码“255,51,204”（紫色）。</li>
			<li>可视化边（= 相互作用）：点击“State Transition”表示激活（箭头），点击“Inhibition”表示抑制（钝头箭头）；对网络中的每个相互作用重复此操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>单击“文件” → “另存为…” → 输入“JoVE_tumor_models.xml” → 单击“保存”，以将生成的信号网络保存为 .xml 格式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算机模拟 使用 SQUAD 进行模拟 
	注意：SQUAD 将网络拓扑表示为离散的逻辑布尔系统（AND、OR、NOT），并进行稳态分析。稳态分析反映了系统的平衡状态及其对信号刺激的响应特性例如药物应用或突变
	<ol>
		<li>开放 SQUAD 17 软件，点击“加载网络” → 上传“JoVE_tumor models.xml”文件。点击“运行分析”： 
		注意：接下来，SQUAD 对布尔网络的连接性应用指数函数进行插值，从而实现对网络行为随时间变化的动态模拟（彩色的S形活性曲线）。</li>
		<li>点击“高级” → “扰动器”以编写模拟方案。模拟抗-EGFR 抗性：点击“编辑实验方案”
		<ol>
			<li>点击“perturbation” → 使用标准“initialstate=SS-4”（稳态4）→ 点击“Add”以添加“new Constant Pulse” → 选择参数“state” → 选择目标“FLIP” → 选择时间“0” → 选择数值“0.4” → 点击“OK”。</li>
			<li>重复以下操作：点击“Add” → 选择参数“state” → 选择目标“c-MET” → 选择时间“0” → 选择数值“0.4” → 点击“OK”；点击“Add” → 选择参数“state” → 选择目标“gefitinib” → 选择时间“0” → 选择数值“1” → 点击“OK”。</li>
			<li>将状态值设置为激活节点（EGF-EGFR）：点击“activenode” → 点击“Edit” → 选择状态“0.8” → 点击“OK”；对于所有其他节点：点击“Edit” → 选择状态“0” → 点击“OK”。点击“OK”以保存协议。</li>
			<li>显示特定曲线：进入“选项”面板 → 选择“(EGF-EGFR)”、“*(EGF-EGFR)”、“*MEK”、“caspases”、“(c-MET)”、“PI3K”、“gefitinib”、“apoptosis”、“proliferation”、“MEK-Inh”和“PI3K-Inh”以进行图形化展示。点击“初始化” → “运行”以启动系统响应的完整模拟。点击“重置”以开始新的模拟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>模拟PI3K和MEK抑制剂联合处理：点击“编辑方案”
		<ol>
			<li>使用与6.2.2.1 - 6.2.2.3中所述相同的节点参数。点击“perturbation” → 点击“Add”添加“new Constant Pulse” → 选择参数“state” → 选择目标“PI3K-Inh” → 选择时间“0” → 选择值“1” → 点击“OK”；点击“Add”添加“new Constant Pulse” → 选择参数“state” → 选择目标“MEK-Inh” → 选择时间“0” → 选择值“1” → 点击“OK”。</li>
			<li>单击“确定”以保存方案。进入“选项”面板：使用与6.2.2.4节所述相同的节点进行图形化表示。单击“初始化”→“运行”，以启动系统响应的完整仿真。单击“重置”以结束仿真。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bhattacharjee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedicine+Pharma+firms+push+for+sharing+of+cancer+trial+data%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data.</a> Science. 338, 29(2012).</li>
<li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).</li>
<li>Arrowsmith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+watch%3A+Phase+II+failures%3A+2008-2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Trial watch: Phase II failures: 2008-2010.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).</li>
<li>Arrowsmith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+watch%3A+phase+III+and+submission+failures%3A+2007-2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 87(2011).</li>
<li>Arrowsmith, J., Miller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+watch%3A+phase+II+and+phase+III+attrition+rates+2011-2012%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 569(2013).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicology+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460, 208-212 (2009).</li>
<li>Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+tumor+Models+as+an+Alternative+for+Animal+Models+in+Preclinical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Ind%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies.</a> Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).</li>
<li>Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+tumor+Models+as+an+Alternative+for+Animal+Models+in+Preclinical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Ind%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies.</a> Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).</li>
<li>Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+create+the+correct+microenvironment%3A+three-dimensional+heterotypic+collagen+assays+for+human+breast+epithelial+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia.</a> Methods. 30, 247-255 (2003).</li>
<li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li>
<li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+a+breakthrough+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo.</a> Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).</li>
<li>Kim, J., Tanner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+the+Tumor+Ecosystem+Along+the+Metastatic+Cascade+Using+3D+Culture+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models.</a> Front Oncol. 5, 170(2015).</li>
<li>Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+Hydrogels+-+Versatile+Matrices+for+3D+Cell+Culture+in+Cancer+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine.</a> Front Oncol. 5, 92(2015).</li>
<li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+3D+culture+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Sci Transl Med. 7, 283ps9(2015).</li>
<li>Stadler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+complexity+in+carcinomas%3A+Analyzing+and+modeling+the+interaction+of+human+cancer+cells+with+their+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment.</a> Semin Cancer Biol. , (2015).</li>
<li>Stratmann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+human+3D+lung+cancer+model+based+on+a+biological+tissue+matrix+combined+with+a+Boolean+in+silico+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model.</a> Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).</li>
<li>Mok, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gefitinib+or+carboplatin-paclitaxel+in+pulmonary+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma.</a> N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).</li>
<li>Maemondo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gefitinib+or+chemotherapy+for+non-small-cell+lung+cancer+with+mutated+EGFR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR.</a> N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).</li>
<li>Rosell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+versus+standard+chemotherapy+as+first-line+treatment+for+European+patients+with+advanced+EGFR+mutation-positive+non-small-cell+lung+cancer+%28EURTAC%29%3A+a+multicentre%2C+open-label%2C+randomised+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial.</a> Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).</li>
<li>Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+III+study+of+afatinib+or+cisplatin+plus+pemetrexed+in+patients+with+metastatic+lung+adenocarcinoma+with+EGFR+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations.</a> J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).</li>
<li>Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition%3A+new+insights+in+signaling%2C+development%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease.</a> J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).</li>
<li>Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+as+an+indicator+of+mesenchymal+to+epithelial+reverting+transitions+during+the+metastatic+seeding+of+disseminated+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).</li>
<li>Janne, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZD9291+in+EGFR+inhibitor-resistant+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer.</a> N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).</li>
<li>Moll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+a+human+3D+in+vitro+tumor+test+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Funahashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellDesigner+3.5%3A+A+Versatile+Modeling+Tool+for+Biochemical+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%22%5BJournal%5D)">CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks.</a> Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Auto+Threshold%28ImageJ%29v.v1.15%22">Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15</a>. , Source: 
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/Auto_Threshold">http://fiji.sc/Auto_Threshold</a> (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BioVoxxel+Toolbox+%28ImageJ+%2F+Fiji%29%22">BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)</a>. , Source: 
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox">http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox</a> (2015).</li>
<li>Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+lung+cancer+genomics%3A+the+emerging+concept+of+individualized+diagnostics+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment.</a> J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).</li>
<li>Engelman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET+amplification+leads+to+gefitinib+resistance+in+lung+cancer+by+activating+ERBB3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling.</a> Science. 316, 1039-1043 (2007).</li>
<li>Mukohara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+gefitinib+and+cetuximab+on+non-small-cell+lung+cancers+bearing+epidermal+growth+factor+receptor+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations.</a> J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).</li>
<li>Noro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gefitinib+%28IRESSA%29+sensitive+lung+cancer+cell+lines+show+phosphorylation+of+Akt+without+ligand+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation.</a> BMC Cancer. 6, 277(2006).</li>
<li>Gill, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+matrix+with+independently+tunable+biochemistry+and+mechanical+properties+to+study+epithelial+morphogenesis+and+EMT+in+a+lung+adenocarcinoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model.</a> Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们已建立了一种联合方法 体外/计算机模拟 用于生物标志物指导治疗预测的肿瘤检测系统。 体外 模型可评估化合物作用的多个重要方面，例如在特定突变背景下肿瘤细胞增殖与凋亡的变化，该背景亦可进行模拟 计算机模拟17在此，我们介绍了用于生成三维肿瘤模型及进行化合物测试的标准化方案，包括细胞增殖与凋亡的定量分析，以及建立预测模型的方法 计算机模拟 模型。该三维肿瘤模型基于携带特定突变的肿瘤细胞系。细胞在去细胞化组织基质上的细胞环中培养。基质的去细胞化处理、在两个金属环（细胞环）之间固定、生物反应器系统的组装以及支架的接种等步骤此前已在JoVE中可视化展示。 25.
体外 3D 肿瘤模型 
将本研究获得的结果转化至临床应用，需要谨慎选择携带特定突变的合适肿瘤细胞，以便根据生物标志物对患者进行分类，从而匹配相应的靶向药物。在分层医学中，通过下一代测序技术鉴定可靶向的驱动突变尤为重要，尤...

制药行业在癌症治疗领域的临床阶段面临高达95%的高淘汰率，导致巨额成本 1-5造成这一不足的原因之一在于，目前潜在新化合物的药效评估主要依赖于对癌细胞系的二维细胞培养进行大规模筛选，或依赖于动物模型。动物模型虽具有更高的复杂性，但小鼠与人类之间存在关键差异。 6,7在过去的十年中，已采用不同方法构建了三维癌症模型，以弥合癌细胞系的二维培养与复杂肿瘤环境之间的差距 体内 肿瘤 6,8,9三维环境对细胞分化及信号传导的影响已在多年前的多项研究中得到证实（例如，由 Mina Bissell 提出） 10,11目前，已有多种3D细胞培养模型可供使用，例如球状体培养、水凝胶或微流控芯片。 12-16尽管这些模型相较于传统的二维培养系统提高了复杂性，但大多缺乏已知具有促肿瘤作用并影响药物疗效的组织微环境。
为了解决这一问题，我们基于一种名为SISmuc的生物支架构建了三维肿瘤模型（小肠黏膜下层＋黏膜源自脱细胞猪空肠的组织支架，从而保留了细胞外基质的组织结构及重要组分，如多种胶原蛋白以及基底膜结构 17这一独特特性对于源自上皮组织并占实体瘤约80%的癌瘤模型构建至关重要。此外，与二维培养中人为偏高的增殖速率相比，我们所构建的组织工程肿瘤模型中的增殖速率有所降低。由于增殖是评估药物疗效的重要参数，本模型可实现更接近生理条件的药物测试 体内 肿瘤 17.
为了评估我们的模型正确预测生物标志物依赖性药物疗效的潜力，本文提供了两种不同肺癌细胞系的数据，这两种细胞系的EGFR生物标志物状态不同。这种突变状态目前已开始在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中常规检测。针对携带激活型EGFR突变的肿瘤，使用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）如EGFR抑制剂吉非替尼进行靶向治疗，其疗效优于基于铂类的化疗18-21。
我们建立了多种与评估化合物功效相关的检测技术。此外，在TGF-beta-1刺激后，我们能够研究化合物对已启动上皮-间质转化（EMT）过程的肿瘤细胞的作用，该过程被认为是恶性转化的重要步骤22,23，并与药物耐药性相关24。
三维肿瘤模型能够以良好的对比度监测细胞对靶向治疗、化疗或药物组合的特异性反应。为进一步增强并加快药物筛选进程，同时应对耐药性问题，该模型结合了in silico（计算机模拟）分析。基于少量实验数据，可利用in silico方法预测肿瘤对一系列药物及其组合治疗方案的反应结果。

<table><tbody><tr><td>生物反应器</td><td>组织工程与再生医学讲席教授，W&amp;uuml;德国罗兹堡</td><td></td><td>生物反应器设置</td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox（ImageJ / Fiji）</td><td>Jan Brocher，Thorsten Wagner，https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞冠</td><td>组织工程与再生医学讲席教授，W&amp;uuml;吕贝克（德国）</td><td></td><td>用于静态三维培养</td></tr><tr><td>CellDesigner</td><td>http://www.celldesigner.org/</td><td>-</td><td>该软件用于绘制网络图。</td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液储备液（10倍浓缩）</td><td>内部生产</td><td></td><td>42 g/L 柠檬酸一水合物，17.6 g/L 氢氧化钠颗粒溶于去离子水，pH 6.0，室温保存。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液工作液</td><td>内部生产</td><td></td><td>10% 枸橼酸盐缓冲液储备液，溶于去离子水中，室温保存。</td></tr><tr><td>柠檬酸一水合物</td><td>VWR，达姆施塔特（德国）</td><td>1002441000</td><td>用于柠檬酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>德国达姆施塔特 VWR</td><td>631-1339</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>SouthernBiotech，伯明翰（美国）</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>KEGG、HPRD 和 QIAGEN（基因 &amp;与通路）</td><td>http://www.genome.jp/kegg/pathway.html；http://www.hprd.org/；https://www.qiagen.com/de/geneglobe/</td><td>-</td><td>采用了多种已知的文献数据库来构建网络拓扑结构。</td></tr><tr><td>女性鲁尔卡箍式三通接头</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster（GER）</td><td>FTLT-1</td><td>生物反应器设置</td></tr><tr><td>带5/16内螺纹的雌性鲁尔接头样式&quot; 六角转1/4-28 UNF螺纹</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>SFTLL-J1A&amp;nbsp;</td><td>生物反应器设置</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>生物&amp;amp;SELL，Feucht（德国）</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>未热灭活</td></tr><tr><td>吉非替尼</td><td>Absource Diagnostics GmbH, M&amp;uuml;nchen (GER)</td><td>S1025-100 mg</td><td>100 mM 储存液（溶于DMSO）</td></tr><tr><td>玻璃烧瓶（Schott，GER），配有玻璃软管接头</td><td>韦克特，基钦根（德国）</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4%（多聚甲醛）</td><td>卡尔·罗特，卡尔斯鲁厄（德国）</td><td>P087.1</td><td></td></tr><tr><td>软管接头</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>CC-9</td><td>生物反应器设置</td></tr><tr><td>生物反应器培养箱</td><td>组织工程与再生医学讲席教授，W&amp;uuml;德国罗兹堡</td><td></td><td>生物反应器设置</td></tr><tr><td>M30 CytoDeath&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 酶联免疫吸附测定</td><td>Peviva，布罗马（瑞典）</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>雄性鲁尔一体式锁环</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>MTLL230-J1A</td><td>生物反应器设置</td></tr><tr><td>保湿室</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗广谱角蛋白</td><td>Sigma-Aldrich，慕尼黑（德国）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>C2562-2ML</td><td>克隆 C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2，免疫荧光使用比例为1/100</td></tr><tr><td>无针可擦拭阀式鲁尔接头（雌性）</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>NVFMLLPC</td><td>生物反应器设置，用于取样，γ射线灭菌</td></tr><tr><td>O型圈 MVQ 10 红色 37 × 3 mm</td><td>Arcus 密封元件，Seevetal（德国）</td><td>21444</td><td>大号O形圈，生物反应器装置</td></tr><tr><td>O型圈 MVQ 70 红色 27 × 2.5 mm</td><td>Arcus 密封元件，Seevetal（德国）</td><td>19170</td><td>小O形圈，生物反应器装置</td></tr><tr><td>PAP笔</td><td>Dako，汉堡（德国）</td><td>S002</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>卡尔·罗特，卡尔斯鲁厄（德国）</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Ismatec，Wertheim-Mondfeld（德国）</td><td></td><td>生物反应器设置</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich，慕尼黑（德国）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>D8537-6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>泵管盒</td><td>Ismatec，韦尔泰姆（德国）</td><td>IS 3710</td><td>生物反应器设置</td></tr><tr><td>兔抗 Ki67</td><td>Abcam，剑桥（英国）</td><td>ab16667</td><td>克隆 SP6，用于免疫荧光实验，稀释比例为 1/100</td></tr><tr><td>兔抗波形蛋白</td><td>Abcam，剑桥（英国）</td><td>ab92547</td><td>用于免疫荧光，稀释比例为1:100</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>生命技术公司，达姆施塔特（德国）</td><td>61870-044</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前将水浴锅预热至 C</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>卡尔·罗斯特有限责任公司，卡尔斯鲁厄（德国）</td><td>HC66.1</td><td>生物反应器设置</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich, M&amp;uuml;nchen (GER)</td><td>30620-1KG-R</td><td>用于柠檬酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>SQUAD</td><td>http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm</td><td>-</td><td>该软件用于进行半定量模拟。</td></tr><tr><td>无菌空气滤器，孔径 0.2 &amp;micro;m</td><td>赛多利斯斯泰迪姆生物技术公司，G&amp;ouml;德国蒂宾根</td><td>16596-HYK</td><td>生物反应器设置</td></tr><tr><td>5 ml 注射器鲁尔锁扣</td><td>BD 生物科学，海德堡（德国）</td><td>309649</td><td>用于生物反应器取样</td></tr><tr><td>组织培养试验板：6-，&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 12孔、24孔、96孔</td><td>TPP Techno Plastic Products AG，特拉萨丁根（德国）</td><td>92006, 92012, 92024, 92048&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>转化生长因子-β1（TGF-&amp;beta;1）含载体</td><td>细胞信号传导，德国法兰克福</td><td>8915LC</td><td>无菌柠檬酸盐缓冲液（pH 3.0）中的储备液</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, M&amp;uuml;nchen（GER）</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich, M&amp;uuml;nchen（GER）</td><td>P7949-500ml</td><td>免疫荧光染色洗涤缓冲液</td></tr></tbody></table>

一种联合三维组织工程 体外/计算机模拟 用于预测特定突变背景下药物有效性的肺癌模型

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

在本研究中，我们结合了一种 体外 带有3D肺肿瘤模型的 计算机模拟 基于特定突变背景优化药物反应预测的模型。该模型构建于脱细胞猪源支架上，可再现细胞外基质组成及结构（包括基底膜）等组织特异性特征。我们建立了一项标准化方案，可在14天内完成人工肿瘤组织的构建，并包含3天的药物处理。本文提供了多种三维读出筛选技术的详细描述，如通过Ki67染色测定增殖指数、利用M30-ELISA法检测上清液中的凋亡指标，以及对 上皮-间质转化 （EMT），这些是评估治疗性化合物有效性的有用工具。与2D培养相比，我们能够在3D肿瘤模型中观察到增殖减少，这与临床情况相关。尽管增殖水平较低，该模型仍能预测 EGFR根据生物标志物状态准确预测靶向药物反应，如肺腺癌细胞系HCC827的比较所示（EGFR -突变的， KRAS 野生型）和 A549（EGFR 野生型 KRAS-突变体）经处理后 酪氨酸激酶抑制剂 （酪氨酸激酶抑制剂）吉非替尼。为研究更晚期肿瘤细胞的药物反应，我们通过长期使用TGF-beta-1处理诱导上皮-间质转化（EMT），并利用波形蛋白/广谱细胞角蛋白免疫荧光染色进行评估。采用流动生物反应器使培养条件接近生理状态，从而改善了组织生成。此外，我们展示了在吉非替尼处理或TGF-beta-1刺激下，将细胞凋亡、增殖指数及EMT等药物反应整合至布尔 in silico 模型。此外，我们阐述了如何预测具有特定突变背景的肿瘤细胞对药物的反应，以及针对耐药性的应对策略。我们相信，这种3D 体外 方法尤其适用于其 计算机模拟 扩增技术为临床前药物测试提供了额外价值，其测试条件比二维细胞培养更接近真实情况。

基于 SISmuc 支架（图2A至图2C），我们建立了一套标准化操作流程，用于构建、刺激及处理三维肿瘤检测系统（图 2D）。该模型可利用M30-ELISA测定增殖指数并定量凋亡，如图所示。 图1 和 图3分别。 图3 显示具有代表性的 H&amp;A549 和 HCC827 模型的 E 染色以及使用吉非替尼的一项代表性凋亡检测。此处展示的模型是以上述示例为基础设计的 EGFR-突变的非小细胞肺癌（NSCLC），该类型在临床上可通过靶向抑制剂成功治疗。相应地，仅 EGFR-mutated HCC827 细胞对治疗有反应，而 A549 细胞无反应 EGFR 通过检测凋亡增加评估我们的模型中TKI吉非替尼的抑制作用。 图4 显示了我们的模型在经EMT诱导剂TGF-beta-1刺激后的一个代表性染色结果。在流动生物反应器中的动...

我们提出一种基于生物胶原支架的三维（3D）肺癌模型，用于研究非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗的敏感性。我们展示了多种检测技术，以确定细胞增殖指数、凋亡以及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）状态。所获得的数据被整合到一个in silico模型中，用于预测药物敏感性。

在本研究中，我们将一种体外三维肺癌肿瘤模型与一种计算机模拟模型相结合，以基于特定...优化对药物反应的预测

该体外/计算机模拟肺癌模型的总体目标是研究非小细胞肺癌靶向治疗药物的敏感性，并预测新物质的疗效。这种三维模型系统可监测细胞对靶向治疗或直接联合治疗的特异性反应。该技术的主要优势在于，结合计算机模拟预测，可在更接近生理条件的环境中促进临床前药物测试。该技术的应用前景涉及多种肿瘤实体的治疗，因为它可用于基于特定的突变背景优化药物反应预测。本次实验操作将由本实验室的研究助理 Franziska Schmitt 演示。要建立动态培养体系，首先在常规培养箱中，于37摄氏度及5%CO2条件下，在细胞培养杯中对肿瘤模型进行静态培养。三天后，组装一个已灭菌的生物反应器，并将接种了细胞的生物小肠黏膜下层加黏膜支架插入系统中。接着，向一个培养瓶中加入45毫升RPMI培养基，该培养基需添加适量的胎牛血清（FCS），并将无针采样装置连接到生物反应器与培养基瓶之间的管路系统上。将生物反应器放入培养箱中，并连接至泵，以每分钟3毫升的恒定培养基流速继续培养肿瘤模型14天。在传统培养箱中培养至第11天时，使用吉非替尼处理静态肿瘤模型。首先用巴斯德吸管从孔中移除旧培养基，然后向每个细胞培养罩内加入1毫升新鲜配制的、添加了FCS和吉非替尼的RPMI培养基，同时向每个孔底部加入1.5毫升培养基。为从动态培养体系中收集ELISA样本，在培养第11至14天期间，将注射器连接至取样装置，并从生物反应器系统中取出1毫升培养基。然后将样品在 -80 °C 下保存，直至进行 ELISA 检测。为确定 Ki67 阳性细胞核的数量，首先使用倒置显微镜在每种条件下对样品的非重叠区域以 20 倍放大倍数获取五张 DAPI 和五张 Ki67 染色的荧光图像。为手动计数 Ki67 阳性细胞核，请在 Fiji 中打开显微图像，选择“插件”（Plugins），然后选择“细胞计数器”（Cell Counter），点击“初始化”（initialize），选择一种计数器类型，随后点击每一个 Ki67 阳性细胞核进行计数。已点击的细胞数量将显示在所选计数器类型的旁边。要对2D图像中细胞核的总数进行自动计数，请启动宏记录器，打开一幅DAPI图像，然后点击图像、类型和8位，接着点击增强对比度，将饱和参数设为1并进行归一化。为使图像更清晰，使用半径为1、掩模值为60的非锐化掩模进行设置。要对图像进行二值化处理，请点击“自动阈值”，选择“Reny/Entropy”方法，并设置为黑背景上的白色对象。然后，依次点击“插件”、“BioVoxxel”和“分割不规则特征”，设置侵蚀半径为5以分离细胞。点击“分析”，选择“分析颗粒”，将大小设置为02至无穷，并勾选“汇总”选项。细胞数量将在摘要表中以计数值显示。然后，单击“创建”以保存宏，以便在后续的二维细胞培养图像中自动计数细胞核。在利用已知数据库生成肿瘤网络后，打开相应的网络分析软件，单击“文件”和“新建”，并输入 jove 肿瘤模型。单击“ok”以生成新网络，然后单击“square closeup North”和“ok”，以在双层膜中可视化受体。要将节点显示为矩形，请单击“generic protein”，然后选择“EGFR”，再单击“Ok”。要为网络中的节点添加标签，可右键单击以更改颜色和形状，并按照指示设置节点颜色编码。要将读出参数显示为六边形，请选择“phenotype”，输入“proliferation”，然后单击“ok”。然后，右键单击并再次选择更改颜色和形状，将颜色代码设置为 255, 204, 204。为了可视化节点相互作用的边，点击“状态转换”以显示激活箭头，点击“抑制”以显示钝化抑制箭头。接着，点击文件，选择“另存为”，并将生成的信号网络保存为 jove tumor models.xml。为了对系统平衡进行稳态分析，打开 SQUAD 软件，点击加载网络，上传 jove 肿瘤模型.xml 文件。点击，运行分析。要编写模拟协议，请点击“高级”和“perturbator”，然后点击“编辑协议”，以模拟抗EGFR耐药性。接下来，点击“perturbation”并选择初始状态等于稳态4。点击“添加”，以加入新的恒定脉冲，然后选择状态参数，将目标设为FLIP，时间设为0，数值设为4。以相同方式点击“确定”并设置c-MET和吉非替尼的状态。要为活化的EGFR节点设置状态值，请点击“活化节点”，然后点击“编辑”，将状态值设为8，再点击“确定”。单击“确定”以保存该实验方案。为显示特定曲线，在“选项”面板中选择 EGF-EGFR、star EGF-EGFR、star Mek、caspases、PI3K、Gefitinib、apoptosis、proliferation、MEk inhibitor 和 PI3K inhibitor。然后，单击“初始化并运行”，以启动系统响应的完整模拟。为了模拟PI3K和Mek抑制剂的联合处理，点击编辑方案。接着，使用刚刚演示过的相同节点参数，点击扰动，然后点击添加，以增加一个新的恒定脉冲。随后，选择一个状态参数，将目标设置为PI3K抑制剂，时间设置为零，值设置为一，然后点击确定。再次点击“添加”，以增加另一个新的恒定脉冲，在状态参数下，将目标设置为 Mek 抑制剂，时间设置为零，值设置为一，然后点击“确定”，再次点击“确定”以保存该方案。在选项面板中，使用与刚才演示相同的节点进行图形化表示，点击“初始化”，然后点击“运行”以开始对系统响应的完整模拟。随后，为完成模拟，点击“重置”。该3D肿瘤检测系统有助于测定增殖指数，并利用M30 Elisa定量检测细胞凋亡。在此代表性实验中，例如，仅在静态培养条件下孵育的EGFR突变型HCC827肿瘤细胞对表皮生长因子抑制产生响应。通过酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的作用，HCC827肿瘤模型系统中观察到的细胞凋亡增加即证明了这一点。此处展示了存在或不存在上皮-间质转化诱导剂TGF-beta-1刺激条件下，静态3D肿瘤模型的代表性图像。请注意，在经处理的肿瘤细胞培养物中，波形蛋白（vimentin）的表达增加。在动态条件下，吉非替尼对携带 EGFR 突变的 HCC827 细胞具有显著作用，表现为与未处理的对照培养相比，在酪氨酸激酶抑制剂存在下，类组织结构减少。该图显示了随着时间推移，HCC827 细胞中已知驱动突变 EGFR 与 c-MET 共激活、增殖速率增加以及凋亡速率降低的模拟结果，反映了与 MEK 和 PI3K 激活相关的吉非替尼诱导耐药性。事实上，联合使用 PI3K 和 MEK 抑制剂的建模结果显示，可逆转抗 EGFR 耐药效应，降低增殖并诱导细胞凋亡。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如蛋白质印迹法）来研究下游信号通路。此外，还可使用包含不同类型细胞的共培养系统，以分析肿瘤微环境中不同细胞之间的相互作用。该技术为药物研发领域的研究人员探索药物在计算机模拟中的有效性提供了新的途径。观看本视频后，您应能充分理解如何通过模拟不同突变背景下的信号变化并分析其系统响应，来预测分层患者群体中的药物疗效。

a-combined-3d-tissue-engineered-vitroin-silico-lung-tumor-model-for

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

一种混合的3D组织工程<em&gt;体外</em&gt; /<em&gt;在硅片</em在具体的突变背景预测药物的有效性&gt;肺肿瘤模型

本文描述了用于构建人类三维肿瘤组织作为测试系统的方法。这些技术基于脱细胞生物血管化支架（BioVaSc）、原代人类细胞和肿瘤细胞系，可在静态条件下以及流动生物反应器的动态条件下进行培养。...

人类三维组织工程 体外 肿瘤检测系统

我们描述了一种通过预先对气道造成损伤以显著增强肺癌细胞在小鼠肺部原位移植效率的方法。该方法还可用于研究肺部微环境中的基质相互作用、肿瘤转移扩散、肺癌共病情况，以及更高效地建立患者来源的异种移植模型。...

用博来霉素对小鼠气道进行预处理可提高原位肺癌细胞移植效率

本文介绍了一种模拟肿瘤进展过程的ex...

用于研究肿瘤转移的无细胞与细胞肺模型

本文介绍了一种基于肿瘤基因组特征选择靶向治疗方案并评估其疗效的实验流程。该方案描述了结构型DNA重排的鉴定与验证、将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，以及对相应药物治疗反应的检测方法。...

利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代，癌症生物学需要新型的体外和计算工具，以在适当的时空背景下研究肿瘤-免疫界面。本文介绍了在二维和三维条件下利用肿瘤-免疫微流控共培养的实验方案，可兼容对细胞功能进行动态、多参数的监测。...

用于解析体外肿瘤微环境中免疫应答的微流控共培养模型

本文介绍了一种用于生成、药物处理及分析患者来源的离体组织的方法，以在活体、与患者相关且具有临床前意义的模型系统中评估肿瘤对药物的反应。...

源自患者的肿瘤外植体作为预测患者药物耐药性的“活体”临床前平台

该实验利用小鼠胚胎干细胞分化形成的类胚体，将其培养在三维胶原凝胶中，以在体外分析调控出芽型血管生成的生物学过程。in...

体外 利用小鼠胚胎干细胞进行血管生成的三维出芽实验，用于血管疾病建模与药物筛选

本方案描述了在非小细胞肺癌患者来源类器官模型中，对靶向信号通路抑制剂的药物敏感性进行标准化评估的方法。...

表征EGFR突变型非小细胞肺癌患者来源类器官对靶向治疗的敏感性

本方案提供了生成三维工程化心肌和骨骼肌组织的方法，并描述了其在临床前药物筛选中的应用。所述方法利用磁感应系统，可同时平行评估24个组织。...

可扩展的三维工程化肌肉组织中的临床前药物测试

本文展示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。同时介绍了一种利用自动化成像系统对球体进行观察及基于图像的深度学习分析的策略。...

用于药物评价研究的三维肿瘤球体的生成

本研究介绍了一种基于荧光标记A549-iRFP细胞多细胞球体肺内接种的原位非小细胞肺癌（NSCLC）模型。该模型可重现临床NSCLC分期，并对顺铂具有响应性，依据动态监测结果 体内 长波长荧光的监测...

构建模拟疾病进展并预测药物活性的非小细胞肺癌原位异种移植模型

探索一种结合体外实验与计算机模拟的3D肺癌模型，利用胶原蛋白支架研究非小细胞肺癌对靶向治疗的敏感性，并预测新药的疗效。该方法整合生物实验与计算预测，为临床前药物测试提供更接近生理环境的评估平台，有助于优化基于特定突变背景的药物治疗方案。

一种联合三维组织工程体外/计算机模拟用于预测特定突变背景下药物有效性的肺癌模型

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一种联合三维组织工程 体外/计算机模拟 用于预测特定突变背景下药物有效性的肺癌模型

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