一种联合三维组织工程 体外/计算机模拟 用于预测特定突变背景下药物有效性的肺癌模型

该体外/计算机模拟肺癌模型的总体目标是研究非小细胞肺癌靶向治疗药物的敏感性，并预测新物质的疗效。这种三维模型系统可监测细胞对靶向治疗或直接联合治疗的特异性反应。该技术的主要优势在于，结合计算机模拟预测，可在更接近生理条件的环境中促进临床前药物测试。

该技术的应用前景涉及多种肿瘤实体的治疗，因为它可用于基于特定的突变背景优化药物反应预测。本次实验操作将由本实验室的研究助理 Franziska Schmitt 演示。要建立动态培养体系，首先在常规培养箱中，于37摄氏度及5%CO2条件下，在细胞培养杯中对肿瘤模型进行静态培养。

三天后，组装一个已灭菌的生物反应器，并将接种了细胞的生物小肠黏膜下层加黏膜支架插入系统中。接着，向一个培养瓶中加入45毫升RPMI培养基，该培养基需添加适量的胎牛血清（FCS），并将无针采样装置连接到生物反应器与培养基瓶之间的管路系统上。将生物反应器放入培养箱中，并连接至泵，以每分钟3毫升的恒定培养基流速继续培养肿瘤模型14天。

在传统培养箱中培养至第11天时，使用吉非替尼处理静态肿瘤模型。首先用巴斯德吸管从孔中移除旧培养基，然后向每个细胞培养罩内加入1毫升新鲜配制的、添加了FCS和吉非替尼的RPMI培养基，同时向每个孔底部加入1.5毫升培养基。为从动态培养体系中收集ELISA样本，在培养第11至14天期间，将注射器连接至取样装置，并从生物反应器系统中取出1毫升培养基。

然后将样品在 -80 °C 下保存，直至进行 ELISA 检测。为确定 Ki67 阳性细胞核的数量，首先使用倒置显微镜在每种条件下对样品的非重叠区域以 20 倍放大倍数获取五张 DAPI 和五张 Ki67 染色的荧光图像。为手动计数 Ki67 阳性细胞核，请在 Fiji 中打开显微图像，选择“插件”（Plugins），然后选择“细胞计数器”（Cell Counter），点击“初始化”（initialize），选择一种计数器类型，随后点击每一个 Ki67 阳性细胞核进行计数。

已点击的细胞数量将显示在所选计数器类型的旁边。要对2D图像中细胞核的总数进行自动计数，请启动宏记录器，打开一幅DAPI图像，然后点击图像、类型和8位，接着点击增强对比度，将饱和参数设为1并进行归一化。为使图像更清晰，使用半径为1、掩模值为60的非锐化掩模进行设置。

要对图像进行二值化处理，请点击“自动阈值”，选择“Reny/Entropy”方法，并设置为黑背景上的白色对象。然后，依次点击“插件”、“BioVoxxel”和“分割不规则特征”，设置侵蚀半径为5以分离细胞。点击“分析”，选择“分析颗粒”，将大小设置为02至无穷，并勾选“汇总”选项。

细胞数量将在摘要表中以计数值显示。然后，单击“创建”以保存宏，以便在后续的二维细胞培养图像中自动计数细胞核。在利用已知数据库生成肿瘤网络后，打开相应的网络分析软件，单击“文件”和“新建”，并输入 jove 肿瘤模型。

单击“ok”以生成新网络，然后单击“square closeup North”和“ok”，以在双层膜中可视化受体。要将节点显示为矩形，请单击“generic protein”，然后选择“EGFR”，再单击“Ok”。要为网络中的节点添加标签，可右键单击以更改颜色和形状，并按照指示设置节点颜色编码。要将读出参数显示为六边形，请选择“phenotype”，输入“proliferation”，然后单击“ok”。

然后，右键单击并再次选择更改颜色和形状，将颜色代码设置为 255, 204, 204。为了可视化节点相互作用的边，点击“状态转换”以显示激活箭头，点击“抑制”以显示钝化抑制箭头。接着，点击文件，选择“另存为”，并将生成的信号网络保存为 jove tumor models.xml。

为了对系统平衡进行稳态分析，打开 SQUAD 软件，点击加载网络，上传 jove 肿瘤模型.xml 文件。点击，运行分析。

要编写模拟协议，请点击“高级”和“perturbator”，然后点击“编辑协议”，以模拟抗EGFR耐药性。接下来，点击“perturbation”并选择初始状态等于稳态4。点击“添加”，以加入新的恒定脉冲，然后选择状态参数，将目标设为FLIP，时间设为0，数值设为4。

以相同方式点击“确定”并设置c-MET和吉非替尼的状态。要为活化的EGFR节点设置状态值，请点击“活化节点”，然后点击“编辑”，将状态值设为8，再点击“确定”。

单击“确定”以保存该实验方案。为显示特定曲线，在“选项”面板中选择 EGF-EGFR、star EGF-EGFR、star Mek、caspases、PI3K、Gefitinib、apoptosis、proliferation、MEk inhibitor 和 PI3K inhibitor。然后，单击“初始化并运行”，以启动系统响应的完整模拟。

为了模拟PI3K和Mek抑制剂的联合处理，点击编辑方案。接着，使用刚刚演示过的相同节点参数，点击扰动，然后点击添加，以增加一个新的恒定脉冲。随后，选择一个状态参数，将目标设置为PI3K抑制剂，时间设置为零，值设置为一，然后点击确定。

再次点击“添加”，以增加另一个新的恒定脉冲，在状态参数下，将目标设置为 Mek 抑制剂，时间设置为零，值设置为一，然后点击“确定”，再次点击“确定”以保存该方案。在选项面板中，使用与刚才演示相同的节点进行图形化表示，点击“初始化”，然后点击“运行”以开始对系统响应的完整模拟。随后，为完成模拟，点击“重置”。

该3D肿瘤检测系统有助于测定增殖指数，并利用M30 Elisa定量检测细胞凋亡。在此代表性实验中，例如，仅在静态培养条件下孵育的EGFR突变型HCC827肿瘤细胞对表皮生长因子抑制产生响应。

通过酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的作用，HCC827肿瘤模型系统中观察到的细胞凋亡增加即证明了这一点。此处展示了存在或不存在上皮-间质转化诱导剂TGF-beta-1刺激条件下，静态3D肿瘤模型的代表性图像。请注意，在经处理的肿瘤细胞培养物中，波形蛋白（vimentin）的表达增加。

在动态条件下，吉非替尼对携带 EGFR 突变的 HCC827 细胞具有显著作用，表现为与未处理的对照培养相比，在酪氨酸激酶抑制剂存在下，类组织结构减少。该图显示了随着时间推移，HCC827 细胞中已知驱动突变 EGFR 与 c-MET 共激活、增殖速率增加以及凋亡速率降低的模拟结果，反映了与 MEK 和 PI3K 激活相关的吉非替尼诱导耐药性。事实上，联合使用 PI3K 和 MEK 抑制剂的建模结果显示，可逆转抗 EGFR 耐药效应，降低增殖并诱导细胞凋亡。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如蛋白质印迹法）来研究下游信号通路。此外，还可使用包含不同类型细胞的共培养系统，以分析肿瘤微环境中不同细胞之间的相互作用。该技术为药物研发领域的研究人员探索药物在计算机模拟中的有效性提供了新的途径。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过模拟不同突变背景下的信号变化并分析其系统响应，来预测分层患者群体中的药物疗效。