Name: 外来体miRNA的分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者的血浆通过定量PCR:一种可行的液体活检工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习通过双重酶处理从非小细胞肺癌患者血浆中分离外泌体并去除非外泌体miRNA污染的方法。该技术可提高外泌体miRNA分析的准确性，为液体活检生物标志物研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究还获得了安特卫普多学科肿瘤中心（MOCA）2014年资助项目的资助。

1. 外泌体分离
注意：根据制造商提供的方案，并结合RNA酶处理步骤，使用商业试剂盒从血浆样本中分离外泌体（所有这些步骤都必须在佩戴个人和环境防护设备的情况下进行，并遵循操作生物样本的特定法律程序）。
<ol>
	<li>取每份储存于 -80 °C 的 1 ml 血浆样品，置于冰上。</li>
	<li>在室温下以 2,000 × g 离心 20 分钟&#160;；此步骤为必需操作，旨在去除细胞和碎片。</li>
	<li>将含有洁净血浆的上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中。</li>
	<li>将新管在室温下以 10,000 × g 离心 20 分钟&#160;。</li>
	<li>将含有洁净血浆的上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中。</li>
	<li>向上清液中加入 100 ng/ml 的 RNAse，并在 37 °C 孵育 10 分钟&#160;，以降解循环游离的 RNA。</li>
	<li>将所有处理后的血浆转移至新的 2 ml 离心管中，并加入 0.5 倍体积的 1x PBS。</li>
	<li>涡旋震荡样品，以充分混匀溶液。</li>
	<li>向样品中加入 0.05 倍体积的 Proteinase K 溶液（试剂盒提供）。</li>
	<li>涡旋震荡样品，随后在 37 °C 孵育 10 分钟。</li>
	<li>向样品中加入 0.2 倍体积的外泌体沉淀缓冲液，并通过倒置混匀溶液。</li>
	<li>将样品在 2 °C 至 8 °C 孵育 30 分钟&#160;，然后在室温下以 10,000 × g 离心 5 分钟&#160;。</li>
	<li>吸除并弃去上清液。沉淀物即为分离得到的外泌体。</li>
	<li>加入选定的缓冲液以重悬外泌体沉淀。缓冲液的选择取决于后续分析方案，具体如下：
	<ol>
		<li>加入 100 µl 的 1x PBS，用于进行透射电子显微镜（TEM）分析。</li>
		<li>加入 346.5 µl 用于 RNA 提取的特异性裂解缓冲液（来自商业试剂盒）（注意：存在化学危害）。</li>
		<li>加入 100 µl 用于蛋白质提取的裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.6 - 300 mM NaCl - 0.5% Triton X-100 - 1 mM PMSF - 10 µg/ml Leupeptin/Aprotinin），用于进行 Western Blotting 分析。（注意：存在化学危害）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将重悬后的外泌体储存于 −20 °C。</li>
</ol>
2. 通过蛋白质印迹分析对外泌体进行表征
注意：为了表征分离得到的纳米囊泡，建议使用针对 ALIX 和 TSG101 的抗体进行蛋白质印迹分析（这两种蛋白是公认的外泌体标志物）。
<ol>
	<li>将外泌体沉淀重悬于裂解缓冲液中后，置于冰上1小时，以溶解外泌体膜。</li>
	<li>将裂解物在12,000 g离心10分钟&#160;，并将上清液转移至新管中，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>通过Bradford法或其他方法定量总外泌体蛋白含量，并在Tris/Glycine SDS-8%聚丙烯酰胺凝胶中每孔上样50 µg蛋白。（注意：化学品危害）。</li>
	<li>使用电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS）在8% SDS-PAGE凝胶中以120 V恒压电泳1小时30分钟&#160;，分离蛋白质及适当分子量标记物。（注意：化学品危害）。</li>
	<li>使用4 °C预冷的转移缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20%甲醇），以50 V恒压电转印1小时，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。（注意：化学品危害）。</li>
	<li>用含5%脱脂奶粉的1×TBS-Tween 0.1%缓冲液，在缓慢振荡条件下封闭膜1小时。</li>
	<li>用1×TBS-Tween 0.1%缓冲液在快速振荡条件下洗涤膜4次，每次5分钟&#160;。</li>
	<li>根据抗体说明书推荐的缓冲液，分别加入针对ALIX和TSG101的一抗（每张膜一种抗体），并在缓慢振荡条件下孵育过夜&#160;。</li>
	<li>用1×TBS-Tween 0.1%缓冲液在快速振荡条件下洗涤膜5次，每次5分钟&#160;，以去除未结合的一抗。</li>
	<li>根据抗体说明书推荐的缓冲液，加入相应的二抗，并在缓慢振荡条件下孵育1小时。</li>
	<li>用1×TBS-Tween 0.1%缓冲液在快速振荡条件下洗涤膜5次，每次5分钟&#160;，以去除未结合的二抗。</li>
	<li>通过化学发光分析检测目标蛋白11。</li>
</ol>
3. 通过透射电子显微镜分析对外泌体进行表征
注意：为了观察分离的外泌体，进行了透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）分析。
<ol>
	<li>放置 &#160;~10 &#181;将已通过Bradford法预先定量的完整外泌体样本，用1×PBS重悬后取g量置于parafilm上，再将铜镍载网（表面覆有Formvar碳膜）放置于液滴上孵育1小时。</li>
	<li>将载网在3个40 μL的溶液上各放置一次，洗涤3次 &#181;1× PBS 滴加液</li>
	<li>将载网置于5个30 μL的液滴上，每个液滴洗涤一次，共洗涤5次 &#181;l 超纯水滴。</li>
	<li>加入一滴2.5%戊二醛（注意：化学品危险）固定样品，孵育10分钟。</li>
	<li>将载网在3个40 μL液滴上各漂洗3次 &#181;1× PBS 滴液。</li>
	<li>加入一滴2%醋酸铀（注意：化学品危险），将载网置于其上染色15分钟&#160;以对比样本。</li>
	<li>将样品置于一滴0.13%甲基纤维素（注意：化学品危害）和0.4%醋酸铀酰的混合液上，将载网置于液滴上方孵育10分钟。</li>
	<li>用吸水纸轻轻吸去多余液体，并将载网干燥5分钟&#160;涂层面向上。</li>
	<li>通过透射电子显微镜观察网格12.</li>
</ol>
4. 外泌体RNA提取与定量
注意：我们决定根据制造商的说明书，使用商业试剂盒从外泌体样本中进行总RNA提取：（注意：存在化学危害，请查阅制造商的说明书和安全指南）。
<ol>
	<li>将外泌体沉淀重悬于 346.5 µl 裂解缓冲液中后，加入 3.5 µl β-巯基乙醇（注意：具有化学危害），并剧烈涡旋；此步骤为破坏脂质膜所必需。</li>
	<li>将裂解液加入收集管中的洗涤柱内，于 11,000 × g 离心 1 分钟。离心后弃去柱子，将滤液转移至新的 1.5 ml 无 RNase 的离心管中。</li>
	<li>加入 350 µl 70% 乙醇（注意：具有化学危害），涡旋混匀 5 秒。</li>
	<li>将裂解液加入解析柱中，于 8,000 × g 离心 30 秒。离心后弃去穿流液，将柱子转移至新的收集管中。</li>
	<li>向柱中加入 350 µl 去盐缓冲液&#160;，于 11,000 × g 离心 1 分钟。离心后弃去穿流液，并将柱子放回同一收集管中。</li>
	<li>在柱子的硅胶膜上加入 95 µl DNase I 反应混合液（每份样品加入 10 µl 重组 DNase I 和 90 µl DNase 缓冲液），于室温孵育 15 分钟&#160;（注意：具有化学危害）。</li>
	<li>向柱中加入 200 µl 洗涤缓冲液（注意：具有化学危害），于 11,000 × g 离心 1 分钟。将柱子放入新的收集管中。</li>
	<li>向柱中加入 600 µl 洗涤缓冲液，于 11,000 × g 离心 1 分钟。离心后弃去穿流液，将柱子放回同一收集管中。</li>
	<li>向柱中加入 250 µl 洗涤缓冲液，于 11,000 × g 离心 2 分钟。将柱子放入一个 1.5 ml 无 RNase 的离心管中。</li>
	<li>用 40 µl 无 RNase 的水洗脱 RNA，并于 11,000 × g 离心 1 分钟，以在此小体积中获得高浓度的 RNA。</li>
	<li>立即把洗脱的 RNA 置于冰上以防止可能的降解，或储存于 -80 °C。</li>
	<li>定量 RNA 含量。注：此处使用 1 µl 样品通过分光光度计进行 RNA 定量。</li>
</ol>
5. 外泌体miRNA的逆转录
注意：由于外泌体中miRNA含量有限，根据试剂盒制造商的说明书，决定通过商业试剂盒对选定的miRNA进行逆转录，每个miRNA使用独立的检测方法。针对每个样本，选择了8个与非小细胞肺癌（NSCLC）状态相关的miRNA（miR-30b；miR-30c；miR-103；miR-122；miR-195；miR-203；miR-221；miR-222；以及作为内参对照的miR-1228-3p）。
<ol>
	<li>配制逆转录主混合液（RT混合液）。每个反应配制7 μL &#181;l 的 RT 反应混合液，具体方法如所述 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">表1（点击此处下载）</a>。（警告：化学品危害） 
	注意：本实验中，每份样本制备了9种不同的逆转录反应混合液。</li>
	<li>轻轻混匀，将反转录混合液置于冰上保存。加入7 &#181;每反应管加入 l 的 RT 混合液。</li>
	<li>加入5 &#181;l 微升样本 RNA（10 &#181;每反应管加入总RNA的量为g，并轻轻混匀。</li>
	<li>加入3 &#181;将每套试剂中的5倍逆转录引物（注意：化学品危害）加入对应的反应管中。</li>
	<li>缓慢混合，盖上管盖，于冰上孵育5分钟。</li>
	<li>将反应管放入热循环仪中，并使用以下参数开始逆转录反应（HOLD at 16 &#176;C孵育30分钟；42℃保存 &#176;C，30 分钟；85 ℃ 保持 &#176;5 分钟 C；保持 &#8734; 4 &#176;C）。</li>
</ol>
6. 外泌体miRNA的实时PCR分析
注意：本分析采用商业化的实时荧光定量 PCR（qPCR）试剂盒进行，每个样本设置三个生物学重复和技术重复。
<ol>
	<li>每个反应中，准备 17.67 µl 的实时 PCR 混合液（10 µl PCR 预混液 + 7.67 µl 无核酸酶水），混匀后置于冰上。（注意：存在化学危害）</li>
	<li>向每个 PCR 管中加入 1 µl 的 20 倍浓度 qPCR 引物（注意：存在化学危害）。</li>
	<li>将 18.67 µl qPCR 混合液加入每孔板中。</li>
	<li>向对应的孔板中加入 1.33 µl 逆转录产物。</li>
	<li>封闭板子并离心（300 ×g，5 秒）。</li>
	<li>将板子放入实时 PCR 系统中，并按照以下 PCR 条件开始运行：95°C 持续 10 分钟；进行 40 个循环，每个循环为 95°C 持续 15 秒&#160;和 60°C 持续 60 秒&#160;。根据公式 2-ΔΔct 13 对数据进行处理和标准化。</li>
</ol>

<ol><li>Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Rolfo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+patients+with+NSCLC+that+do+not+respond+to+treatment+with+EGFR+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors.</a> Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).</li>
<li>Rolfo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies+in+lung+cancer%3A+the+new+ambrosia+of+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers.</a> Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).</li>
<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).</li>
<li>Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+proteomics+to+understanding+the+role+of+tumor-derived+exosomes+in+cancer+progression%3A+state+of+the+art+and+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).</li>
<li>Taverna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+shuttling+of+miR-126+in+endothelial+cells+modulates+adhesive+and+migratory+abilities+of+chronic+myelogenous+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells.</a> Mol Cancer. 11, (2014).</li>
<li>Taverna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+in+vitro+and+in+vivo+chronic+myelogenous+leukemia+cells+growth%3A+a+possible+role+for+exosomal+disposal+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Garofalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+TRAIL+resistance+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).</li>
<li>Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA%3A+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+miR-1228+as+a+stable+endogenous+control+for+the+quantification+of+circulating+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients.</a> Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).</li>
<li>Alessandro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+carboxyamidotriazole+on+in+vitro+models+of+imatinib-resistant+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia.</a> J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Derived+from+Human+Umbilical+Cord+Mesenchymal+Stem+Cells+Relieve+Acute+Myocardial+Ischemic+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>Yoko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+MDR%271and+induction+of+doxorubicin+resistance+by+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+%28FK228%29+and+ATRA+in+acute+promyelocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells.</a> Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).</li>
</ol>

所有作者均声明不存在竞争性财务利益。

通过该联合方案，可对非小细胞肺癌患者血浆中的外泌体miRNA进行分析。这些数据可能反映疾病的状况，但还需进一步研究加以证实。
本文所采用的方案基于一种用于外泌体分离的商业试剂盒。原因是其他已知的分离方法（例如，密度梯度超速离心法）需要更多手动操作步骤，导致标准化程度有限。然而，本方案的一个局限性在于，与用于外泌体分离的密度梯度超速离心法相比，后者仍是一种非常有用的技术，能够利用外泌体的特定密度（1.13 - 1.19 g/ml）。一种可能的改进方案是将这两种方法结合使用，这或许会成为该领域的金标准。
使用RNase处理临床样本的可能性使我们获得了不含循环miRNA污染的纯净样本。然而，样本中RNase酶的存在可能会影响外泌体裂解后外泌体miRNA的含量。因此，我们选择了一种采用蛋白酶K处理的试剂盒，以消除循环中的污染物蛋白并降解RNase酶。
在标准化所有分离步骤后，对这些数据进行后续表征和miRNA分析可成为一种有用的工具，用于在初次诊断及随访过程中以...

非小细胞肺癌（NSCLC）患者的低生存率主要归因于晚期疾病治疗效果有限以及早期检测手段不足1。在部分NSCLC患者亚群中发现的EGFR基因激活突变，已被证实可使肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）敏感。然而，大多数携带EGFR突变的NSCLC患者最终会发展出对TKIs的耐药性2。尤其在这一背景下，准确的诊断至关重要。通常由于肿瘤位置的原因，获取NSCLC患者的活检组织并不总是可行。因此，目前已有多项研究正在探索利用无创方法获取这些生物学信息。外泌体被视为液体活检的组成部分，可通过无创技术进行检测，以获得具有诊断和预后价值的信息3。
外泌体是一类起源于内吞作用的纳米囊泡（直径为40 - 100 nm），在生理和病理条件下可由多种细胞类型释放4。外泌体可携带蛋白质、脂质、mRNA和微小RNA。此外，多项研究表明，肿瘤来源的外泌体具有多效性功能，能够影响肿瘤细胞的生长与存活、血管生成、基质及细胞外基质重塑以及药物耐药性5。
微小RNA（miRNAs）是一类短的非编码RNA，参与转录后调控，通过与靶标mRNA的3′-非翻译区（3′-UTR）结合，导致mRNA降解或抑制其翻译。6已有关于miRNA选择性分选进入外泌体的报道。在此背景下，最近的研究表明， 体外 和 体内姜黄素处理后慢性髓系白血病细胞系释放的外泌体中miR-21（一种具有致癌作用的知名miRNA）的选择性包装7.
外泌体miRNA谱与原发性肿瘤的miRNA谱相似，这一特性可用于早期诊断和预后评估3具体而言，可以通过实时PCR对与疾病分子特征相关的特定miRNA进行表征， 例如，以及其他EGFR突变8.
本文描述了对一组选定的与非小细胞肺癌（NSCLC）相关的miRNA8-9的分析，这些miRNA是从NSCLC患者血液中释放的外泌体中分离得到的。在获得患者的知情同意报告后，对12名NSCLC患者和6名健康对照者的血浆样本进行了分析。外泌体的分离采用商业试剂盒，并按照制造商提供的操作说明进行。在外泌体分离之前，血浆样本经RNA酶处理，以降解可能污染的循环游离miRNA。我们选择使用商业试剂盒进行该分析，是因为其他技术（例如，超速离心法）的标准化程度有限，而在处理临床样本时，标准化尤为重要。该试剂盒包含蛋白酶K处理步骤，可降解RNA酶，从而在外泌体裂解后降低外泌体miRNA被降解的风险。microRNA的分析采用高灵敏度和特异性的实时PCR方法；以mir-1228-3p作为内参对照，数据根据公式2-ΔΔct进行归一化处理。以对照组数值作为基线，结果以对数尺度表示。

<table><tbody><tr><td>总外泌体分离试剂盒（来自血浆）</td><td>&amp;nbsp;Invitrogen</td><td>4484450</td><td>使用蛋白酶K处理</td></tr><tr><td>核糖核酸酶A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ALIX抗体（3A9）</td><td>Cell Signaling</td><td>2171S</td><td></td></tr><tr><td>TSG-101抗体（C-2）</td><td>SantaCruz Biotecnology</td><td>SC-7964&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠HRP 1 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>RNAspin Illustra小型试剂盒 50</td><td>GE HealthCare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>Taqman microRNA逆转录试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-1228-3p TaqMan microRNA检测</td><td>Life Technologies</td><td>002919</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-30b TaqMan microRNA检测</td><td>Life Technologies</td><td>000602</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-30c TaqMan microRNA检测</td><td>Life Technologies</td><td>000419</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-122 TaqMan microRNA检测</td><td>Life Technologies</td><td>002245</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-195 TaqMan microRNA检测</td><td>Life Technologies</td><td>000494</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-203 TaqMan microRNA检测</td><td>Life Technologies</td><td>000507</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-103 TaqMan microRNA检测</td><td>Life Technologies</td><td>000439</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-221 TaqMan microRNA检测</td><td>Life Technologies</td><td>000524</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-222 TaqMan microRNA检测</td><td>Life Technologies</td><td>002276</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan通用预混液II，不含UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4440043</td><td></td></tr></tbody></table>

非小细胞肺癌（nsclc）患者血浆中外泌体mirna的qpcr分析：一种可行的液体活检工具

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

在非小细胞肺癌（NSCLC）中，包括 EGFR 和 ALK 基因在内的多种基因变异的发现，推动了使用选择性酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）进行靶向药物治疗的发展。为了优化这些 TKIs 的应用，发现用于早期检测和疾病进展监测的新生物标志物至关重要。这些从血浆中分离的外泌体可作为无创且可重复的方法，用于检测和随访这些生物标志物。本研究使用了来自12例具有不同突变和治疗方案的非小细胞肺癌患者（另加6名健康供体作为对照）的1 ml 血浆作为外泌体来源。为降解游离循环miRNA，样本先经RNA酶处理，随后使用商用试剂盒分离外泌体，并重悬于特定缓冲液中以进行后续分析。通过蛋白免疫印迹法检测ALIX和TSG101，以及通过透射电子显微镜（TEM）分析对外泌体进行表征，这是获取这些纳米囊泡生化和尺寸信息的标准技术。总RNA提取采用高得率的商用试剂盒完成。由于外泌体中miRNA含量有限，我们决定采用针对每个选定miRNA的独立引物进行逆转录PCR。利用实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）极高的灵敏度和特异性，分析了一组与非小细胞肺癌相关的miRNA（30b、30c、103、122、195、203、221、222）；以mir-1228-3p作为内参对照，数据按照公式 2-ΔΔct 13 进行处理。对照组数值作为基线，结果以对数尺度表示。

采用商用试剂盒对12例非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆样本和6例健康对照样本进行外泌体分离。每个样本均通过蛋白质印迹分析检测外泌体标志物ALIX（96 kDa）和TSG101（43 kDa）。图1展示了其中3个样本的检测结果，表明使用该方案从血浆样本中分离外泌体是可行的。
为了从生物物理角度表征外泌体样品，进行了透射电子显微镜（TEM）分析。TEM结果显示，通过该分离方案获得的纳米囊泡的平均大小处于外泌体的典型尺寸范围，即40 - 100 nm之间（图2）。
外泌体分离与表征后，我们检测了其miRNA含量。我们选取了8种在非小细胞肺癌（NSCLC）中已知表达失调的特定miRNA。作为内参对照，我们使用了miR-1228，该miRNA此前已在多种肿瘤类型中被验证为稳...

本方案描述了利用商业化的外泌体分离试剂盒，结合蛋白酶K和RNase处理，从非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中释放的外泌体进行miRNA谱分析的可行性，以避免游离miRNA的污染，并评估其在NSCLC中的生物标志物特征。

非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中外泌体miRNA的qPCR分析：一种可行的液体活检工具

非小细胞肺癌中 EGFR 和 ALK 等基因变异的发现，推动了采用选择性靶向药物治疗的发展……

本实验的总体目标是分离非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中的外泌体，通过在外泌体分离前采用双重酶处理，去除游离的循环微小RNA（micro RNA）及非外泌体来源的微小RNA（如游离的微小RNA酶），从而获得纯净的外泌体。该方法有助于将微小RNA的液体活检分析限定于外泌体组分，进而阐明其作为生物标志物的应用潜力。该方法的主要优势在于酶法预处理步骤，可有效消除可能干扰分析结果的非外泌体来源微小RNA。首先将1 mL血浆样本置于冰上解冻。解冻后，轻轻颠倒离心管数次，以分散可能形成的冷沉淀物。随后在室温下以2,000 ×g离心20分钟，以去除细胞和碎片。收集上清液，并将血浆再次离心，此次在10,000 ×g 条件下离心20分钟。再次收集血浆上清液，然后加入10 µL RNase。将血浆置于恒温金属浴中，37 °C 孵育10分钟。我们在标准关键步骤中增加了RNase处理步骤，以降解游离的micro RNA酶。随后利用包含关键步骤的蛋白酶处理步骤，以降解RNA检测中的干扰物质，并保护外泌体中micro RNA酶的完整性。接下来，将血浆转移至新离心管中，加入等体积一半的1×PBS缓冲液，并涡旋混匀。然后加入0.05倍体积的蛋白酶K溶液，再次涡旋混匀样品，并在37摄氏度下孵育10分钟。接着加入0.2倍体积的外泌体沉淀缓冲液，通过倒置混匀样品。随后将样品在4摄氏度下孵育30分钟。冷孵育后，在室温下以10,000 G离心样品5分钟。取20至50微升上清液 aliquot，保存用于对照目的。然后吸除并弃去剩余的上清液。根据下游分析的需求，将外泌体沉淀重悬于适量的所需缓冲液中。若进行RNA分析，则加入用于RNA提取的特异性裂解缓冲液。实验开始前，使用适当的试剂清洁工作区域及相关物品，以确保无RNase的环境。根据供应商的说明配制反转录主混合液。本示例中将处理两个样本。对于每个样本，准备九份主混合液，每份七微升，分别用于每种选定的微小RNA。将反应管置于冰上。然后向每个反应管中加入5 µL外泌体RNA溶液，总RNA浓度为10 µg。用轻柔的移液操作混匀样品。然后向每个反应管中加入三微升相应的反转录引物，并用移液器轻轻混匀样品。冰上孵育五分钟后再进行后续操作。现在可将反应管放入热循环仪中。根据供应商的要求运行反应循环。在此过程中，每位患者的全部 micro RNA 酶均需进行三次重复检测，包括阴性对照的三次重复。务必包含至少一种参考微小RNA，以正确归一化数据，因为目前尚无关于稳定表达的循环微小RNA的共识。可使用先前获得的候选微小RNA作为参考。首先准备PCR反应体系。为每种待检测的微小RNA配制一份混合液。将试剂和引物置于冰上避光保存，直至使用。每个PCR孔准备加入10微升PCR预混液。使用 7.67 mL 无核酸酶水和 1 微升 PCR 引物，将这些体积按所需扩增至填满板上孔数

exosomal-mirna-analysis-non-small-cell-lung-cancer-nsclc-patients

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

外来体miRNA的分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者的血浆通过定量PCR：一种可行的液体活检工具

microRNA（miRNA）是具有组织特异性的微小非编码RNA，可调控基因表达，有望成为肺癌早期检测的理想候选标志物。在本视频展示的实验方案中，我们将从患者血液样本中分离microRNA，用于肺癌的早期筛查。...

miRNA 提取：一种从血浆样本中提取 miRNA 的方法

血浆分离的外泌体可作为一种无创且可重复的方法，用于生物标志物的检测和随访，以实现早期发现和疾病进展监测。本视频介绍了从非小细胞肺癌患者血浆样本中分离外泌体的实验方案，该方法可用于后续的DNA和蛋白质提取。...

外泌体分离：一种从非小细胞肺癌患者血浆中分离外泌体的技术

关键词：外泌体，非小细胞肺癌，血浆，分离技术，生物标志物

本视频介绍了使用有机提取法结合玻璃纤维柱富集技术，从结直肠癌患者血浆样本中提取循环microRNA的方法。miRNA在血清和血浆等生物体液中具有良好的稳定性，使其成为癌症诊断、预后评估以及治疗决策与监测的理想循环生物标志物。该方法将有助于发现能够预测患者临床结局的新型循环生物标志物。...

循环miRNA提取：通过有机提取和小RNA富集从血浆样本中分离miRNA的方法

本文介绍了BioMILD筛查试验中采用的详细方案，用于进行循环microRNA特征分类检测，以实现肺癌的早期检测。...

基于微小RNA的液体活检：血浆微小RNA特征分类器（MSC）在肺癌筛查中的应用经验

在临床诊断中，检测血液中的循环核糖核酸（cRNA）是一个尚未满足的需求。本文介绍了利用高灵敏度和特异性的数字聚合酶链式反应，对非小细胞肺癌患者来源的cRNA进行表征的方法。该检测方法符合设计要求，可在72小时内检测出融合变异体。...

一种基于血液的检测方法，利用数字聚合酶链式反应检测循环核糖核酸中的ROS1与RET融合转录本

我们介绍了一种用于评估癌症患者血浆样本中循环微小RNA（miRNA）表达水平的实验方案。具体而言，我们采用了一种市售的试剂盒进行循环miRNA的提取和逆转录。最后，利用实时荧光定量PCR预点样探针定制板，对24种选定的miRNA进行了检测分析。...

转移性结直肠癌患者循环microRNA定制 panel 的检测

外泌体来源的疾病及恶性细胞生物标志物在临床转化中受到缺乏快速且准确定量方法的限制。本报告描述了利用低倍暗场显微镜图像对外泌体特定亚型在少量血清或血浆样本中进行定量分析的方法。...

利用纳米等离子体增强散射与低倍显微镜成像定量肿瘤来源的外泌体

晚期前列腺癌患者常出现治疗耐药，部分病例中癌症会进展为一种称为神经内分泌型前列腺癌的致死性亚型。研究介导这一转变过程的小分子非编码RNA相关的分子改变，有助于更精确地进行疾病分型，并识别导致神经内分泌型前列腺癌发生的因果机制。...

从去势抵抗性前列腺癌患者的福尔马林固定组织及血清来源外泌体中测序小非编码RNA

本方案描述了一种串联免疫荧光杂交检测法，利用甲醛固定石蜡包埋组织同时检测并定量 microRNA...

通过锁核酸进行微小RNA的扩增与识别 原位 杂交作为一种新型检测与定量方法

本文全面概述了构建口腔癌小鼠模型的技术，以及通过多光子显微镜对标记细胞进行舌内肿瘤侵袭的定量监测方法。该系统可作为评估抗侵袭性化合物分子机制及药物疗效的有用平台。...

多光子成像技术在口腔鳞状细胞癌原位小鼠模型中对肿瘤细胞侵袭的观察

学习通过双重酶处理从非小细胞肺癌患者血浆中分离外泌体并去除非外泌体miRNA污染的方法。该技术可提高外泌体miRNA分析的准确性，为液体活检生物标志物研究提供可靠工具。

非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中外泌体miRNA的qPCR分析：一种可行的液体活检工具

探索更多视频