激光辅助显微切割（LAM）作为单细胞类型转录谱分析的工具

本实验方案针对LAM的总体目标是分离特定的植物细胞，以获得高质量的RNA用于转录分析。重点在于难以获取的细胞，例如有性生殖和无融合生殖的拟南芥属（boechera）物种中的卵细胞。该方法有助于解答植物发育遗传学领域的一些关键问题，例如通过种子实现有性与无性植物繁殖背后的转录基础。

该技术的主要优势在于能够执行特定类型的特定操作，克服在动脉粥样硬化组织分析中稀有细胞类型转录被掩盖的影响。开始此操作时，使用封闭站将预热的新鲜塑料平衡盘装满56°C融化的石蜡。

打开石蜡浴锅盖，一次取一个样本盒。将样本转移至平衡托盘中56摄氏度的液态石蜡中。操作需迅速，以避免在处理样本盒时石蜡在样本周围凝固。

然后，使用制备针根据实验设计将样品定位。重复此操作，直至所有样品均转移完毕。为制备用于激光显微切割的薄切片，在光照台上将带有样品的石蜡从塑料托盘中取出。

使用无RNase的剃刀刀片切下含有样品（如花芽或花朵）的石蜡块。接着，将少量石蜡在玻片铲尖端熔化，利用热熔的石蜡将包埋有样品的石蜡块固定于载具上。

用剃刀去除样本周围多余的石蜡，确保包埋块表面呈方形且边缘平行。然后将加热板温度设为42摄氏度。将样本安全固定于切片机上。

制备博氏菌成熟配子体细胞的7微米厚切片。随后，将10至15厘米长的石蜡带转移至底部铺有黑色卡纸的塑料盒中，再将其置于LAM载玻片上。为准备LAM用载玻片，将5至10个带金属框的载玻片平面向上放置在加热板上。

在载玻片的塑料部分加入一到两毫升无RNase水。使用刀片将石蜡带切成约四到五厘米长的小段，长度需足以覆盖载玻片塑料窗口部分。

然后，使用一对镊子和解剖针将石蜡条平行放置在载玻片的塑料窗口上。小心抬起载玻片一端以除去水分，然后将其放回。用塑料盖覆盖加热板，但不要触碰载玻片，并确保塑料盖允许空气交换。

将载玻片在42摄氏度下干燥过夜。在化学通风橱内，用二甲苯对载玻片脱蜡，每次10分钟，共两次。确保仅浸没载玻片的塑料部分，保持每个载玻片金属框架较宽一端干燥，以便后续取出。

在进行激光显微切割（LAM）前，将载玻片置于通风橱中干燥10分钟。在此过程中，打开计算机和显微镜电源。然后，启动控制显微镜和激光的程序。

打开激光控制箱，通过按下控制箱上的相应按钮启动激光器。接着，将帽盖放入帽盖架中。将LAM载片放置在显微镜用的玻璃载片上，确保带有组织的平整面朝向玻璃载片。

然后，将载玻片放入仪器中，使玻璃载片位于下方。最后，将带有盖玻片的盖片架置于仪器中。选择 4 倍物镜。

在程序中将盖子移至上方位置。随后对载玻片进行扫描。浏览载玻片并识别感兴趣的结构。

精确定位并保存样本在载玻片上的位置，以便在切割步骤时能够返回到准确位置。然后选择合适的物镜，通过按一次激光发射按钮来确认激光的位置。

理想情况下，选择膜上无组织的区域。将盖子置于向下位置，使用手写笔工具标记目标细胞类型或组织的边界，例如卵细胞。

通过按“Cut”键使用激光进行切割。为了分离单个细胞，关键是要在正确的切片中清晰地识别它们。此外，细胞的直径应至少达到八微米，以确保能够进行细胞类型特异性的转录分析。

请注意，如果细胞周围的边界未被完全切开，通常可在屏幕上观察到此情况，此时需要重复切片操作。建议将软件设置为默认自动重复执行两次切片。随后，抬起切片盖，移动至下一个保存位置，对感兴趣的结构进行下一个细胞区域的切开，直至收集完一张载玻片上所有目标细胞。

确保盖帽的位置能使新切段粘附在盖帽的空白区域。当所有载玻片中目标细胞类型均已被分离后，将载玻片从仪器中取出。将盖帽架置于下降位置，并目视检查盖帽表面。

使用 4 倍物镜排除样本中的非特异性污染。然后盖上盖子，将干燥切片在 -80 摄氏度下冷冻保存，以备后续使用。

这是成熟雌配子体的示意图。这些是包含雌配子体的倒挂金钟荠（boechera divaricarpa）胚珠的切片，其中卵细胞由于雌配子体特有的形态而可以清晰识别。通过分析来自同一载玻片的卵细胞切片与作为对照的大块组织区域，所获得的RNA质量相似。

所获得的RNA质量适用于细胞类型特异性的RNA测序，从而鉴定出236个在无融合生殖卵细胞中表达、但在无融合生殖中央细胞、助细胞、无融合生殖起始细胞或拟南芥成熟有性雌配子体的细胞中均不表达的基因。还可对来自不同物种的其他细胞和组织类型进行分析，以解答发育遗传学领域的其他问题。

例如植物种子胚乳和胚胎中基因组印记的分子基础。该技术的发展为发育遗传学和植物生殖领域的研究人员探索遏蓝菜属（Boechera）无融合生殖的转录基础提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用激光显微切割技术获取高质量RNA，以用于细胞类型特异性的转录分析。