Name: 激光辅助显微切割（LAM）作为个体细胞类型的转录谱的工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 了解激光辅助显微切割技术，用于从Boechera植物中分离雌性生殖系细胞以获取高完整性RNA。该方法支持转录谱分析，揭示植物有性和无性生殖的分子机制。

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我们感谢 Timothy F. Sharbel（IPK Gatersleben）提供 Boechera divaricarpa 种子，感谢 Sharon Kessler（俄克拉荷马大学）对本文的审阅和校对。UG 实验室中关于细胞类型特异性转录组分析以研究配子体发育和无融合生殖的研究工作，得到了苏黎世大学、德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的博士后奖学金以及 Marie Curie 项目 IDEAGENA（授予 AS）、瑞士联邦教育与科研国务秘书处（Staatssekretariat für Bildung und Forschung）在 COST 行动 FA0903 框架内的资助（资助对象为 UG 和 AS）以及瑞士国家科学基金会（资助对象为 UG）的支持。

注意：本方案描述了用于转录谱分析的组织制备、激光捕获显微切割及RNA提取步骤。在整个方案的所有步骤中，必须始终佩戴手套。请仔细阅读并遵守所用每种化学试剂的安全操作说明。特别需要注意的是，二甲苯具有危害性，可穿透手套，而甲醇具有毒性。对于所使用的所有仪器，请参照相应的用户手册进行操作。
1. 去除玻璃器皿及其他设备上的RNase活性
<ol>
	<li>使用前，将所有玻璃器皿&#160;用铝箔包裹，并在180 °C下烘烤约8小时，以确保无RNA酶污染。</li>
	<li>对所有金属表面（例如，镊子）、工作台面及加热板均使用适当的RNA酶去污溶液进行处理。随后用无RNA酶的水清洗表面以去除去污溶液，再用70%乙醇进一步清洁表面。</li>
	<li>所有塑料耗材（例如，离心管）均应使用全新产品，无需预处理。如条件允许，应选用经认证为无RNA酶的塑料耗材。</li>
</ol>
2. 组织固定
<ol>
	<li>在冰上用新的15 ml离心管配制10 ml农夫固定液（乙醇:冰醋酸 = 3:1；v/v）。（每次使用前均须新鲜配制）。作为替代方案，也可使用非交联性固定液乙醇:冰醋酸（5:1；v/v） 18.</li>
	<li>使用精细的镊子采集目标发育阶段的花芽。立即将花芽浸入预冷的固定液中。每固定约20个花芽或花朵，使用10 ml固定液。 拟南芥 或 拟南芥属 注意：使用花朵较大的植物物种时，建议用剃刀刀片将花朵解剖成较小的片段后再进行固定。
	<ol>
		<li>为了获得成熟的配子体，需在收获前2天对花序中2-3个最大的花蕾去雄。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在干燥器底部放入冰块。打开装有样品的试管， 例如， 花朵，并将其置于冰上，可直接放入冰中确保不会倾倒，或使用适当的支撑装置。在释放真空前，进行15分钟的真空浸润处理。
	<ol>
		<li>再次进行真空浸润，持续15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>释放真空，将样品置于冰上过夜（约12小时）保存。用盖子或铝箔覆盖冰桶，并将冰桶置于4 °C的房间或冰箱中，以防止冰融化。注意：不建议延长固定时间。</li>
</ol>
3. 组织包埋、薄切片及用于LAM的载玻片贴片
<ol>
	<li>组织包埋。
	<ol>
		<li>将固定液更换为用纯乙醇和无RNase水配制的70%乙醇。将样品置于冰上，直至后续处理。应在同一天开始样品包埋。若无组织处理仪，可参照其他文献所述进行手动包埋。 9,11 并继续执行步骤 3.1.11。</li>
		<li>用镊子将样品轻轻转移至组织包埋盒中，然后牢固地关闭包埋盒。关键步骤：此过程中应避免样品发生任何程度的干燥，同时避免用镊子挤压样品。 
		注意：应使用铅笔标记盒式容器，最好写在容器的倾斜表面上。</li>
		<li>将装有花芽或花朵的包埋盒置于70%乙醇中保存，直至所有样品均转移至包埋盒并可装入包埋机。为此，可使用盛有70%乙醇的玻璃染色缸。</li>
		<li>从机器的浸提罐中取出组织处理仪的篮筐，将包埋盒转移至篮筐中，确保包埋盒的斜面朝上且方向一致。关键步骤：操作应迅速，以防止组织干燥。若同时处理多个包埋盒，可在加载样本前，先将篮筐放入盛有70%乙醇的无RNA酶容器中。</li>
		<li>将篮子盖上盖子，然后放回烧瓶中。关闭烧瓶。 
		注意：组织处理机将自动对样本进行脱水，更换二甲苯溶剂，并用熔化的石蜡进行浸润。通常该过程需过夜完成。</li>
		<li>启动组织处理仪程序。推荐的标准设置为：70% 乙醇中 1 小时，90% 乙醇中三次，每次 1 小时，100% 乙醇中三次，每次 1 小时，100% 二甲苯中两次，每次 1 小时，随后在室温下于 100% 二甲苯中 1 小时 15 分钟，接着在 56 °C 下进行石蜡浸润，每次 1 小时，共两次，最后一次 3 小时。 11. 
		注意：为确保包埋工作站的石蜡已完全融化并处于就绪状态，应在开始操作前数小时开启仪器，或使用定时功能设定大致的启动时间。 
		注意：如果组织无法立即进行后续处理，可在56 °C石蜡中延长孵育时间，以替代56 °C下3小时的步骤。请参考仪器的用户手册。通常情况下，装有组织的包埋盒将自动保留在熔融石蜡中，直至程序完成。 &#34;空烧瓶&#34; 命令已获批准。若开始组织处理仪时石蜡尚未熔化，则腔室将注入70%乙醇，程序将保持暂停状态，直至准备就绪开始运行。</li>
		<li>清空蒸馏瓶，立即将样品转移至封闭站中56 °C的石蜡浴内。取下篮子的盖子，并用盖子盖好封闭站的石蜡浴。</li>
		<li>在56 °C的封闭站表面堆放与篮中盒数相同数量的新鲜平衡板。 
		注意：可使用耐乙醇的永久性记号笔标记平衡托盘的底部。不建议使用耐丙酮的永久性记号笔。</li>
		<li>使用包埋装置，将56 °C熔化的石蜡倒入预热的全新塑料平衡盘中。打开石蜡浴的盖子，每次仅取一个包埋盒，用镊子将包埋盒中的样本转移至平衡盘内56 °C的液态石蜡中。 
		关键步骤：操作包埋盒时应迅速进行，避免样品周围的石蜡在操作过程中变硬。
		<ol>
			<li>使用准备针在石蜡凝固前根据需要调整所有样品的位置。通常将数朵花放置在平衡托盘中，每朵花在各个方向上间隔约1 cm。</li>
			<li>重复步骤 3.1.9，直至所有样品均被转移。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将篮子放回组织处理机中，并使用适当的程序清洗反应罐（参见用户手册）。</li>
		<li>关闭组织处理机和包埋工作站。继续进行步骤 3.1.13。</li>
		<li>若无组织浸润仪和包埋工作站，可使用加热烘箱在 56 °C 下熔化石蜡。在实验台上，将熔化的石蜡倒入塑料平衡托盘中，将样本转移至石蜡中，并用解剖针调整样本位置。</li>
		<li>让石蜡在室温下硬化约1至3小时，然后将样品储存于4 °C。样品可随后立即进行处理，或保存数月之久。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于LAM的薄切片和载玻片的制备
	<ol>
		<li>在透射光灯箱上，从下方照亮石蜡包埋块，将带有样本的石蜡从周围的塑料模具中取出。分离出含有组织的方形石蜡块， 例如，使用无RNA酶的剃刀刀片切取芽或花。为此，始终将样本朝向石蜡块的顶部放置（另见 图1).
		<ol>
			<li>同时制备所有将用于LAM的样品石蜡块。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将包埋有组织的石蜡块固定在处理包埋盒上：使用乙醇灯加热合适的刮勺尖端，熔化少量石蜡，然后利用热石蜡将石蜡块（组织面朝上）固定在支撑物上。
		<ol>
			<li>在 4 °C 下静置至少 20 分钟，使石蜡完全凝固。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在透射光灯台上用剃刀片去除样本周围多余的石蜡，确保保留一个边缘平行的方形表面（参见 图1).</li>
		<li>将加热板温度设为 42 °C。</li>
		<li>安全地将样品安装到切片机上，制备6 - 10 µm厚的切片。请参考切片机制造商的使用说明。注意：虽然较薄的切片通常能提供更好的结构分辨率，但较厚的切片可获得更大量且质量更高的RNA。对于细胞的 拟南芥属 成熟配子体我们采用7 µm作为默认厚度。将样本较慢地移过切片刀通常能获得更好的组织学切片效果。</li>
		<li>始终将长约10 - 15 cm的石蜡带转移至底部铺有黑色卡纸的塑料盒中，然后再将其置于LAM载玻片上。</li>
		<li>如果可能，预先挑选石蜡条中包含目标细胞或组织类型的区域， 例如， 在解剖镜下挑选胚珠，并弃去其余部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LAM 制片准备
	<ol>
		<li>将所需数量的金属框载玻片（通常为5-10片）平放在加热板上，确保平面朝上。</li>
		<li>在载玻片的塑料部分加入约1-2 ml无RNase水。使用剃刀将石蜡带切成约4-5 cm长的短片段，长度需足以覆盖塑料窗口。用镊子和解剖针将石蜡条平行排列并理想地放置在载玻片的塑料窗口上。小心抬起载玻片一端以去除水分，然后将载玻片放回原位。
		<ol>
			<li>或者，将加热板置于化学通风橱下方。在载玻片的塑料部分滴加少量甲醇，用量以刚好润湿表面为宜（这可能导致载玻片轻微起皱）。将石蜡条放置在载玻片上。 
			注意：由于甲醇具有毒性，应尽可能避免使用。然而，若以水封片所得RNA质量不足，本步骤中使用甲醇可提高RNA质量。在新项目开始时值得测试这两种方法，因为所获得的RNA质量随所研究的细胞类型和物种而异。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将载玻片置于42 °C加热板上干燥过夜，约12小时。用一个不接触载玻片的塑料盖覆盖加热板，确保塑料盖不妨碍空气交换。为此，可将盖子放置在移液器盒或其他类似物体上以将其抬高。
		<ol>
			<li>或者，将干燥时间缩短至最少两小时，或直至组织完全干燥。缩短从切片到收集的时间可能有助于提高RNA质量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在化学通风橱中，使用适当的载玻片架，将载玻片置于二甲苯中脱蜡两次，每次10分钟。确保仅完全浸没每张载玻片的塑料部分，同时保持金属框架较宽的一端干燥，以便通过触碰该干燥端取出载玻片。</li>
		<li>在LAM之前，将载玻片置于通风橱内干燥约10分钟。 
		注意：未立即处理的切片可放回42 °C加热板上，组织面朝上，最多可放置数小时。此操作可防止湿度影响RNA质量，直至后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 激光辅助显微切割（LAM）
注意：激光显微切割（LAM）的操作步骤会因所使用的仪器而异。本方案中的某些细节是针对特定仪器以及利用静电作用力在帽上收集样本的技术而设计的。此外，不同版本的软件之间细节也可能存在差异。有关仪器和软件的详细说明及具体操作指南，请参考制造商提供的使用说明和用户手册。
<ol>
	<li>打开LAM设备（计算机、显微镜、激光控制箱）。</li>
	<li>启动程序以控制显微镜和激光器。</li>
	<li>按下控制箱上的相应按钮以开启激光器。</li>
	<li>将一个盖子（0.5 ml，无扩散器）放入盖子架中，并将其置于仪器内。</li>
	<li>用载玻片支撑LAM载片以进行显微观察。确保带有组织的载片平面朝向载玻片。</li>
	<li>将载玻片放入仪器中，确保玻璃载片位于下方。</li>
	<li>选择 4X 物镜。在程序中选择移动盖子至 &#34;向上&#34; 定位并开始对玻片进行扫描。</li>
	<li>在切片上搜索并识别目标结构。精确定位并保存其在切片上的位置，以便在切割步骤中能够返回到确切位置。</li>
	<li>选择合适的物镜（例如 40倍或60倍。</li>
	<li>如有需要，参照仪器用户手册调整激光速度、焦距和激光功率，并校准载物台移动。针对特定组织建立参数设置后，可重复使用这些设定。</li>
	<li>通过按下按钮进行单次激发以验证激光位置 &#34;激光脉冲&#34; 程序的按钮，理想情况下应位于无组织的膜区域。
	<ol>
		<li>必要时，按照仪器制造商的说明校准激光位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过按住鼠标右键，将明显结构移至显示器软件窗口的四个角，以验证物镜的校准。检查手相对于明显结构的位置在四个角是否一致。若不一致，则根据软件手册校准物镜。</li>
	<li>当帽处于“向下”位置时，使用“手写笔”工具标记目标细胞类型或组织的边界， 例如， 卵细胞。通过按下“cut”键，使用激光解剖目标细胞。注意：如果细胞周围的边界未被一次性完全切开，通常需要重复切片操作。在此情况下，建议将软件设置为默认自动重复切片两次。</li>
	<li>提起盖帽，移动至下一个已保存的位置，获取目标结构。重复操作步骤4.13，以分离下一个细胞切片，直至收集完一张载玻片上所有目标细胞。确保盖帽放置到位，使新的切片粘附在盖帽的空白区域。 
	注意：建议分离较大的组织块（例如， 在新鲜帽上分离单细胞部分后，可从每张载玻片上取整朵花或其部分的切片用于RNA质量控制。</li>
	<li>移除玻片，并通过重复步骤 4.4 - 4.9 以及 4.13 至 4.14 继续进行下一张玻片。</li>
	<li>重复步骤 4.15 及相关步骤，直至所有载玻片中目标细胞类型均已被分离。注意：不建议在同一帽盖上捕获时间超过约 4 - 5 小时。</li>
	<li>激光显微切割后，目视检查盖片表面，以排除样品的非特异性污染。尽管未切割的组织由箔膜保护，但由于静电吸附作用，灰尘仍可能附着在表面。
	<ol>
		<li>取下玻片以目视检查帽盖。将帽盖架置于“向下”位置，并使用4X物镜检查表面。</li>
		<li>若可见微小灰尘颗粒，可用微量移液器吸头（2 µl）将其移除。或者，将载玻片重新安装至仪器上，在载玻片无组织区域的空白位置盖上盖板，利用激光彻底清除污染物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖上管盖，将干燥的样品于 -80 °C 冻存，直至后续使用。如有需要，样品可保存数周。但建议尽快进行下一步操作。</li>
</ol>
5. RNA 提取与质量控制
注意：RNA 可通过任何适用于少量 RNA 的方法进行分离。本方案中描述的是使用专为少量 RNA 设计的 RNA 提取试剂盒。请遵循制造商的说明。
<ol>
	<li>使用管盖上附有样本的离心管，可直接使用或从 -80 °C 取出后使用。
	<ol>
		<li>打开离心管，使用带滤芯的吸头小心地将 11 µl 裂解缓冲液沿管壁加入每根离心管中。每个样本之间需更换吸头。</li>
		<li>盖紧管盖，轻轻震荡，使裂解缓冲液流至管盖部位。</li>
		<li>将离心管倒置（管盖朝下）放入已预热至 42 °C 的加热金属块或烘箱中，按照制造商说明书孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商说明书进行柱纯化前的准备，并收集离心管底部的提取物。
	<ol>
		<li>若需将多个管盖中的材料合并为一个样本，请对每根离心管/管盖分别执行步骤 5.1.1 至 5.1.2。</li>
		<li>随后，将同一样本的所有提取物合并至一根离心管中，并在加入等体积乙醇（EtOH）前，使用移液器测量合并后提取物的总体积。</li>
		<li>确保在上柱前加入的乙醇体积与合并提取物体积相等。</li>
		<li>乙醇沉淀 RNA 后，应立即按照制造商说明书进行上柱操作。继续执行后续步骤，进行 100 × g 离心。</li>
		<li>当每个收集管中的液体全部通过纯化柱后，按照制造商说明书进行 16,000 × g 离心 30 秒，以去除穿流液。</li>
		<li>继续按照制造商说明书完成 RNA 提取与纯化步骤。</li>
		<li>向纯化柱中加入洗脱缓冲液后，静置孵育 1 分钟。随后按照制造商说明书将离心管放入离心机中继续操作。注意：在洗脱前，按照说明书额外进行一次 100 × g 离心 1 分钟，可提高洗脱效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照本实验方案的步骤 5.1 至 5.2.7，从对照样本（较大的组织切片）中提取 RNA，用于 RNA 质量控制。</li>
	<li>进行 RNA 质量控制时，取每个对照样本 1 µl 未经稀释的总 RNA，使用 RNA Pico 芯片在 Bioanalyzer 上进行检测，操作步骤遵循制造商说明书。 
	注意：所提取的 RNA 可用于线性扩增及基于微阵列或 RNA-Seq 的转录组分析7,11,13,14。理想情况下，质量控制结果应显示 RNA 完整性数值（RIN）至少为 7。多家供应商提供适用于扩增的试剂盒，相关示例见文献9。</li>
</ol>

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<li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li>
<li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genome+Scale+Quantitative+Biology+in+Arabidopsis+thaliana%22">Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案适用于不同类型的细胞和组织
结合微阵列或RNA-Seq进行转录组分析的激光显微切割技术（LAM）是一种有价值的工具，可用于深入了解调控发育或生理过程的特定基因表达模式7-11,13,14。然而，该方法对任何特定细胞类型的适用性在很大程度上取决于结构因素。在用于LAM的干燥切片中，细胞必须清晰可见且能够明确识别。在Boechera divaricarpa中，配子体的形态使得卵细胞易于识别（图2，图3）。最终，特定细胞群体的分离速度还取决于在一张载玻片上该细胞类型的出现频率，因为更换载玻片和扫描新载玻片是耗时的步骤。鉴于根据细胞类型的不同，每个样本至少需要汇集200–250个细胞切片，因此该方法对特定研究设计的适用性在很大程度上取决于LAM步骤所需的时间。
此外，根据组织的形态，将切片厚度减少至6 µm可能在结构上更具优势。同样，理想情况下厚度≥ 8 µm的切片通常可从相同量的组织切片中获得更高产量且质量略高的RNA。...

在组织水平的转录研究中，高度特化但稀有的细胞类型的转录组常常被周围更丰富的细胞所掩盖。植物雌性生殖系（germline）细胞便是这类高度特化细胞类型的例子。雌性生殖系在发育中的胚珠内被确定，胚珠是花雌蕊内种子的前体结构。 1,2大孢子母细胞（MMC）是雌性生殖系的第一个细胞。它经过减数分裂形成四个单倍体的大孢子，构成一个四分体。通常，其中仅有一个大孢子存活，并通过有丝分裂进行多次分裂而不发生胞质分裂。 即，形成合胞体。随后经过细胞化过程发育为成熟的雌配子体，通常包含四种细胞类型：三个反足细胞、两个助细胞、一个卵细胞和一个中央细胞。卵细胞和中央细胞是雌性配子，在双受精过程中分别与两个精细胞结合，发育形成胚胎和胚乳。 1,2在性繁殖模型系统中 拟南芥，每朵花仅发育约50粒种子，而在近缘属中，每朵花可发育约50至80粒种子 拟南芥属因此，雌性生殖系仅由少数几种高度特化的细胞类型组成，是研究细胞命运决定和分化等发育过程的理想模型。
此外，对调控植物繁殖的基因调控过程的研究也具有应用价值。在植物中，既可以通过有性繁殖，也可以通过种子进行无性繁殖（即无融合生殖）。有性繁殖能够在群体中产生遗传多样性，而无融合生殖则产生与母本植株遗传上完全相同的克隆后代。因此，无融合生殖在农业和种子生产中具有巨大应用潜力，因为即使是复杂的母本基因型，也能在多代中保持不变3,4,5。由于主要农作物物种中均不存在天然的无融合生殖现象，因此在作物中人工构建无融合生殖体系备受关注3,4,5。然而，这一长期目标的实现难度较大，因为目前对无融合生殖背后的遗传和分子机制尚未充分阐明6。
为了深入了解无融合生殖转录调控的基础机制，利用激光显微切割技术（LAM）结合高通量测序（NGS）进行细胞类型特异性的转录谱分析是一种极为强大的方法7,8。LAM最初建立于动物及生物医学研究领域。近年来，该技术也已应用于植物生物学研究6,9,10。与其他可用于特定细胞或组织类型转录谱分析的方法相比，LAM无需构建标记基因的转基因品系6,9,10，因此可在缺乏先验分子信息的情况下应用于任何细胞或组织类型。LAM的另一优势在于，只要能在干燥切片中根据位置和/或结构特征识别目标细胞，即可对任意细胞类型进行操作。此外，LAM使用固定组织样本，可有效防止样品处理过程中转录谱发生改变，这是该技术的又一显著优点。
感兴趣的组织， 例如， 花组织在包埋于石蜡前，需使用非交联固定剂进行固定。石蜡包埋可依照既定方案手工操作完成 9,11然而，使用自动组织处理机进行脱水和石蜡浸润通常能在RNA质量及组织形态保存方面获得更高的可重复性。另一种将组织包埋于树脂中的策略也已成功用于基于激光显微切割的细胞类型特异性分析 8然而，使用自动组织处理机进行石蜡包埋具有很高的时间效率，可同时处理大量样本，且所需人工操作时间最少。尽管在固定和包埋过程中通常不会显著影响RNA质量，但使用切片机制备薄切片，尤其是将切片转移至LAM所用框架载玻片上的步骤，仍是保持RNA质量的关键环节。此前已有研究指出这一点，并描述了采用转移膜系统可在此步骤中获得更优的RNA质量。 12然而，这一步骤在制备切片过程中增加了额外且耗时的操作，并且还需要特殊的设备。下述经过优化的方案能够稳定地获得质量足以用于GeneCHIP芯片和新一代测序（NGS）转录谱分析的RNA 7,11,13,14此外，使用激光显微切割显微镜可常规获得高纯度的分离细胞类型 7,11,13,14.
属Boechera是研究无融合生殖关键步骤的优良模式系统。在Boechera中，已鉴定出多种不同的有性生殖和无融合生殖材料，可用于比较分析15,16,17。通过对有性生殖的Arabidopsis和无融合生殖的Boechera雌性生殖系细胞的细胞类型特异性转录组进行比较，我们鉴定了差异表达的基因和通路，从而揭示了调控无融合生殖的新机制7。此外，本研究验证了LAM技术在小而稀有的细胞类型中进行细胞类型特异性转录分析的适用性。我们已将该实验方案用于多种植物物种中不同细胞类型的分析，但在某些情况下可能需要根据物种和组织特性对方案进行优化调整。

<table><tbody><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>1,009,861,000</td><td>分析纯 EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td></tr><tr><td>15 ml 圆底离心管</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% 分子生物学级</td></tr><tr><td>Ambion 无核酸酶水</td><td>life technologies</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ASP200 S</td><td>Leica</td><td>14048043624</td><td>组织处理仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>黑色卡纸</td><td></td><td></td><td>可在专业纸张商店购买</td></tr><tr><td>无DNA和RNA酶 Frame载玻片</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 &amp;micro;m PET膜；也可从Leica购买</td></tr><tr><td>Dumond 镊子</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>酒精灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z354074-1EA</td><td>Nalgene 真空干燥器或类似设备</td></tr><tr><td>滤芯吸头 10&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>可用类似吸头替代</td></tr><tr><td>滤芯吸头 1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>可用类似吸头替代</td></tr><tr><td>滤芯吸头 20&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td><td>可用类似吸头替代</td></tr><tr><td>滤芯吸头 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>可用类似吸头替代</td></tr><tr><td>精密镊子</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>玻璃载片架</td><td>Huber &amp; Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&amp;auml;rbek&amp;auml;sten nach Hellendahl</td></tr><tr><td>玻璃染色槽</td><td>Huber &amp; Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&amp;auml;rbekasten</td></tr><tr><td>Leica 加热石蜡包埋模块</td><td>Leica</td><td>Leica EG 1150 H</td><td>包埋站，类似设备亦适用</td></tr><tr><td>加热干燥台</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>其他型号和/或供应商的设备亦适用</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>VWR 带盖冰桶&amp;nbsp;</td><td>10146-184</td><td>类似冰桶同样适用</td></tr><tr><td>透射光台</td><td>UVP An Analytical Jena Company</td><td>TW-26&amp;nbsp;</td><td>白光透射照明仪</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>切边</td></tr><tr><td>切片刀片</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>S35 一次性切片刀片</td></tr><tr><td>MMI Cell Cut Plus 仪器</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>防粘、无RNA酶微量离心管，2 ml</td><td>life technologies</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>用于组织学</td></tr><tr><td>PicoPure RNA 提取试剂盒</td><td>life technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA 提取试剂盒</td></tr><tr><td>塑料平衡托盘</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>塑料盒</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>加热板用塑料盖</td><td></td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>解剖针</td><td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>无RNA酶微量离心管</td><td>life technologies</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNAse ZAP 去污染溶液</td><td>life technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>半自动旋转式切片机&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td>类似设备同样适用</td></tr><tr><td>Tissue Loc Histo Screen 包埋盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>其他供应商的类似包埋盒亦适用</td></tr><tr><td>带粘性盖、无扩散器的管子，500 &amp;micro;l&amp;nbsp;</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯（异构体）ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>最低99%，分析纯，ACS，ISO SP</td></tr><tr><td>处理用包埋盒</td><td>Leica</td><td>14039440000</td><td>Leica Jet Cassette I 无盖</td></tr><tr><td>通用烘箱</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>其他型号和/或供应商的设备亦适用</td></tr></tbody></table>

激光辅助显微切割（lam）作为单细胞类型转录谱分析的工具

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

在分子水平上理解发育过程需要深入了解转录调控以及特定细胞类型的转录组。尽管本文所述方法通常适用于多种物种和细胞类型，我们的研究重点是植物生殖。植物栽培和种子生产对人类和动物营养至关重要。要实现对植物繁殖过程的定向调控，必须首先深入理解调控生殖系（种系）形成以及最终种子发育的基因调控网络。特别是将无融合生殖（通过种子进行无性繁殖）引入作物植物具有巨大潜力，因为它能够产生与母本植株基因完全相同的克隆种子。因此，雌性种系的各类细胞对于理解并实现无融合生殖的工程化改造具有重要意义。然而，由于这些细胞深埋于花部组织内部，难以获取，给包括细胞类型特异性转录组学在内的实验分析带来了极大挑战。为克服这一限制，可采用激光显微切割技术（LAM）分离单个细胞。虽然LAM结合转录谱分析能够高特异性地鉴定任意细胞类型中活跃的基因和通路，但建立合适的实验流程仍具挑战性。特别是LAM后获得的RNA质量可能受损，尤其是在靶向微小的单个细胞时。为解决这一问题，我们建立了一套LAM工作流程，可重复地获得高质量RNA，非常适合用于转录组学研究，本文以无融合生殖的Boechera雌性种系细胞分离为例进行了展示。本实验方案详细描述了组织制备与LAM操作步骤，并涵盖了RNA提取及质量控制的相关方法。

样品制备与LAM分步连续进行
通过激光显微切割（LAM）从选定的细胞类型中制备用于转录分析的RNA需要经过一系列连续步骤（图1）。首先收获花朵并立即进行固定，以确保收获后RNA群体保持不变。随后对组织进行包埋、切片并载于载玻片上。这使得可通过LAM分离特定细胞类型，并将细胞类型特异性的切片汇集到一个或多个收集帽上（图1）。之后可将材料冷冻保存，或直接进行RNA提取。除了LAM方法适用于模式物种和非模式物种的细胞类型特异性分析这一优势外，该方法仍较为耗时。从组织收获到RNA提取的整个过程通常至少需要一周的工作时间，有时更长（图1）。需要注意的是，通常会将连续数天LAM获得的切片汇集为一个生物学样本并进行RNA提取。对于Boechera卵细胞，强烈建议每个样本使用至少约200个切片，每天可分离约100个切...

本文介绍了一种用于特定植物细胞类型转录谱分析的激光显微切割技术方案。尽管该方案适用于不同物种和细胞类型，但重点是芸苔族Boechera属中与有性生殖和无融合生殖相关的雌性生殖系中极难获取的细胞。

激光辅助显微切割（LAM）作为单细胞类型转录谱分析的工具

在分子水平上理解发育过程需要深入了解转录调控，因此也需要了解转录组……

本实验方案针对LAM的总体目标是分离特定的植物细胞，以获得高质量的RNA用于转录分析。重点在于难以获取的细胞，例如有性生殖和无融合生殖的拟南芥属（boechera）物种中的卵细胞。该方法有助于解答植物发育遗传学领域的一些关键问题，例如通过种子实现有性与无性植物繁殖背后的转录基础。该技术的主要优势在于能够执行特定类型的特定操作，克服在动脉粥样硬化组织分析中稀有细胞类型转录被掩盖的影响。开始此操作时，使用封闭站将预热的新鲜塑料平衡盘装满56°C融化的石蜡。打开石蜡浴锅盖，一次取一个样本盒。将样本转移至平衡托盘中56摄氏度的液态石蜡中。操作需迅速，以避免在处理样本盒时石蜡在样本周围凝固。然后，使用制备针根据实验设计将样品定位。重复此操作，直至所有样品均转移完毕。为制备用于激光显微切割的薄切片，在光照台上将带有样品的石蜡从塑料托盘中取出。使用无RNase的剃刀刀片切下含有样品（如花芽或花朵）的石蜡块。接着，将少量石蜡在玻片铲尖端熔化，利用热熔的石蜡将包埋有样品的石蜡块固定于载具上。用剃刀去除样本周围多余的石蜡，确保包埋块表面呈方形且边缘平行。然后将加热板温度设为42摄氏度。将样本安全固定于切片机上。制备博氏菌成熟配子体细胞的7微米厚切片。随后，将10至15厘米长的石蜡带转移至底部铺有黑色卡纸的塑料盒中，再将其置于LAM载玻片上。为准备LAM用载玻片，将5至10个带金属框的载玻片平面向上放置在加热板上。在载玻片的塑料部分加入一到两毫升无RNase水。使用刀片将石蜡带切成约四到五厘米长的小段，长度需足以覆盖载玻片塑料窗口部分。然后，使用一对镊子和解剖针将石蜡条平行放置在载玻片的塑料窗口上。小心抬起载玻片一端以除去水分，然后将其放回。用塑料盖覆盖加热板，但不要触碰载玻片，并确保塑料盖允许空气交换。将载玻片在42摄氏度下干燥过夜。在化学通风橱内，用二甲苯对载玻片脱蜡，每次10分钟，共两次。确保仅浸没载玻片的塑料部分，保持每个载玻片金属框架较宽一端干燥，以便后续取出。在进行激光显微切割（LAM）前，将载玻片置于通风橱中干燥10分钟。在此过程中，打开计算机和显微镜电源。然后，启动控制显微镜和激光的程序。打开激光控制箱，通过按下控制箱上的相应按钮启动激光器。接着，将帽盖放入帽盖架中。将LAM载片放置在显微镜用的玻璃载片上，确保带有组织的平整面朝向玻璃载片。然后，将载玻片放入仪器中，使玻璃载片位于下方。最后，将带有盖玻片的盖片架置于仪器中。选择 4 倍物镜。在程序中将盖子移至上方位置。随后对载玻片进行扫描。浏览载玻片并识别感兴趣的结构。精确定位并保存样本在载玻片上的位置，以便在切割步骤时能够返回到准确位置。然后选择合适的物镜，通过按一次激光发射按钮来确认激光的位置。理想情况下，选择膜上无组织的区域。将盖子置于向下位置，使用手写笔工具标记目标细胞类型或组织的边界，例如卵细胞。通过按“Cut”键使用激光进行切割。为了分离单个细胞，关键是要在正确的切片中清晰地识别它们。此外，细胞的直径应至少达到八微米，以确保能够进行细胞类型特异性的转录分析。请注意，如果细胞周围的边界未被完全切开，通常可在屏幕上观察到此情况，此时需要重复切片操作。建议将软件设置为默认自动重复执行两次切片。随后，抬起切片盖，移动至下一个保存位置，对感兴趣的结构进行下一个细胞区域的切开，直至收集完一张载玻片上所有目标细胞。确保盖帽的位置能使新切段粘附在盖帽的空白区域。当所有载玻片中目标细胞类型均已被分离后，将载玻片从仪器中取出。将盖帽架置于下降位置，并目视检查盖帽表面。使用 4 倍物镜排除样本中的非特异性污染。然后盖上盖子，将干燥切片在 -80 摄氏度下冷冻保存，以备后续使用。这是成熟雌配子体的示意图。这些是包含雌配子体的倒挂金钟荠（boechera divaricarpa）胚珠的切片，其中卵细胞由于雌配子体特有的形态而可以清晰识别。通过分析来自同一载玻片的卵细胞切片与作为对照的大块组织区域，所获得的RNA质量相似。所获得的RNA质量适用于细胞类型特异性的RNA测序，从而鉴定出236个在无融合生殖卵细胞中表达、但在无融合生殖中央细胞、助细胞、无融合生殖起始细胞或拟南芥成熟有性雌配子体的细胞中均不表达的基因。还可对来自不同物种的其他细胞和组织类型进行分析，以解答发育遗传学领域的其他问题。例如植物种子胚乳和胚胎中基因组印记的分子基础。该技术的发展为发育遗传学和植物生殖领域的研究人员探索遏蓝菜属（Boechera）无融合生殖的转录基础提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用激光显微切割技术获取高质量RNA，以用于细胞类型特异性的转录分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

激光辅助显微切割（LAM）作为个体细胞类型的转录谱的工具

激光捕获显微技术，又称激光显微切割（LMD），可使用户从冷冻或...

哺乳动物组织的激光显微切割

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