Name: 采用轻质板材荧光显微镜到图像斑马鱼眼睛发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: 学习使用光片荧光显微镜对斑马鱼胚胎进行高分辨率实时成像，观察眼部发育的形态发生事件。该方法具有低光毒性、快速采集和多角度成像的优势，可三维重建发育过程。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Tobias Pietzsch 提供其强大的开源软件 BigDataViewer。感谢马克斯·普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所（MPI-CBG）光学显微技术平台的 Jan Peychl、Sebastian Bundschuh 和 Davide Accardi 在技术上的支持，对本研究所用显微镜的完善维护，以及对稿件提出的宝贵意见；同时感谢 H. Moon（MPI-CBG 科学计算平台）提供 BigDataServer。感谢 Julia Eichhorn 制作了视频 1。Norden 实验室成员及 Svea Grieb 对稿件提出了许多有益的建议。Jaroslav Icha、Christopher Schmied 和 Jaydeep Sidhaye 是国际马克斯·普朗克细胞、发育与系统生物学研究学院的成员，同时也是德累斯顿工业大学的博士生。Pavel Tomancak 获得欧洲研究理事会启动资助（ERC Starting Grant）：“发育进化沙漏模型的定量分析”以及人类前沿科学计划青年研究员资助（RGP0093/2012）。Caren Norden 获得人类前沿科学计划（CDA-00007/2011）和德国研究基金会（DFG）[SFB 655, A25] 的资助。

<ol><li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high-content%2Fhigh-throughput+imaging+and+analysis+of+embryonic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis.</a> Genesis. 49 (7), 555-569 (2011).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Morphogenesis%3A+Technological+Advances+and+Biological+Insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168-1234168 (2013).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> J Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J Biophoton. 6 (11-12), 920-928 (2012).</li>
<li>Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nat Meth. 12 (1), 23-26 (2015).</li>
<li>Chen, B. C., Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Ahrens, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Whole-Brain+Activity+and+Development+at+the+Single-Cell+Level+Using+Light-Sheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy.</a> Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Chang, B. -J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet-based+fluorescence+microscopy+%28LSFM%29+for+the+quantitative+imaging+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues.</a> Cell Tissue Res. 360 (1), 129-141 (2015).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeber%2C+M+%22Quantitative+Imaging+in+Cell+Biology%22">Quantitative Imaging in Cell Biology</a>. , Elsevier Inc. 193-215 (2014).</li>
<li>Strobl, F., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+long-term+fluorescence+live+imaging+of+Tribolium+castaneum+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos.</a> Development. 141 (11), 2361-2361 (2014).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+live+imaging+of+plant+growth+in+near+physiological+bright+conditions+using+light+sheet+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy.</a> Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).</li>
<li>Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2010).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Wu, Y., Ghitani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li>
<li>Sarov, M., Barz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> bioRxiv. , 028308(2015).</li>
<li>Amat, F., Lemon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat Meth. 11 (9), 951-958 (2014).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Meth. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicing+of+single+plane+illumination+microscopy+images+using+groupwise+registration+and+fast+content-based+image+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22SPIEMed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion.</a> SPIEMed Imaging. 6914, 69140E(2008).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Meth. 12 (1), 30-34 (2015).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Scanned+Laser+Light-Sheet+Fluorescence+Microscopy+%28DSLM%29+of+Zebrafish+and+Drosophila+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (10), (2011).</li>
<li>Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair-cell+development+and+regeneration+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish.</a> Front Neuroanat. , (2013).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish embryogenesis.</a> METHODS. , 1-11 (2013).</li>
<li>Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+an+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nat Meth. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSpinMicroscopy%3A+an+open-source+integrated+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform.</a> Nat Meth. 10 (7), 599-600 (2013).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ojoplano-mediated+basal+constriction+is+essential+for+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis.</a> Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).</li>
<li>Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+Nuclear+Migration+Is+Centrosome+Independent+and+Ensures+Apical+Cell+Division+to+Maintain+Tissue+Integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity.</a> Dev Cell. 32 (2), 203-219 (2015).</li>
<li>Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+SPIM+to+track+the+development+of+the+focal+power+of+the+zebrafish+lens%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+BiOS%22%5BJournal%5D)">Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens.</a> SPIE BiOS. 9334, 933408(2015).</li>
<li>Preibisch, S., Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Bayesian-based+multiview+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Efficient Bayesian-based multiview deconvolution.</a> Nat Meth. 11 (6), 645-648 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigDataViewer%3A+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nat Meth. 12 (6), 481-483 (2015).</li>
<li>Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. , BMVA Press. 23.1-23.10 (2002).</li>
<li>Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+volume+reconstruction+from+series+of+ultra-thin+microscopy+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections.</a> Nat Meth. 9 (7), 717-720 (2012).</li>
<li>Fischler, M. A., Bolles, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+sample+consensus%3A+a+paradigm+for+model+fitting+with+applications+to+image+analysis+and+automated+cartography%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+ACM%22%5BJournal%5D)">Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography.</a> Commun ACM. 24 (6), 381-395 (1981).</li>
<li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1 (1), 2(2006).</li>
<li>Stepanova, T., Slemmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> J Neurosci. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+Mounting+for+Long-term+Light+Sheet+Microscopy+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).</li>
<li>Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+quantitative+analysis+of+gastrulation+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy+and+3D+tracking+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools.</a> Nat Protoc. 9 (3), 575-585 (2014).</li>
<li>Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+solutions+for+SPIMage+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open-source solutions for SPIMage processing.</a> Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).</li>
<li>Schmied, C., Steinbach, P., Pietzsch, T., Preibisch, S., Tomancak, P. An automated workflow for parallel processing of large multiview SPIM recordings. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://arxiv.org/abs/1507.08575">http://arxiv.org/abs/1507.08575</a> (2015).</li>
<li>Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+processing+and+analysis+of+large-scale+light-sheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1679-1696 (2015).</li>
<li>Schmid, B., Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4, 1-10 (2013).</li>
<li>Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIM-fluid%3A+open+source+light-sheet+based+platform+for+high-throughput+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging.</a> Biomed Opt Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).</li>
<li>McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-top+selective+plane+illumination+microscope+for+conventionally+mounted+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens.</a> Opt Express. 23 (12), 16142-16153 (2015).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Features+of+the+Growth+of+a+Bacterial+Species+Colonizing+the+Zebrafish+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut.</a> mBio. 5 (6), e01751-14-8(2014).</li>
</ol>

开放获取出版费用由 Carl Zeiss Microscopy GmbH 提供。

形态发生是塑造胚胎的过程，与生长和分化共同驱动受精卵发育为成熟的多细胞生物体。动物发育过程中的形态发生事件，最适宜通过完整活体样本的成像来进行分析1-3。这是因为整体胚胎成像能够保留所有驱动和调控发育的组分，包括信号分子的浓度梯度、细胞外基质、脉管系统、神经支配以及周围组织的力学特性。为了弥合形态发生所涉及的多尺度问题，需要在组织整体发育历时数小时至数天的背景下，以分钟级时间分辨率捕捉快速的亚细胞事件。为满足这些要求，已开发出正交平面照明显微镜5的一种现代实现方式4。该技术最初被称为选择性平面照明显微术（Selective Plane Illumination Microscopy, SPIM）4；如今通常使用更具包容性的术语——光片荧光显微术（Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM）。LSFM能够在诱导较低光毒性的前提下实现高时间分辨率成像，相较于激光扫描或转盘共聚焦显微镜更具优势6,7。目前，基于基本光片照明原理的多种实现方式已经出现，并已被用于成像以往难以触及的多种样本和生物学过程8-11。
我们首先希望强调光片荧光显微镜相较于传统共聚焦显微镜的几项关键优势：
为了从活体成像显微实验中获得有意义的结果，必须确保观察过程对样本的影响尽可能小。然而，包括斑马鱼在内的许多生物对激光照射非常敏感，这使得在共聚焦显微镜下以高时间分辨率成像时难以避免光毒性效应，例如发育停滞或延迟6,7。目前，光片荧光显微镜（LSFM）是对样本干扰最小的荧光成像技术7。由于薄层激光光片仅照射在特定时间点被成像的样本区域，光片显微镜能够非常高效地利用光子。因此，低光照暴露使得对更健康样本进行更长时间的延时观察成为可能，e.g.12-17。此外，得益于LSFM极低的侵入性，所获取图像的数量不再受限于样本可耐受的光照剂量，而是取决于可处理和存储的数据量。
与将样本保持在接近生理条件的原则一致，光片荧光显微镜（LSFM）提供了多种适用于活体胚胎的样品固定策略。在LSFM技术中，胚胎通常被包埋于低浓度琼脂糖形成的细柱中。将样品固定在琼脂糖圆柱体内可实现完全自由的旋转，从而能够从最佳角度（在LSFM中称为“视图”）以及多个视图同时观察样本。多视图成像及其后续的多视图融合特别有利于对体积较大、散射强烈的样本进行高分辨率、各向同性的成像。其他可能的LSFM样品固定策略的综述可参见由E. Reynaud实验室撰写的显微镜官方操作手册中的样品制备章节。建议阅读该章节，尤其是当需要成像的样本类型与本文所述不同时。
光片荧光显微镜（LSFM）的图像采集采用基于相机的宽场成像方式，不同于激光扫描共聚焦显微镜。这使得所获取图像具有更高的信噪比（SNR），并且成像速度极快（每秒数十至数百帧）。LSFM的高灵敏度进一步实现了对弱荧光样品的成像，例如以内源水平表达的转录因子18，或在不久的将来利用CRISPR/Cas9技术标记的内源蛋白。高信噪比对于后续成功的图像分析也至关重要。高成像速度不仅用于捕捉快速的细胞内过程，还要求能够足够快速地从多个视角对整个胚胎进行成像。只有在采集来自不同视角的多个z层图像堆栈期间，所观察的现象不发生变化时，才能实现多个视角图像的无缝融合。
光片荧光显微镜（LSFM）的优势通常不会以牺牲图像质量为代价。LSFM的横向分辨率略低于共聚焦显微镜。这是因为LSFM中所用的检测物镜数值孔径较低（通常为1.0或更低），而标准共聚焦系统中水浸或硅油浸物镜的数值孔径为1.2–1.3。此外，由于LSFM采用宽场检测（无针孔），其离焦光信号较共聚焦显微镜更多。离焦光的量取决于光片的厚度。然而，LSFM中更高的信噪比（SNR）弥补了这些缺点。在实际应用中，其成像质量可与转盘共聚焦显微镜的采集效果相当15。因此，该技术能够可靠地提取细胞膜或细胞核等结构特征，e.g.，用于细胞谱系追踪15,19。
除了检测物镜外，光片显微镜（LSFM）的轴向分辨率还由光片厚度决定。在某些情况下，LSFM的轴向分辨率可超过共聚焦显微镜的分辨率。首先，当光片厚度小于检测物镜的轴向分辨率时，分辨率得以提高，这种情况通常出现在使用低倍物镜成像的大尺寸样本中。其次，LSFM实现更高轴向分辨率的另一种方法是多视角融合，即将来自不同视角的高xy平面分辨率信息合并为一个图像堆栈。最终融合的图像堆栈具有接近横向分辨率数值的各向同性分辨率20,21。本文所述的将多个视角相互配准的策略，基于使用嵌入样本周围琼脂糖中的荧光聚苯乙烯微珠作为基准标记物20,21。
由于光片荧光显微镜（LSFM）的商业化，该技术现已广泛应用于广大的科研群体22。因此，撰写本实验方案的目的是使缺乏LSFM实际操作经验的发育生物学研究人员也能便捷地使用这一技术，并帮助他们利用该技术开展针对自身样本的成像研究。本方案采用的是商用光片显微镜，其设计概念简洁，操作简便。此外，我们还想提及一些近期发布的使用自行搭建的LSFM系统对斑马鱼进行成像的实验方案，这些方案可能适用于回答特定的科学问题23-25。另一种进入LSFM领域的选择是开放平台26,27，这些平台遵循开放获取原则，旨在将光片显微镜技术推广至更广泛的科研社区。有关硬件和软件方面的详细文档可参见 http://openspim.org 和 https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/。
在本实验方案中，我们以真骨鱼类斑马鱼作为模型系统，利用光片荧光显微镜（LSFM）研究发育过程。斑马鱼眼睛的形态发生是体现LSFM诸多优势的一个典型例子。此前已有研究利用LSFM分析青鳉28和斑马鱼29,30的眼部发育。在眼部发育的早期阶段，由于卵黄体积较大，胚胎难以以侧卧姿势固定，使眼睛朝向物镜，因此使用传统显微镜进行观察时难以准确定位胚胎。然而，通过将样本嵌入琼脂糖凝胶柱中进行LSFM成像，可实现样本的可重复精确定位。此外，在视泡向视杯阶段转变过程中，眼部会发生显著的形态发生重排，并伴随组织生长，这要求采集大范围的z轴堆栈图像和宽视野成像。在应对这些挑战方面，LSFM优于传统的共聚焦成像。视杯形成过程具有三维特性，仅从单一视角成像难以全面理解与可视化该过程，因此具备各向同性分辨率的多视角成像具有显著优势。视杯形成后，视网膜对激光照射的敏感性逐渐增加，因此LSFM所具有的低光毒性在长时间活体成像中具有重要优势。
本文介绍了一种优化的成像方案，用于对出生后一至三天的斑马鱼胚胎和幼鱼进行成像，重点关注眼部发育过程。我们的方法能够以高空间和时间分辨率记录长达12至14小时的时间序列图像。尤为重要的是，我们还展示了一套数据处理流程，这是光片荧光显微镜（LSFM）中的关键步骤，因为该技术 invariably 会产生大规模数据集，通常达到太字节（terabyte）量级。

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 显微镜</td><td>卡尔·蔡司显微镜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A4018 或 A9414</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（MESAB/MS-222/Tricaine）</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-苯硫脲（PTU）</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm 红色荧光微球 F-Y 050</td><td>默克密理博（Estapor）</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l (1&amp;nbsp;内径为毫米（标有黑色）的毛细管</td><td>品牌</td><td>701904</td><td>作为 Transferpettor 的备用部件出售</td></tr><tr><td>20 微升移液器用聚四氟乙烯尖端活塞&amp;nbsp;&amp;mu;毛细血管</td><td>品牌</td><td>701932</td><td>作为 Transferpettor 的备用部件出售</td></tr><tr><td>直径18 mm的圆形玻璃盖玻片，厚度0.17&amp;nbsp;毫米</td><td>赛默飞世尔科技（Menzel-Glaser）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于成像室窗口的O型圈 17&amp;times;1.5 mm</td><td>卡尔蔡司显微镜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子，55 型</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 鲁尔锁型注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>适用于鲁尔锁式注射器的150厘米输液延长管</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;链接&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>链接 1 多视角重建应用</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&lt;/a&gt;&lt;br /&gt;&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&quot;&gt;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>链接 2 大数据查看器</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>链接 3 大数据查看器</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataViewer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataViewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>链接 4 多视角重建应用-问题</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>链接 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>链接 6 大数据服务器</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataServer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataServer&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

利用光片荧光显微镜成像斑马鱼眼睛发育过程

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

光片荧光显微镜（LSFM）作为一种成像胚胎发育的方法，正变得越来越受欢迎。与共聚焦系统相比，LSFM 的主要优势在于其光毒性低、样品固定方式温和、成像速度快且信噪比高，并能够长时间从多个角度（视图）对样品进行成像。多视角成像可充分发挥 LSFM 的潜力，但同时也会产生高达数太字节（terabyte）规模的数据集。处理此类数据集是使用 LSFM 所面临的最大挑战。在本方案中，我们概述了解决这一问题的一些方法。直到最近，LSFM 主要由具备自行构建和操作光片显微镜技术能力的实验室开展。然而，在过去三年中，多种商用 LSFM 系统相继问世，这些系统用途广泛，任何发育生物学家均可轻松使用。本文主要面向那些并非 LSFM 技术开发者、但希望将 LSFM 作为一种工具来回答特定发育生物学问题的研究人员。
本文以斑马鱼眼睛发育的成像为例，向读者介绍光片荧光显微镜（LSFM）技术，并展示LSFM在多个空间和时间尺度上的应用。文章描述了一个完整的实验方案，从斑马鱼胚胎在LSFM中的固定开始。随后，我们概述了使用市售光片显微镜进行成像的多种选项。尤为重要的是，我们还介绍了一种基于开源方案的后续多视角数据配准与融合流程，该方案以Fiji插件的形式实现。尽管本实验方案主要聚焦于发育中斑马鱼眼睛的成像以及特定成像系统的数据处理，但其中提供的大部分技术要点和故障排除建议具有普遍适用性，该方案亦可适用于多种光片显微镜实验。

光片显微镜（LSFM）是跨尺度成像发育过程的理想方法。本文汇总了多个应用实例，展示了对细胞内结构、细胞以及完整组织的短期和长期成像。这些示例还表明，LSFM 在眼发育的各个阶段均是一种有效的工具，从视杯形成到视网膜中的神经发生均可应用。视频 1 演示了 LSFM 的通用方法，首先在明场下显示嵌入琼脂糖圆柱中的完整胚胎的缩略视图，随后在荧光通道中展示视网膜的详细图像。
<img alt="视频 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> 
视频 1：斑马鱼视网膜的光片荧光显微成像（LSFM）。 为说明LSFM技术，本视频首先展示明场图像，显示胚胎完整地包裹在琼脂糖圆柱内进行成像，随后切换至荧光成像。接着可见大视野使整个视网膜的观察成为可能。随后，视频放大展示视网膜的一个小区域，以突出其良好的亚细胞分辨率。成像所用样本为Ath5:gap-GFP37转基因斑马鱼胚胎，该转基因可标记视网膜中的多种神经元（主要为神经节细胞和光感受器前体细胞）。视频的荧光部分采用双侧照明，使用40X/1.0水镜物镜，以5分钟间隔进行单视角采集。图中显示的是厚度为30 µm的体积数据的最大强度投影。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
视频 2 展示了如何以高分辨率快速捕捉细胞内事件；在此例中为视网膜神经前体细胞中微管在其正端的生长过程。该视频所包含的信息可用于追踪和量化微管正端的生长。
<img alt="视频 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> 
视频 2：单个细胞中的微管动态。 本视频记录了由端部标记蛋白 EB3-GFP38 标记的微管生长正端的动态过程。该蛋白在单个视网膜前体细胞中表达。微管主要沿从顶端到基底端（从上到下）的方向生长。EB3 星号的平均移动速度为 0.28 ± 0.05 µm/sec。位于细胞顶侧、表现出高微管成核活性的亮点为中心体。野生型胚胎被注射了 hsp70:EB3-GFP 质粒 DNA。该视频在受精后约 28 小时（hpf）进行热激处理（37 °C 下持续 15 分钟）4 小时后，使用 63X/1.0 W 物镜、单侧照明、1 秒时间间隔进行单视野记录获得。该单个细胞是从覆盖大部分视网膜区域的视野中裁剪而来。图示为两层切片的最大强度投影。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
图3 显示了如何在数小时内持续追踪细胞内结构。此处捕捉到了迁移中的视网膜神经节细胞（RGCs）内的中心体。
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> 
图3：视网膜神经节细胞迁移过程中中心体的定位。 该延时实验的图像序列展示了中心体在整个视网膜神经节细胞（RGC）成熟过程中的位置变化。在神经前体细胞中，中心体位于顶端突起的最顶端（1:00）。细胞分裂期间，两个中心体作为有丝分裂纺锤体的两极（2:25）。此次分裂产生两个子细胞：其中一个分化为RGC，另一个则成为光感受器前体细胞。分裂后，RGC的胞体向视网膜的基底侧迁移，而其顶端突起仍附着在顶端侧。当RGC到达基底侧后，其顶端突起脱离，中心体随之移动（6:15）。可观察到中心体随顶端突起逐渐回缩的过程（6:50, 7:20, 8:10）。在最后一帧（8:55）中，神经节细胞从其基底侧开始生长轴突，而中心体仍位于顶端侧。本实验通过在野生型胚胎单细胞期注射质粒DNA实现嵌合表达。细胞通过 Ath5:GFP-caax（绿色）构建体进行标记，该构建体可标记RGC及其他神经元。中心体（箭头）通过表达 Centrin-tdTomato29（品红色）进行标记。图像中视网膜的顶端位于上方，基底侧位于下方。图示为30 µm厚体积的荧光最大强度投影。图像裁剪自覆盖整个视网膜的动态影像。影像记录始于受精后约34小时（hpf）。使用40X/1.0 W物镜，每5分钟采集一次z轴层扫图像。时间以hh:mm表示。比例尺为10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在图4中展示了如何从捕获整个组织的数据（如视频1所示）中提取单个细胞的行为。视网膜神经节细胞（RGC）的迁移可以轻松追踪，并可连续观察其顶端和基底突起的动态变化。
<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> 
图4：单个视网膜神经节细胞的移位过程。 如图3所述，视网膜神经节细胞（RGC）在完成终末有丝分裂后，从视网膜的顶端向基底侧移位。该RGC通过Ath5:gap-GFP37转基因的表达进行标记。图中显示的是30 µm厚体积的最强信号投影图像。图像截取自覆盖整个视网膜的延时成像视频，视频起始于约34 hpf。使用40X/1.0 W物镜每5分钟采集一次z轴层扫图像。时间以hh:mm格式表示。比例尺代表5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图5 展示了多视角光片荧光显微镜（multiview LSFM）在视杯形态发生过程中以细胞分辨率捕捉组织尺度形态发生过程的能力，该过程涉及视泡转变为视杯。通过多视角成像可显著提高图像质量，最终图像由5个不同视角（本例中）的信息融合而成，形成一个具有各向同性分辨率的z轴堆栈。该图展示了加权平均融合后图像质量的提升，以及进一步经多视角去卷积后图像对比度和分辨率的提高。图中显示了穿过数据集的两个不同方向的光学切片。此外，来自去卷积后数据集的拼接图像展示了随时间推移的视杯形态发生过程。所有时间点均在视频3中展示。

<img alt="图5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> 
图5：单视角与两种多视角融合方法在图像质量上的比较。 (A单个侧视角度的单层光学切片数据展示，以及（B）背侧视图。条纹伪影以及样品深层信号的衰减明显可见。此外，在融合数据（C-F）中可见的部分图像在此特定视图中未被采集到。C) 同一光学切片，现以多视角融合数据形式从侧面显示，并（D）背侧视图。请注意，条纹伪影已被抑制，样品深层的结构得到更清晰的分辨。E) 相同的光学切片现在以多视角去卷积数据的形式从侧面视角显示，并且（F）背侧视图。注意对比度和分辨率的提高，使得单个细胞膜和细胞核能够清晰分辨。即使在样品更深层，分辨率也未出现明显下降。该数据集采用双侧照明，从约相隔20度的5个角度采集z层扫描图像，共约 100 &#181;m 与 1.5 &#181;m 步长在每次成像时以10分钟间隔持续采集10小时，使用20X/1.0 W物镜。用于多视角融合与去卷积的输入图像被下采样2倍&#215; 以加快图像处理速度。运行了15次多视角去卷积迭代。G) 该拼接图像展示了去卷积数据背侧视图的裁剪区域，以突出显示从视泡到视杯阶段早期眼发育过程中的形态发生事件。视泡的两层最初为相似的柱状上皮，随后分化为不同的细胞群体：靠近表皮的远端层发育为视网膜神经上皮（RN），靠近神经管的近端层则发育为视网膜色素上皮（RP）。RN中的细胞伸长并内陷，形成视杯（1:40至5:00）；与此同时，RP细胞变扁平。表面外胚层被诱导形成晶状体（1:40），随后发生内陷（5:00）。该视频始于17 hpf。时间以hh:mm表示。所有细胞膜均被标记 &#946;-actin:ras-GFP 转基因标记所有细胞，而 hsp70:H2B-RFP 转基因标记所有细胞核。比例尺表示 30 &#181;mFB 前脑，LE 晶状体，OP 嗅板，RN 视网膜神经上皮，RP 视网膜色素上皮。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="视频 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> 
视频 3：以单视图及两种多视图融合方法展示的视杯形态发生过程。该延时视频展示了从视泡到视杯阶段完整的视杯形态发生过程。视频上方为侧视方向的单个光学切片，下方为背侧视图的单个光学切片。发育中的视泡细胞经历复杂的重排，最终形成具有内层视网膜神经上皮和外层视网膜色素上皮的半球形视杯结构。晶状体由表面外胚层形成，并随神经上皮内陷，位于视杯内部。所有细胞膜通过表达β-actin:ras-GFP（绿色）转基因进行标记，细胞核则用hsp70:H2B-RFP（品红色）标记。视频起始于约17小时后受精（hpf）。数据集采用双侧照明，从五个相隔约20度的视角采集，使用20倍/1.0水镜每10分钟获取一次约100 µm的z轴堆栈图像。时间以小时:分钟（hh:mm）显示。比例尺代表50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

光片荧光显微镜是成像胚胎发育的优秀工具，能够在接近生理条件下对活体胚胎进行长时间的延时成像。我们展示了其在跨越广泛时空尺度下斑马鱼眼部发育成像中的应用，并提供了一套多视角数据集融合与去卷积的处理流程。

光片荧光显微镜（LSFM）作为一种成像胚胎发育的方法，正变得越来越受欢迎。LSFM 的主要优势在于……

本实验方案的总体目标是在光片显微镜中对斑马鱼胚胎的眼部发育进行成像，并通过Figi中的多视角重建应用程序插件处理所获得的多视角数据集。该方法可帮助您理解动物发育过程中的形态发生事件。该方法的主要优势在于，您可以在完整发育中的胚胎中以高空间和时间分辨率观察形态发生事件。光片显微镜的主要优势在于该方法的光毒性较低，能够快速采集样本图像，并且可以从多个角度（即所谓的“视图”）对样本进行成像。从不同视角采集样本图像有助于我们克服信号衰减以及特定轴向上的成像限制。这些不同的图像随后可利用分布在样本周围的荧光微球进行整合与配准。我们可以重建达到各向同性分辨率的三维体积。尽管我们以斑马鱼眼睛发育为例展示了光片荧光显微镜的使用，但该方法也可用于利用多种模式生物回答发育生物学和神经科学中的各种问题。首先，在保持照明物镜被遮盖的同时，将检测物镜旋入显微镜中。然后，取下物镜的保护帽，小心地将样品室推入显微镜中。通过拧紧螺丝固定样品室。接着，将温度探头和帕尔贴模块连接到显微镜上。用于珀尔帖模块冷却液循环的两根管路与两种连接器均兼容，且可在任意方向上工作。接下来，使用注射器通过注射器将溶液注入腔室，直至液面达到腔室窗口的上边缘，然后检查是否存在泄漏。现在，打开显微镜、计算机和培养箱。启动显微镜操作软件，并将培养温度设置为 28.5 摄氏度。在温度平衡约一小时的同时，准备样品。首先配制琼脂糖。将1毫升1%低熔点琼脂糖在E3培养基中于70摄氏度下融化。约15分钟后，将600微升熔化的琼脂糖转移至一个新的1.5毫升离心管中，加入250微升E3培养基、50微升0.4% MS 222和25微升涡旋荧光微球储备液。将离心管置于约39摄氏度的加热金属块中，使琼脂糖接近凝胶化温度。接下来，将带有聚四氟乙烯（Teflon）尖端的推杆推至内径为1毫米的玻璃毛细管底部。准备五根这样的毛细管。随后，短暂涡旋混匀琼脂糖混合物，然后将五个胚胎连同最少体积的液体转移至其中。然后插入毛细管，以头部朝前的方式吸取一个胚胎。必须确保头部先于尾部进入，且不能有气泡。吸入足够的溶液，使胚胎上方约有两厘米的琼脂糖，下方约有一厘米的琼脂糖。在继续操作前，将一个胚胎吸入每根毛细管中。此步骤需要一定练习才能掌握，建议使用非珍贵胚胎进行前期准备。当琼脂糖完全凝固后，用塑料泥将毛细管底部开口浸入溶液中，并将其固定在烧杯壁上，然后将样品置于 E three 培养基中保存。现在组装样品架。首先，将两个尺寸合适的塑料套管相对插入茎部。袖筒上的狭缝必须朝外。接着，安装夹紧螺钉，并将毛细管插入支架，直至另一侧可见黑色色带。避免触碰柱塞。然后拧紧夹具螺丝。接着，从毛细管中推出约一厘米的琼脂糖并将其切掉。然后将样品杆插入样品台圆盘中。在装入样品盘之前，请检查控制软件中样品台是否处于最高位置。接着，利用导轨将样品杆和样品平稳地推入显微镜内。现在，按照文本方案中所述对选定的样品进行成像。数据处理在 Figi 中完成，它是 ImageJ 的一个发行版本。开始之前，应更新 Figi。将获取的图像数据集保存到一个单独的文件夹中。图像处理的中间文件将保存到同一文件夹中。现在，启动多视角重建应用程序。然后，定义一个新的数据集。选择选项 Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats，并为输出数据文件创建一个名称。然后选择数据集的第一个 CZI 文件，元数据将自动加载。在图像元数据中，仔细核对角度数量、通道数量、照明方式以及体素尺寸是否均已正确设置。单击“确定”后，将打开一个日志窗口、一个视图设置资源管理器窗口和一个控制台窗口。视图设置资源管理器提供了用户友好的界面。选择需要处理的文件，然后单击鼠标右键。一个新窗口将打开，显示各个处理步骤的执行过程。窗口右上角为信息和保存按钮。信息按钮可显示已保存数据文件内容的摘要，点击保存按钮将保存处理结果。否则，程序不会保存处理步骤的结果。要重新保存整个数据集，首先按 Ctrl+A 并使用右键单击来选择所有文件，然后选择“重新保存数据集”并选择“另存为 HDF5”。必须勾选确认重新保存操作。几分钟后，程序将针对每个时间点提示重新保存已完成。随后，继续进行数据中兴趣点的检测。按住 Ctrl+A 并单击右键，选择所有时间点。选择并检测兴趣点。在选项中选择高斯差分（difference-of-gaussian）。并在分割前选择并降低样本图像的分辨率。在下一个窗口中，选择检测设置。在亚像素定位选项中，选择三维二次拟合。然后，在兴趣点设置中选择“交互式”。对于XY方向的下采样选项，选择“匹配Z轴分辨率”；对于Z轴下采样，选择1倍。然后，通过选择“在 CPU 上运行 Java”选项来执行操作。在弹出的窗口中，选择一个视图以测试参数。视图加载完成后，按键盘上的 Ctrl+Shift+C 调整亮度和对比度。此外，对于珠子检测，请切换“查找最大值”绿色选项。现在观察检测结果周围以绿色环显示的分割情况。调整高斯差分的 sigma 1 和阈值参数，以实现对珠子的最佳分割，并使假阳性数量最少。每个微珠只能被检测一次。确定最佳参数后，点击“完成”。计算机加载后，程序会针对每个时间点的各个视野分别分割微珠，并输出一个日志文件，记录每个视野中检测到的微珠数量。每个视野中应有 600 至数千个微珠。否则，需要调整检测参数。此过程较为复杂。检测金字塔首次尝试时很少能准确，且在一部影片的不同时间点之间重置次数可能有所不同。适当放宽阈值可检测到所有真实微珠，尽管可能会增加一些假阳性结果，但有助于提高检测效果。如果金字塔参数的任何组合均无效，则必须使用不同的荧光微珠重新获取一组新的数据。现在开始对检测结果进行配准，并从图像序列中生成多视角去卷积图像。光片荧光显微镜（LSFM）是一种理想的成像方法，可用于长时间观察从细胞间结构、单个细胞到整个组织等多个尺度的发育过程。一些非常快速的细胞间事件也可以高分辨率地被捕获，例如神经前体细胞中微管的生长。通过单视角动态影像，可以对微管的生长进行定量分析。细胞内结构可被长时间追踪，例如视网膜神经节细胞中的中心体。可以从整个组织图像中提取单个细胞的行为信息，例如神经节细胞在视网膜上的迁移过程。多视角反卷积通过结合多个不同视角并利用点扩散函数，生成一个各向同性的Z轴图像序列。与单视角图像或加权平均融合相比，该方法可显著提升成像质量。例如，可通过本数据集在不同方向上的光学切片，研究视泡转变为视杯的过程。此外，整体良好的成像质量显而易见，即使在胚胎深层区域也是如此，例如观察视杯形态发生过程时。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在光片显微镜中制备并固定斑马鱼胚胎样本进行成像。以及如何在 Figi 中处理多视角数据集。一旦掌握，启动光片显微镜上的延时成像实验大约需要两小时。后续的数据分析则需要更长的时间。对于该任务，使用计算机集群可能会更有利。更多实用技巧、故障排除建议以及其他资源链接可在文字版实验方案中找到。实验前必须具备足够的存储容量，并提前制定清晰的数据处理流程计划。如果您遇到任何问题、疑问或有未来的需求，请参阅相应功能的官方网站，或在相应的 GitHub 仓库中提交问题。

using-light-sheet-fluorescence-microscopy-to-image-zebrafish-eye

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

采用轻质板材荧光显微镜到图像斑马鱼眼睛发育

本文介绍了光片荧光显微镜的样品制备方法，并演示了一种用于长期成像的活体斑马鱼胚胎安装技术，该方法可在接近生理条件下对活体胚胎进行长时间延时摄影记录。...

光片显微镜样品制备：活体斑马鱼胚胎的长期成像固定方法

当胚胎被包埋在低浓度琼脂糖的光学透明聚合物管中时，可通过光片显微镜在数天内连续观察斑马鱼的发育过程。...

斑马鱼长期光片显微镜成像的多层封片技术

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

本文介绍了一种在斑马鱼中以四维（4-D）方式可视化心脏发育的实验方案。通过光片荧光显微镜（LSFM）进行的4-D成像，可在时间序列上获取三维（3-D）图像，从而重建发育中心脏的动态过程。我们通过定性和定量分析表明，剪切应力在心腔发育过程中可激活心内膜的Notch信号通路，进而促进心脏小梁化。...

利用光片荧光显微镜捕捉调控剪切应力对斑马鱼心脏发育影响的四维图像

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

此处，一种 方案是 提供 使用市售的光片显微镜和图像处理工作站对眼球形态发生过程进行延时成像，并分析所得数据。本方案详细描述了胚胎麻醉、包埋于低熔点琼脂糖、在成像腔室中悬浮、设置成像参数，以及最终利用图像分析软件对成像数据进行分析的操作步骤。...

利用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜观察眼部形态发生过程

我们介绍了用于研究斑马鱼心脏的优化工具 体内...

斑马鱼胚胎中心脏快速动态的光片显微成像

本方案利用光片成像技术研究斑马鱼幼虫的心脏收缩功能，并通过细胞追踪和交互式分析深入了解心脏力学特性。...

4D光片成像技术观察斑马鱼心脏收缩

本文描述了一种在完整卵膜内利用光片显微镜对早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。该方法分析了胚胎在原肠胚形成70%期和胚芽期时于卵膜内所采取的不同方位，并详细阐述了如何利用光片显微系统在整个胚胎范围内获得细胞尺度分辨率的成像策略。...

早期斑马鱼胚胎的光片显微成像与样品制备策略

细胞和组织中的蛋白质水平通常由蛋白质的生成与清除之间的平衡进行严格调控。利用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术，可对蛋白质的清除动力学进行实验测定 体内.

利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

学习使用光片荧光显微镜对斑马鱼胚胎进行高分辨率实时成像，观察眼部发育的形态发生事件。该方法具有低光毒性、快速采集和多角度成像的优势，可三维重建发育过程。

利用光片荧光显微镜成像斑马鱼眼睛发育过程

探索更多视频