采用轻质板材荧光显微镜到图像斑马鱼眼睛发育
2016年4月10日
光片荧光显微镜是胚胎发育成像的出色工具。它允许在接近生理条件下录制活胚胎的长延时电影。我们演示了它在宽时空尺度上对斑马鱼眼睛发育进行成像的应用，并提出了一个用于多视图数据集融合和反卷积的管道。
该实验方案的总体目标是在光片显微镜中对斑马鱼胚胎的眼睛发育进行成像，并通过多视图重建应用程序插件在 Figi 中处理获取的多视图数据集。这种方法可以帮助您了解动物发育中的形态发生事件。这种方法的主要优点是您可以以高空间和时间分辨率观察 tact 胚胎发育中的形态发生事件。
光片显微镜的主要优点是该方法的低光毒性、快速采集时间，您可以对样品进行成像，并且可以从各个角度（即所谓的视图）对样品进行成像。从不同的视图捕获样本可以克服信号和设定轴的劣化。然后可以使用样品周围的荧光微球来使用和记录这些不同的图像。
我们可以重建达到各向同性分辨率的三维体积。尽管我们展示了使用光片荧光显微镜进行斑马鱼眼睛发育，但这种方法也可用于使用各种模式生物回答发育生物学和神经科学中的各种问题。首先，将检测物镜拧入显微镜中，同时保持照明物镜被覆盖。
然后，拉开物镜的盖子，小心地将样品室滑入显微镜。拧紧螺丝以固定腔室。然后，将温度探头和 Peltier 模块连接到显微镜。
为 Peltier 模块循环冷却液的两根管子与两个连接器兼容，并且可以在任一方向工作。接下来，使用注射器将装有溶液的注射器将腔室加载到腔室窗口的上边缘，并检查是否有泄漏。现在，打开显微镜、计算机和孵育。
启动显微镜作软件，将孵育温度设置为 28.5 摄氏度。当温度需要一小时时，准备样品。首先准备琼脂糖。
在 70 摄氏度下将制备的 1 毫升等分试样的 1% 低熔点琼脂糖溶于 E 三种培养基中。约 15 分钟后，将 600 μL 熔融琼脂糖转移到新鲜的 1.5 mL试管中，并加入 250 μL E 3 培养基、50 μL 0.4% MS 222 和 25 μL 涡旋荧光珠储备液。将试管放入约 39 摄氏度的加热块中，让琼脂糖接近其胶凝点。
接下来，将特氟龙尖端柱塞向下推至 1 毫米内径玻璃毛细管的底部。准备其中的五个。现在，短暂涡旋琼脂糖混合物，然后将 5 个胚胎用最少量的液体转移到其中。
然后，插入毛细管并先吸出一个胚胎头。头部必须在尾部之前进入，并且不能有任何气泡。吸取足够的溶液，使胚胎上方有大约 2 厘米的琼脂糖，其下方有 1 厘米的琼脂糖。
在继续之前，将一个胚胎吸入每个毛细管中。此步骤需要一些练习才能掌握。使用无价值的胚胎为它做好准备。
当琼脂糖完全凝固后，将毛细管支撑到装有橡皮泥的烧杯壁上，将样品储存在 E 3 培养基中，底部开口在溶液中。现在组装样品架。首先，将两个尺寸合适的塑料套管彼此相对插入茎中。
袖子上的开衩必须朝外。接下来，连接一个 clamp 螺钉。并将毛细管插入支架，直到黑色条带在另一侧可见。
避免触摸柱塞。然后拧紧夹紧螺钉。接下来，从毛细管中推出一厘米的琼脂糖并将其修剪掉。
然后将杆插入样品架盘中。在加载样品盘之前，请检查载物台是否位于控制软件的最上部位置。然后，使用导轨将支架和样品向下滑动到显微镜中。
现在，按照文本协议中的说明对所选样品进行成像。数据处理在 Figi 中完成。它是 ImageJ 的发行版。
在开始之前，应该更新 Figi。将获取的图像数据集保存到单个文件夹中。图像处理的中间文件将保存到同一文件夹中。
现在，启动多视图重建应用程序。然后，定义新数据集。选择选项 Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats 并为输出数据文件创建名称。
然后选择数据集的第一个 CZI 文件。元数据将自动加载。在图像元数据中，仔细检查角度数、通道数、照明度和体素大小是否都设置正确。
按下 OK 后，将打开一个日志窗口、视图设置资源管理器窗口和一个控制台窗口。视图设置资源管理器提供了一个用户友好的界面。选择需要处理的文件，然后按鼠标右键。
将打开一个新窗口，显示执行时的不同处理步骤。右上角是 info 和 save 按钮。Info 显示已保存数据文件内容的摘要，按 Save 将保存处理结果。
否则，程序不会保存处理步骤的结果。要重新保存整个数据集，首先，按 Ctrl+A 并右键单击选择所有文件。然后选择 Resave Dataset 和 As HDF5。
然后，必须选中 resave作的确认。几分钟后，对于每个时间点，程序将指示重新保存何时完成。然后，继续检测数据中的兴趣点。
按 Ctrl+A 并右键单击选择所有时间点。要选择、检测兴趣点。从选项中，选择 difference-of-gaussian。
并选择，在分割之前向下采样图像。在下一个窗口中，选择检测设置。从子像素定位选项中，选择 3-dimensional quadratic fit。
然后，在 interest point specification（兴趣点规范）中，选择 interactive（交互式）。对于向下采样 XY 选项，选择 Match Z resolution（匹配 Z 分辨率）。对于向下采样 Z，选择 1x。
然后，通过选择 compute on CPU Java 选项来执行作。在弹出窗口中，选择一个视图来测试参数。视图加载后，按键盘上的 Ctrl+Shift+C 调整亮度和对比度。
此外，对于磁珠检测，请切换 Look for maxima green （寻找最大值绿色） 选项。现在，观察检测周围的 Segmentation 为绿色环。调整 sigma 1 和阈值参数的高斯差值，以最佳方式分割假阳性数量最少的微珠。
每个微珠只能检测一次。确定最佳参数后，按 done。在计算机加载时间点的每个单独视图并对微珠进行分割后，程序会输出一个日志文件，其中包含每个视图检测到的微珠数量。
每个视图应该有 600 到几千个珠子。否则，需要调整检测参数。这是一个棘手的过程。
第一次尝试时，检测金字塔很少准确，并且重置可能会因一部电影的时间点而异。放松新鲜会检测到所有真正的珠子并允许更多的假阳性会有所帮助。如果金字塔的组合都不起作用，则必须使用不同荧光珠获取新的数据集。
现在继续注册检测并从堆栈进行多视图反卷积。LSFM 是一种理想的方法，可在从细胞间结构到细胞和整个组织的多个尺度上对发育过程进行长时间成像。可以高分辨率捕获非常快速的细胞间事件，例如神经祖细胞中微管的生长。
从单视图电影中，可以量化微管生长。细胞内结构可以持续数小时进行跟踪，例如视网膜神经节细胞内的中心体。可以从整个组织图像中提取单细胞行为，例如神经节细胞在视网膜上的跨位。
Multi view deconvolution 通过使用 point spread 函数组合多个不同的视图来创建一个各向同性 Z 堆栈。与单个视图或加权平均融合相比，这提供了大大改进的图像。例如，可以通过所示数据集从不同方向的光学切片中研究视泡向视杯的转变。
此外，整体良好的图像质量，即使是在胚胎内部也是显而易见的。例如在观察视杯形态发生时。观看此视频后，您应该对如何在光片显微镜中安装斑马鱼胚胎图像有很好的了解。
以及如何在 Figi 中处理多视图数据集。掌握后，大约需要两个小时才能在光片显微镜上开始延时实验。后续数据分析将花费更多时间。
使用计算机集群执行该任务可能会有所帮助。更多实用技巧、故障排除建议和其他资源的链接可以在文本协议中找到。在实验之前，必须有足够的存储容量和清晰的数据处理管道计划。
如果您有任何问题、疑问或未来的请求，请参阅相应的功能网站或在相应的 github 存储库上提交问题。
概述
本文介绍了一种使用光片荧光显微镜成像斑马鱼眼睛发育的协议。该方法允许对活体胚胎进行高分辨率成像，使研究人员能够实时观察形态发生事件。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
背景
- 光片荧光显微镜提供低光毒性和快速的采集时间。
- 该技术能够从多个角度成像以提高数据质量。
- 它适用于斑马鱼以外的各种模式生物。
研究目的
- 可视化并分析斑马鱼胚胎的眼睛发育。
- 展示处理多视图数据集的流程。
- 促进对胚胎发育过程的理解。
使用的方法
- 在琼脂中制备斑马鱼胚胎以进行成像。
- 使用光片显微镜捕捉图像。
- 使用Figi和多视图重建应用程序处理数据。
- 使用荧光微球对图像进行配准。
主要结果
- 成功以高空间和时间分辨率成像斑马鱼眼睛发育。
- 从多视图数据集重建三维体积。
- 展示该方法对各种发育生物学问题的通用性。
结论
- 光片显微镜是研究胚胎发育的强大工具。
- 该协议可以适用于不同的模式生物和研究问题。
- 该方法增强了我们对活体胚胎中形态发生事件的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Light sheet fluorescence microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of live zebrafish embryos, supporting real-time observation of morphogenetic events in developmental biology. This capability enhances target validation by providing quantitative, multi-scale phenotypic data from intact organisms, reducing reliance on endpoint assays. The method supports mechanistic de-risking in early discovery by allowing longitudinal tracking of cellular behaviors and tissue dynamics relevant to disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of morphogenetic processes in developing tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genetic or pharmacological perturbations to phenotypic outcomes in vivo.
- Predictive Value: Improves confidence in target relevance by capturing dynamic, spatially resolved biological responses over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multi-view datasets suitable for high-content analysis of developmental phenotypes.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible imaging workflows using commercial light sheet microscopes and open-source processing pipelines.
- Scalability: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening and target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides disease-relevant system insights by imaging conserved developmental pathways across model organisms.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of intracellular structures and cell behaviors over extended periods, supporting preclinical validation of target modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by enabling longitudinal assessment of therapeutic effects on tissue morphogenesis and cellular dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic screening in vertebrate models, with outputs feeding into lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking through high-resolution, time-lapse imaging of developing tissues.
- Screening: Enables assay readiness via standardized embryo mounting, multi-view acquisition, and reproducible data processing using Fiji-based plugins.
- Analytics: Generates quantitative 3D reconstructions and isotropic voxel data that facilitate comparison of structural and dynamic phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by imaging conserved processes such as optic cup formation and retinal ganglion cell migration relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging platform adaptable to diverse developmental biology and neuroscience questions beyond zebrafish eye development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in developmental phenotypes through direct visualization.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via defined mounting, imaging, and multiview registration protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of phenotypic liabilities, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing longitudinal, quantitative readouts on target modulation in intact developing systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, agarose embedding, and fluorescent sample preparation.
- Dependent on access to commercial light sheet microscopes and computational resources for terabyte-scale multiview data processing.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters, file naming, and metadata handling for reproducible multi-view reconstruction.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to other model organisms or tissue types due to variations in size, opacity, and developmental timing.
- Limited by storage and processing demands; requires advance planning for data management and pipeline scalability.
