蛋白质降解的放线菌酮大通分析酿酒酵母

蛋白质丰度反映了蛋白质合成和蛋白质降解的速率。本文描述了使用放线菌酮追踪后进行蛋白质印迹来分析模型单细胞真核生物酿酒酵母（出芽酵母）中的蛋白质降解。

该程序的总体目标是可视化酿酒酵母中特定蛋白质的稳态种群的降解。该方法可用于确定目标蛋白质降解的遗传要求和环境影响。该技术的主要优点是不需要放射性同位素和漫长的免疫沉淀步骤，这与脉冲追踪技术不同，脉冲追踪技术也用于可视化蛋白质降解。

该程序可用于分析内源性酵母蛋白或质粒表达的蛋白质。对于后者，按照标准酵母转化方案，用编码目标蛋白质的质粒转化酵母菌株。将酵母接种在 5 毫升适当的培养基中。

在 30 摄氏度下旋转孵育过夜。第二天早上，测量每次过夜培养物的 600 纳米光密度或 OD 600 。在 15 毫升新鲜培养基中将培养物稀释至 OD 600 为 0.2。

在 30 摄氏度下摇动孵育，直到细胞达到对数生长期中期。当酵母细胞生长时，准备放线菌酮追踪程序。将可容纳 15 毫升锥形管的加热块设置为 30 摄氏度，以便在放线菌酮存在下孵育细胞。

为确保热量有效地分布到培养物中，向加热块的每个孔中加水，以便 15 毫升锥形管使水位上升到孔口，但不会溢出。将可容纳 1.5 mL 微量离心管的第二个加热块设置为 95 摄氏度，以便在细胞裂解后进行蛋白质变性。将新鲜生长培养基预热至 30 摄氏度。

每个待分析的培养物每个时间点需要 1.1 mL 培养基。将 50 μL 20x Stop Mix 添加到预先标记的微量离心管中。每个待测定的培养物的每个时间点准备一管。

将试管放在冰上。当酵母细胞达到中等对数生长时，每个时间点收集 2.5 OD 600 单位的每种培养物进行检测。1 个 OD600 单位等于 OD600 为 1.0 时 1 毫升培养物中存在的酵母量。

室温下以 3， 000 倍 g 的离心力将收集的细胞放入 15 mL 锥形管中离心 2 分钟。去除上清液。将每个细胞沉淀重悬于每 2.5 OD600 单位细胞中 1 毫升 30 摄氏度新鲜生长培养基中。

在开始放线菌酮追踪之前，通过在 30 摄氏度的加热块中孵育 5 分钟来平衡酵母细胞悬液。该程序最困难的方面是每个样品的放线菌酮添加和细胞收集的时间。我们通过建立并遵守添加放线菌酮和细胞收集的时间表来确保成功。

要开始放线菌酰亚胺追踪，请按计时器上的"开始"。迅速但小心地将放线菌酮加入到第一种酵母细胞悬液中，使其终浓度为 250 μg/mL，并短暂涡旋混合。立即将 950 μL 或约 2.4 OD600 单位的酵母细胞悬液和添加的放线菌酮转移到含有 50 μL 冰冷的 20x Stop Mix 的预标记微量离心管中。

涡旋微量离心管并置于冰上，直至收集完所有样品。如每个剩余酵母细胞悬液所示，以固定的时间间隔开始放线菌酮追踪。在随后的每个时间点，涡旋酵母细胞悬液，并将 950 μL 转移至含有 50 μL 预冷 20x Stop Mix 的标记微量离心管中。

涡旋并将收集的细胞置于冰上。为防止酵母细胞沉降，在整个追踪过程中，大约每 5 分钟将细胞悬液涡旋在 15 毫升锥形管中。收集完所有样品后，通过在 6， 500 x g 和室温下离心 30 秒来沉淀收集的细胞。

通过移液或抽吸去除上清液。细胞现在已准备好进行碱性裂解。通过向每个细胞沉淀中加入 100 微升蒸馏水来准备用于碱性裂解的细胞，并通过上下吹打重新悬浮。

向每个样品中加入 100 微升 0.2 摩尔氢氧化钠。涡旋混合。将细胞在室温下孵育 5 分钟。

在这个阶段，酵母细胞还没有被裂解，蛋白质也没有被释放。接下来，通过在室温下以 18， 000 x g 离心 30 秒来沉淀细胞。通过移液或抽吸去除上清液。

要裂解细胞，请向每个细胞沉淀中加入 100 μL Laemmli 样品缓冲液。通过上下移液重新悬浮。在 95 摄氏度下孵育 5 分钟，使蛋白质完全变性。

将裂解物在 18， 000 x g 和室温下离心 1 分钟，以沉淀不溶性物质。上清液是溶解的提取蛋白，可通过 SDS PAGE 和随后的 Western blot 分析进行分离。或者，裂解物可以在零下 20 摄氏度下储存。

采用放线菌酮追踪法分析模型酵母内质网相关降解底物 Deg1-Sec62 的稳定性。Deg1-Sec62 蛋白在 SDS PAGE 上以多个物种的形式迁移，并且在野生型细胞中很容易降解。Pgk1 是一种上样对照，其丰度在测定的条件下不变化。

ER 驻留泛素连接酶 hrd1 或泛素结合酶 ubc7 的缺失在很大程度上稳定了 Deg1-Sec62 蛋白，这证实了先前观察到的这些蛋白在 Deg1-Sec62 降解中的作用。Cue1 是一种跨膜蛋白，可将 ubc7 锚定到 ER 膜上并激活酶，但尚未直接研究 Deg1-Sec62 降解中对 cue1 的要求。本研究观察到 Deg1-Sec62 在没有 cue1 的情况下稳定，证实了 cue1 在 Deg1-Sec62 的 ER 相关降解中的作用。

使用成像软件对 Western 印迹的结果进行定量。为了比较样品之间 Deg1-Sec62 蛋白的丰度，确定了每个样品的 Deg1-Sec62 与 Pgk1 的调整信号强度的比率。重要的是要记住，该程序最直接地报告了目标蛋白质的稳态群体的降解动力学。

为了可视化目标蛋白质的新生群体的降解，可以使用其他技术，例如脉冲追踪实验。不要忘记放线菌酮和叠氮化钠具有剧毒，在执行此程序时应采取预防措施以避免直接接触这些化学物质。