蛋白质降解的放线菌酮追踪分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本实验的总体目标是观察酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中特定蛋白质稳态群体的降解过程。该方法可用于确定蛋白质降解所需的遗传条件以及环境因素对其的影响。该技术的主要优势在于无需使用放射性同位素和耗时的免疫沉淀步骤，而脉冲-追踪（pulse-chase）技术在观察蛋白质降解时则需要这些步骤。

该实验方案可用于分析内源性酵母蛋白或由质粒表达的蛋白。对于后者，需按照标准的酵母转化方案，将编码目标蛋白的质粒转化至酵母菌株中。将酵母接种于5 mL合适的培养基中。

30 摄氏度下旋转培养过夜。次日早晨，测定各过夜培养物在 600 纳米处的光密度（OD600）。将培养物用 15 毫升新鲜培养基稀释至 OD600 为 0.2。

在30摄氏度下振荡培养，直至细胞达到对数生长中期。在酵母细胞培养期间，准备环己酰亚胺追踪实验。将可容纳15毫升锥形管的加热金属块预热至30摄氏度，用于在含有环己酰亚胺的条件下孵育细胞。

为确保向培养物有效传热，向加热块的每个孔中加入水，使插入一支15毫升锥形管后，水位上升至孔口边缘但不溢出。设置第二个可容纳1.5毫升微量离心管的加热块，用于细胞裂解后的蛋白质变性，温度设定为95摄氏度。将新鲜培养基预热至30摄氏度。

每次检测每个时间点的每份培养物需要 1.1 毫升培养基。向预先标记的微量离心管中加入 50 微升 20 倍终止混合液。为每份待测培养物的每个时间点准备一支离心管。

将试管置于冰上。当酵母细胞生长至对数中期时，为每个检测时间点收集2.5 OD600单位的各培养物。1 OD600单位相当于1毫升培养液在OD600为1.0时所含的酵母量。

将收集的细胞在15毫升锥形管中，于室温下以3,000 × g离心2分钟。弃去上清液。每2.5个OD600单位的细胞，用1毫升30 °C的新鲜培养基重悬细胞沉淀。

在开始环己酰亚胺追踪实验之前，将酵母细胞悬浮液置于30 °C的加热块中孵育5分钟以达到平衡。该实验过程中最具挑战性的环节是每份样品添加环己酰亚胺及细胞收集的时间控制。为确保实验成功，我们通过建立并严格遵守添加环己酰亚胺和收集细胞的时间表来实现精确操作。

开始环己酰亚胺追踪实验时，按下计时器上的“Start”按钮。迅速但小心地将环己酰亚胺加入第一份酵母细胞悬液中，使其终浓度为 250 微克/毫升，并短暂涡旋混匀。立即取 950 微升（约 2.4 OD600 单位）已添加环己酰亚胺的酵母细胞悬液，转移至预先标记的微量离心管中，该管内已含有 50 微升冰浴的 20× 终止混合液。

涡旋微量离心管，并置于冰上，直到所有样品均收集完毕。按照为其余每份酵母细胞悬液设定的固定时间间隔，开始环己酰亚胺追踪实验。在每个后续时间点，涡旋酵母细胞悬液，并将950 µL转移至含有50 µL预冷的20×终止混合液的已标记微量离心管中。

涡旋混匀并将收集的细胞置于冰上。为防止酵母细胞沉降，在整个追踪过程中，大约每5分钟对15毫升锥形管中的细胞悬液进行一次涡旋混匀。当所有样品收集完毕后，在室温下以6,500 × g离心30秒，使收集的细胞沉淀。

用移液管或抽吸法去除上清液。细胞现在已准备好进行碱裂解。向每份细胞沉淀中加入100 µL蒸馏水，并通过反复吹打重悬细胞，以完成碱裂解前的准备。

向每个样品中加入 100 微升 0.2 摩尔的氢氧化钠。通过涡旋混合。在室温下孵育细胞五分钟。

在此阶段，酵母细胞尚未裂解，蛋白质也未释放。接下来，将细胞在室温下以18,000 × g离心30秒，使细胞沉淀。通过移液或抽吸去除上清液。

为裂解细胞，向每份细胞沉淀中加入 100 微升 Laemmli 样品缓冲液。通过反复移液上下吹打使细胞重悬。在 95 摄氏度下孵育 5 分钟，以充分变性蛋白质。

将裂解物在室温下以 18,000 × g 离心 1 分钟，使不溶性物质沉淀。上清液为溶解的提取蛋白，可直接用于 SDS-PAGE 分离及后续的 Western 印迹分析。或者，裂解物可在 -20 °C 保存。

通过环己酰亚胺追踪法分析了酵母内质网相关降解底物模型 Deg1-Sec62 的稳定性。Deg1-Sec62 蛋白在 SDS-PAGE 上表现为多种条带，并在野生型细胞中迅速降解。Pgk1 作为上样对照，其丰度在所检测的条件下保持不变。

缺失内质网驻留的泛素连接酶 Hrd1 或泛素结合酶 Ubc7 均显著稳定了 Deg1-Sec62 蛋白，这证实了这些蛋白在 Deg1-Sec62 降解过程中先前观察到的作用。Cue1 是一种跨膜蛋白，可将 Ubc7 锚定于内质网膜并激活该酶，但 Cue1 是否参与 Deg1-Sec62 的降解尚未被直接研究。本研究发现，在缺失 Cue1 的情况下，Deg1-Sec62 蛋白得以稳定，从而确认了 Cue1 在 Deg1-Sec62 的内质网相关降解过程中的作用。

使用成像软件对 Western 印迹结果进行定量。为了比较各样本中 Deg1-Sec62 蛋白的丰度，计算了每个样本中 Deg1-Sec62 与 Pgk1 的校正信号强度比值。需要明确的是，该实验步骤最直接反映的是目标蛋白稳态群体的降解动力学。

为了观察目标蛋白新生群体的降解过程，可采用其他技术，例如脉冲-追踪实验。请注意，环己酰亚胺和叠氮化钠具有极强毒性，在操作本实验步骤时应采取预防措施，避免直接接触这些化学试剂。