鼠冠状动脉血管平滑肌细胞的分离

该程序的总体目标是从小鼠冠状动脉循环中分离血管平滑肌细胞，用于培养和用于标准细胞培养测定。这种方法可以帮助回答心血管领域的关键问题，例如小鼠原发性冠状动脉血管平滑肌细胞行为涉及哪些关键疾病机制。该技术的主要优点是它产生大部分纯的小鼠原代冠状动脉血管平滑肌细胞群。

在开始该程序之前，将一个无菌的 10 毫升 Leur Lock 注射器连接到灌注泵管上，该注射器填充有室温 HBSS，不含酚红。接下来，将每个 25 号插管从加热线圈转移到装有不含酚红的冰冷 HBSS 的单个 10 毫升注射器上。将注射器放在冰上。

然后，在两根 5 厘米长的真丝缝合线上打松散的反手结，一端是另一端的两倍。将一个结放在每个 25 号套管上，不要拧紧，然后将一个 HBSS 归档的注射器放入环形支架上的滴定管夹中。当所有材料都准备好后，确认对脚趾触摸没有反应，并使用剪刀去除麻醉实验小鼠前颈部的皮毛和皮肤。

当颈静脉可见时，使用镊子小心去除静脉周围的脂肪，然后缓慢注射 100 微升肝素，将手术海绵放在静脉上以避免出血过多。一分钟后，打开箱子，露出心脏。使用弯曲的镊子使心脏活起来，用剪刀切除器官，注意保持升主动脉通过第一头臂支的完整。

然后，立即在含有不含酚红的冰冷 HBSS 的 35 毫米培养皿中冲洗心脏。接下来，将环形支架安装套管以 45 度角放置在解剖显微镜旁边，使尖端刚好位于冰旧 HBSS 的第二个培养皿的表面下方，并通过物镜清晰可见。在显微镜下转移心脏，并使用 Dumont 镊子轻轻钝化解剖多余的脂肪组织，以防止主动脉穿刺或撕裂。

当所有组织都被切除后，使用镊子将血管滑过套管，并将针头向下引导穿过靠近主动脉瓣但不超出主动脉瓣的主动脉腔。套管就位后，将预先系好的丝绸滑过主动脉并收紧结。然后，打第二个结，在主动脉周围形成一个方结，固定心脏。

现在，用冰冷的 HBSS 缓慢而温和地冲洗冠状动脉循环中剩余的血液，然后打开灌注泵开始 HBSS 的流动。从注射器中取出套管和心脏，注意保持套管集线器充满 HBSS，并将套管连接到充满 HBSS 的温暖加热线圈。然后，以每分钟 0.5 毫升的速度开始对心脏进行 8 分钟的 HBSS 灌注。

一旦第一颗心脏开始灌注，立即为下一个心脏插管和灌注。灌注所有 HBSS 后，用 10 毫升预热的消化液更换 HBSS 注射器，并以每分钟 0.5 毫升的消化液灌注心脏。12 分钟后，将灌注速率更改为每分钟 0.4 毫升，并将装满冷终止液的 15 毫升锥形管放入心脏下方的冰桶中，开始收集富含血管平滑肌细胞的灌注液。

15 分钟后，用第二组试管更换第一组收集管，并立即将含有第一组血管平滑肌细胞组分的两根试管旋转。当注射器中剩余的消化液少于 1 毫升时，连接一个装有 10 毫升新鲜消化液的新注射器。离心结束时，从每个收集管中吸出除最后 0.5 mL 上清液之外的所有上清液，并将第一个心脏的沉淀重悬于 2 mL 温终止液中。

接下来，将来自第一个心脏的细胞悬液与来自第二个心脏的沉淀混合，并将混合的细胞储存在带有松散盖的 37 摄氏度培养箱中。消化 80 分钟后，切开心尖以冲洗掉被困在脑室内的任何剩余细胞，并将这些细胞收集在第六组收集管中。当所有细胞组分混合后，旋转混合的富含血管平滑肌细胞的悬浮液，并从两个心脏的收集管中吸出尽可能多的上清液。

然后，将沉淀重悬于 2 毫升铺板培养基中，并在 37 摄氏度下将它们混合在 35 毫米培养皿中培养 24 小时。第二天，从生物安全柜中的血管平滑肌细胞培养物中轻轻吸出培养基。然后，用两毫升温热的无菌 PBS 洗涤细胞两次，用两根手指轻轻敲击培养皿，同时顺时针旋转板 360 度。

第二次冲洗后，用两毫升新鲜的温无菌 PBS 代替洗涤液，并在显微镜下检查培养物以确认汇合和没有碎屑。用 2 mL 温热铺板培养基替换 PBS，并将细胞放回培养箱中 24 小时。第二天，再次洗涤细胞，以去除培养物中的任何最终碎片和死细胞。

然后，用 2 毫升温热的电镀培养基替换 PBS，并将细胞放回培养箱中。根据第一次洗涤后培养物中细胞的形态评估，分离程序可有效去除心肌细胞和内皮细胞。为了排除外源性和间质成纤维细胞污染的可能性，可以对分离的细胞进行 SM22 α 和 α 平滑肌肌动蛋白（两种血管平滑肌细胞标志物）和波形蛋白（一种成纤维细胞标志物）染色，直至第二代。

PCAM 染色还证实没有内皮细胞污染，表明可以通过该方案从冠状动脉循环中分离出近乎纯的血管平滑肌细胞群。一旦掌握，如果执行得当，整个技术可以在不到两个小时的时间内完成。看完这个视频后，你应该对如何分离原代小鼠血管平滑肌细胞有一个很好的了解。