Name: 盖玻片序贯应用评估鼠标透镜的抗压刚度:应变和形态分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学习使用盖玻片序贯加载法评估小鼠晶状体的抗压刚度与几何形态。该方法精确、可重复且无需昂贵设备，适用于研究年龄相关性晶状体硬化及基因突变对生物力学特性的影响。

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本工作由国家眼科研究所资助项目 R01 EY017724（VMF）和国家关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所资助项目 K99 AR066534（DSG）支持。

所有动物实验均依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行，并经斯克里普斯研究所机构动物护理与使用委员会批准的方案实施。
1. 晶状体解剖
<ol>
	<li>根据美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》中的建议以及批准的机构动物使用规程对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>使用弯头镊子摘除小鼠眼球。用镊子按压眼球周围组织，使眼球突出眼窝，然后用镊子将眼球从眼窝中拔出。将眼球转移至解剖皿中的新鲜1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>尽可能靠近眼球处剪断视神经。用精细直头镊子小心地从视神经穿出眼球后部的孔洞插入眼球内部。</li>
	<li>用剪刀从眼球后部向角膜边缘小心地做切口。啮齿类动物的晶状体约占眼球体积的30%。操作切口时应格外小心，镊子或剪刀不得插入过深，以免损伤晶状体。</li>
	<li>沿角膜与巩膜交界处至少环绕眼球半周进行剪切。</li>
	<li>轻压角膜，使晶状体通过步骤1.4和1.5所形成的开口从眼球中脱出。</li>
	<li>使用精细直头镊子小心去除仍附着在晶状体上的大块杂质。在进行刚度测量前，需对晶状体进行肉眼检查，确认是否存在损伤。</li>
</ol>
2. 刚度测量
<ol>
	<li>使用分析天平称量来自同一盒的至少10个盖玻片，计算盖玻片的平均重量。为保证一致性，所有实验应使用同一盒盖玻片。在实验开始前，将盖玻片和直角反射镜在室温下用1×PBS预湿至少2小时。</li>
	<li>将测量室（见图1）中加入65–75 ml的1×PBS。测量室由本单位机械加工车间使用有机玻璃（Plexiglas）制作，室内的凹槽通过钻床配合合适的钻头并设定至所需深度加工而成。晶状体在室温的1×PBS中可保持透明，直至力学测试结束。</li>
</ol>
<img alt="静力平衡；用于物理实验的三维矩形丙烯酸棱柱及其尺寸示意图。" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：刚度测量腔室。 一张展示自制刚度测量腔室尺寸的照片，腔室内含有多种不同深度和形状的凹槽。直径为2 mm、距腔室边缘约13–14 mm的圆形凹槽（黄色箭头所示），深度分别为200 µm或300 µm，用于小鼠晶状体的测量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53986/53986fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>将直角反射镜以固定距离放置于腔室内，该距离相对于用于固定晶状体的凹槽保持不变。确保实验过程中反射镜不发生移动。</li>
	<li>使用持取镊子或弯头镊子小心地将解剖好的晶状体转移至测量腔室中。</li>
	<li>从正上方对未加载负荷的晶状体拍摄俯视图像。拍摄小鼠晶状体时使用30倍放大倍率，光源来自解剖显微镜底部以及左右两侧的光纤光源。将光纤光源的电源输出功率设置为最大光强的80%。根据环境光照、用户偏好及图像质量需要，可适当调节电源输出。</li>
	<li>通过直角反射镜拍摄未加载负荷晶状体的侧视图像。若相机未校准，需对焦拍摄反射镜边缘的照片。反射镜边缘长度为5 mm，该尺寸后续可用于确定像素/毫米比例，并作为图像中的标尺。</li>
	<li>将晶状体放入凹槽中，并确认晶状体已稳固且垂直地嵌入凹槽内。在加载负荷前拍摄一张晶状体图像。晶状体应以其前极或后极平稳地置于凹槽中。</li>
	<li>轻柔地将一片盖玻片放置在晶状体上。等待2分钟以允许蠕变发生，然后拍摄一张加载后晶状体的侧视图像。</li>
	<li>继续按照步骤2.8的方法逐片添加盖玻片，并在每次添加后按照步骤2.8拍摄侧视图像，直至总共施加10片盖玻片为止。</li>
	<li>移除所有盖玻片。等待2分钟后，拍摄移除全部盖玻片后的晶状体侧视图像（包括凹槽内和凹槽外的视野）。</li>
</ol>
3. 晶状体核测量
<ol>
	<li>为确定晶状体核的大小，将晶状体转移至盛有1x PBS的洁净培养皿中。</li>
	<li>使用精细直头镊子轻轻去除晶状体的囊膜。</li>
	<li>通过戴手套的手指轻轻滚动晶状体，使皮质纤维细胞脱落。剩余的晶状体核触感类似坚硬的玻璃珠。此方法适用于从1月龄开始的成年动物晶状体核的分离。由于分离得到的晶状体核为刚性结构，因此无法使用本方法进行进一步的力学测试。</li>
	<li>在培养皿中用1x PBS轻轻冲洗晶状体核。</li>
	<li>将晶状体核重新放回测量室（不要放入凹槽内），并通过直角反射镜拍摄晶状体核的图像。</li>
</ol>
<img alt="静力学平衡示意图与显微镜图像，不同盖玻片压力下的小鼠晶状体，压缩实验研究。" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：由盖玻片压缩的小鼠晶状体。 （A）实验装置的示意图与（B）照片，显示一个2月龄小鼠晶状体置于测量室中深度为200 µm的凹槽内，测量室中充满1× PBS。使用安装在解剖显微镜上的直角反射镜和数码相机，采集盖玻片压缩过程中晶状体的图像。（C）在逐步增加盖玻片数量进行压缩时，对2月龄野生型小鼠晶状体进行矢状面观察的照片，提供了用于测量轴向和赤道直径以及计算基于盖玻片压缩测试过程中轴向和赤道应变的原始数据。晶状体在盖玻片中的反射有时可见（在单个盖玻片图像中最清晰）。进行测量时，应忽略反射像，并以晶状体的顶点为测量终点。（D）2月龄野生型小鼠晶状体在压缩后的矢状面照片以及分离出的晶状体核。压缩后晶状体与分离的晶状体核均置于凹槽之外。比例尺：1 mm。本图改编自 Gokhin, et al. PloS one, 201219。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53986/53986fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 图像分析
<ol>
	<li>使用 ImageJ 或类似软件，在加载前及每次加载步骤后测量晶状体的赤道面直径和轴向直径。测量每个晶状体核的直径。晶状体核近似球形，因此在任意方向上的测量均可19,21。</li>
	<li>通过加上所用凹槽的深度来校正晶状体的轴向直径。在测量腔中，凹槽遮挡了晶状体轴向厚度的 200 µm（2月龄小鼠晶状体）或 300 µm（4月龄和8月龄小鼠晶状体）。</li>
	<li>利用公式 ε = (d - d0) / d0 计算晶状体的轴向和赤道面应变，其中 ε 表示应变，d 为特定载荷下的轴向或赤道面直径，d0 为零载荷下对应的轴向或赤道面直径。</li>
	<li>绘制轴向和赤道面应变随施加载荷（单位：mg）变化的函数图。</li>
	<li>绘制轴向、赤道面及核直径的变化图。通过将轴向直径除以赤道面直径，计算并绘制晶状体的长宽比（aspect ratio）。</li>
	<li>使用公式 体积 = 4/3 × π × rE2 × rA 计算并绘制晶状体体积，其中 rE 为赤道面半径，rA 为从第2.6步拍摄图像中测得的轴向半径。该公式假设晶状体为扁球体（椭球体）1,22。</li>
	<li>使用公式 体积 = 4/3 × π × rN3 计算并绘制晶状体核体积，其中 rN 为从第3.5步拍摄图像中测得的晶状体核半径。该公式假设晶状体核为球体19,21。</li>
	<li>计算并绘制核体积分数，即核体积与晶状体总体积的比值。</li>
</ol>

<ol><li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLovicu%2C+FJ+%22Development+of+the+ocular+lens%22">Development of the ocular lens</a>. , Cambridge University Press. (2004).</li>
<li>Piatigorsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+differentiation+in+vertebrates.+A+review+of+cellular+and+molecular+features%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features.</a> Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).</li>
<li>Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+accommodation%3A+surgical+options+for+correction+of+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Optom%22%5BJournal%5D)">Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia.</a> Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).</li>
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<li>Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+increase+in+the+stiffness+of+the+human+lens+nucleus+with+age%3A+the+basis+for+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia.</a> Mol Vis. 10, 956-963 (2004).</li>
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<li>Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+increase+in+accommodative+potential+after+neodymium%3A+yttrium-aluminum-garnet+laser+photodisruption+of+paired+cadaver+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses.</a> Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).</li>
<li>Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+spinning+lens+test+to+determine+the+stiffness+of+the+human+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens.</a> Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).</li>
<li>Glasser, A., Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbyopia+and+the+optical+changes+in+the+human+crystalline+lens+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age.</a> Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).</li>
<li>Pau, H., Kranz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+sclerosis+of+the+human+lens+with+age+and+its+relevance+to+accommodation+and+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).</li>
<li>Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+elasticity+in+human+lenses+using+bubble-based+acoustic+radiation+force%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force.</a> Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).</li>
<li>Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lens+stiffness+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse lens stiffness measurements.</a> Exp Eye Res. 91 (2), 300-307 (2010).</li>
<li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry%2C+transparency%2C+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734(2012).</li>
<li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li>
<li>Fudge, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+filaments+regulate+tissue+size+and+stiffness+in+the+murine+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).</li>
<li>Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+modeling+of+secondary+fiber+development+and+growth%3A+I.+Nonprimate+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses.</a> Mol Vis. 12, 251-270 (2006).</li>
<li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+age-related+stiffening+in+the+crystalline+lens+by+Brillouin+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy.</a> Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用该方法测量晶状体刚度时需考虑几个关键因素。首先，盖玻片相对于培养腔底部以略微倾斜的角度（8 - 8.5°）施加于晶状体（θ）。这将施加一个非常小的赤道方向分力，而非完全沿轴向加载。然而，由于 sin θ ≈ 0.119，该赤道方向的载荷被认为可忽略不计。如果该方法被用于更大的晶状体，需测量盖玻片与培养腔底部之间的角度，以确定在应变计算中是否需要考虑赤道方向的载荷。其次，在每次添加盖玻片后，必须让晶状体充分平衡至关重要。等待2分钟的时间允许时间依赖性形变（即，蠕变）的发生，从而确保仅在晶状体达到平衡形态时进行图像采集19。第三，本方案已优化用于在较宽载荷动态范围内测量小鼠晶状体的压缩应变。在预实验中，施加1,293 mg的载荷（即，十个18 × 18 mm的盖玻片）可使小鼠晶状体达到最大应变，超过此载荷后进一步增加载荷不会引起明显的额外形变。这是由于晶状体核具有刚性，其在压缩下几乎不发生形变19。第四，该方案可避免不可逆的组织损伤。在先前发表的实验中，重复加载后未观察到小鼠晶状体机械性能的变化，表明该方法不会对晶状体造成损伤...

晶状体是位于眼球前房的一个透明且无血管的器官，负责将光线精确聚焦到视网膜上。一层称为晶状体囊的透明基底膜包裹着大量被前部单层上皮细胞覆盖的伸长纤维细胞1,2。晶状体的终生生长依赖于赤道区上皮细胞持续不断地增殖并分化为新的纤维细胞，这些新形成的纤维细胞以同心圆方式逐层添加到先前世代的纤维细胞之上2。随着时间推移，晶状体纤维细胞发生压缩，导致晶状体中央形成一个坚硬的核心，称为晶状体核1。调节（accommodation）定义为眼屈光力的屈光度变化，在人类中，当睫状肌收缩引起晶状体变形时，眼的屈光力真实增加，从而实现对近处物体的聚焦3-5。在未调节的眼中，由于悬韧带纤维的张力作用，晶状体处于相对扁平的状态；当睫状肌收缩时，晶状体所受张力释放，导致晶状体赤道直径减小而轴向厚度增加。晶状体随年龄增长发生的变化会引起老视，即晶状体调节能力进行性下降，从而导致需要佩戴阅读眼镜。
多项研究已将老视与晶状体固有刚度随年龄增长而增加的现象联系起来6-11。刚度定义为弹性物体在受力时抵抗形变的能力。已有多种方法被用于检测人眼晶状体的刚度，包括旋转压缩法12-14、致动器压缩法15、探针压痕法16、动态力学分析法6,10以及基于气泡的声辐射力法17。尽管小鼠晶状体不具备调节功能，也不会发生老视，但用于研究晶状体病变的小鼠模型仍具有重要价值，因为小鼠比大型动物更经济，遗传背景明确，且由于衰老速度快，其与年龄相关的改变更为迅速。少数研究采用压缩法检测了小鼠晶状体的刚度，并证实了刚度随年龄增长或特定基因干扰而发生变化18-21。因此，小鼠晶状体是研究晶状体刚度随年龄变化的良好模型。
本方案描述了一种简单、低成本但精确且可重复的压缩方法，用于测定小鼠晶状体的刚度。该方法通过将玻璃盖玻片施加于晶状体，并结合体视显微镜和反射镜对晶状体进行拍照来实现。该方法利用易于制作和组装的装置，可获得可靠的应变和形态测量数据。代表性结果证实，小鼠晶状体的刚度随年龄增长而增加。

<table><tbody><tr><td>精细尖头直头镊子</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪刀，直刃</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>持取镊子</td><td>Hammacher</td><td>HSC 702-93</td><td>可选</td></tr><tr><td>解剖皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565154</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 × 18 mm 玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>带凹槽用于固定镜片的测量室</td><td></td><td></td><td>定制（见 &lt;strong&gt;图 1&lt;/strong&gt;）</td></tr><tr><td>直角反射镜</td><td>Edmund Optics</td><td>45-591</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>Schott/Fostec</td><td>8375</td><td></td></tr><tr><td>带照明的解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX-ILLD100</td><td>配备 SZ-PT 摄影管</td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Nikon</td><td>Coolpix 990</td><td></td></tr></tbody></table>

依次施加玻璃盖玻片评估小鼠晶状体压缩刚度：应变与形态测量分析

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

晶状体是一个透明的器官，能够折射并聚焦光线，从而在视网膜上形成清晰的图像。在人类中，睫状肌收缩会改变晶状体的形状，增加其屈光力，以聚焦近处物体，这一过程称为调节。晶状体硬度随年龄增长而发生的变化与老视有关，老视即晶状体调节能力下降，进而导致需要佩戴阅读眼镜。尽管小鼠晶状体不具备调节功能，也不会发生老视，但小鼠模型可作为理解晶状体病理的重要遗传学工具，且小鼠表现出的加速衰老特征使得研究晶状体的年龄相关变化成为可能。本实验方案展示了一种简单、精确且成本效益高的方法，用于测定小鼠晶状体的硬度，该方法利用玻璃盖玻片对晶状体施加逐步增加的压力负荷。代表性数据证实，小鼠晶状体与人类晶状体类似，其硬度随年龄增长而增加。该方法具有高度可重复性，并有望扩展应用于对较大动物晶状体的力学测试。

测量了2个月、4个月和8个月大小鼠晶状体的硬度和尺寸。所有小鼠均为来自TSRI动物繁育中心的纯系C57BL6背景的野生型动物，每个晶状体上加载了1至10个盖玻片。通过测量每增加一个盖玻片后晶状体的轴向和赤道径线直径，并将每次直径的变化归一化至相应的无负载直径，从而计算出轴向和赤道方向的应变。每个年龄组测试了8个晶状体，结果以平均值±标准误表示。如先前报道19，轴向应变是施加负载的对数函数（图3A）。在最大施加负载下，轴向和赤道应变均表现出具有统计学意义的随年龄增长而降低的趋势（图3），表明小鼠晶状体随年龄增长而变硬。相同年龄晶状体之间的应变测量结果具有高度可重复性，这由较小的标准误所证实。
本实验期间采集的图像数据还被用于确定晶状体的其他若干形态学特征（图4）。如预期所示，晶状体的轴径、赤道直径和体积均随年龄增长而增加（<stro...

晶状体硬度随年龄增长而增加，这与老视有关。本实验方案介绍了一种简单且成本效益高的小鼠晶状体硬度测量方法。小鼠晶状体与人晶状体类似，均会随年龄增长而变硬。该方法具有较高精确性，且可适用于较大动物晶状体的测量。

晶状体是一个透明器官，可折射并聚焦光线，从而在视网膜上形成清晰的图像。在人体中，睫状肌收缩以改变……

本实验的总体目标是采用一种简单且低成本的方法，评估小鼠晶状体的压缩刚度和几何形态。该方法可解答晶状体研究领域中的一些关键问题，例如不同遗传因素和实验干预如何影响晶状体的生物力学特性。该技术的主要优势在于其精确、可重复，且无需昂贵或专用设备。该方法可揭示小鼠晶状体的特性，未来有望应用于大鼠和兔子等体型较大的模式生物。由于晶状体解剖和盖玻片应用步骤若无演示则难以掌握，因此对该方法的可视化呈现至关重要。本实验操作将由我实验室的博士后研究人员 Catherine Cheng 示范。开始解剖时，使用弯头镊子压住已实施安乐死的小鼠眼球周围的组织，使眼球突出眼窝。随后，摘除眼球并将其置于含有新鲜 PBS 的解剖皿中，在解剖显微镜下进行后续操作。尽可能靠近眼球处剪断视神经。然后通过视神经穿出眼球后部的孔洞，用精细的直镊子轻柔且小心地插入眼球内部。使用剪刀从眼球后部向角膜边缘小心地做切口，注意不要损伤晶状体。沿着角膜与巩膜之间的连接处继续切开，至少环绕眼球一半以上。然后轻轻按压角膜，通过切口将晶状体从眼中推出。接着，使用尖头直镊子小心地移除仍附着在晶状体上的任何较大碎屑。并通过目视确认镜头无损伤。在开始测量硬度前至少两小时，使用分析天平称量来自同一盒的至少10片盖玻片，计算盖玻片的平均重量。然后，用室温的磷酸盐缓冲液（PBS）预先润湿盖玻片和直角镜。在材料水化的同时，向测量室中加入 65 至 75 毫升 PBS。将测量室置于解剖显微镜下，显微镜设置为 30 X 放大倍数，光源来自底部，并在左右两侧使用光纤光源照明。当盖玻片准备就绪后，将直角反射镜以固定距离放入腔室中，该距离相对于用于固定晶状体的凹槽保持恒定。接着，使用弯头镊子小心地将解剖好的晶状体转移至测量腔室。将光源的光功率调节至最大光强的80%，并根据环境光照、用户偏好以及图像质量需要，相应调整电源输出。从培养室正上方获取未加载镜片的俯视图像。然后，拍摄镜面边缘处于焦点状态的图像，接着通过凹槽外的镜面拍摄未加载镜片的侧视图。随后，将一枚镜片放入凹槽中，并确认镜片已牢固且笔直地嵌入其前极或后极的凹槽内。在镜中拍摄镜头的照片。然后，轻轻地将盖玻片放置在镜头上。两分钟后，拍摄载入后的镜头另一张侧视图像。继续添加盖玻片，每次添加后两分钟获取侧面图像，直至总共添加10片盖玻片。然后移除所有盖玻片，等待最后两分钟，获取凹槽内外晶状体的侧面图像，以及凹槽外晶状体的顶视图像。为了确定晶状体核的大小，将晶状体放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的洁净培养皿中，使用精细的直头镊子轻轻去除晶状体囊膜。通过戴手套的手指轻轻滚动晶状体以去除皮质纤维细胞。接着，用PBS轻轻冲洗晶状体核，并将晶状体核重新放回测量室中。通过直角镜获取晶状体核的图像。最后，使用合适的图像分析软件测量每次加载步骤前后晶状体的赤道直径和轴向直径，并测量每个晶状体核的直径。在此代表性实验中，测量了两个月、四个月和八个月大小鼠晶状体的硬度和尺寸，并计算了轴向和赤道向应变。轴向应变为施加载荷的对数函数，在最大施加载荷下，轴向和赤道向应变均随年龄增长呈现具有统计学意义的显著下降，表明小鼠晶状体的硬度随年龄增加而增大。实验过程中采集的图像数据还被用于确定其他多种晶状体形态学特征。与预期一致，晶状体的轴向和赤道直径以及晶状体体积均随年龄增长而增加。长宽比表明，晶状体的赤道直径略大于轴向直径。该参数不随年龄变化。晶状体核的直径、体积和占比随年龄增长而增加，表明晶状体核在老化过程中会发生重塑，相对尺寸逐渐增大。一旦掌握该技术，若操作得当，每枚晶状体的处理可在30至45分钟内完成。在进行此操作时，重要的是将晶状体均匀地置于凹槽内，并在每次添加新的盖玻片之间让晶状体静置松弛两分钟。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过依次使用盖玻片来评估小鼠晶状体的压缩刚度及形态测量学参数。这种精确、简便且成本低廉的技术为晶状体研究人员探索基因突变在小鼠中产生的生物力学效应提供了有效途径。

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