高内涵筛选分析法评价有害和潜在有害成分的毒性效应（HPHC）
2016年5月10日
该研究的目的是使用基于阻抗的实时细胞分析仪和基于高内涵筛选 （HCS） 的体外毒理学评估平台的组合来评估 15 种香烟烟雾成分的生物学影响。本研究提供了有关测试化合物的有效剂量、毒性和作用方式的信息。
这种方法结合了基于阻抗的实时细胞分析仪和基于高内涵筛选的平台，其总体目标是提供有关有效剂量、毒性和生物效应的信息，以获得测试化合物的毒学概况。这种方法可以帮助回答毒理学领域的关键问题。例如，解决细胞嗜糖性、遗传毒性和细胞应激反应。
此外，它不仅可以同时提供有关多个生化和形态参数的信息，还可以应用于不同范围的细胞类型和细胞培养模型。由于管辖权和限制，整个方法将在仅评估一小块化合物时执行。出于同样的原因，将只显示一种方案来演示高内涵筛选评估。
演示该程序的是我实验室的技术人员 Stefano Acali 和 Alexander Laurent。要查看正常的人支气管上皮细胞或 NHBE 细胞，请对仪器进行编程以定义阻抗测量的数量和持续时间。在本研究中，每 15 分钟记录一次数据，持续 48 小时。
通过将 50 微升预热的培养基移液到 96 孔 RTCA 板的每个孔中来测量板背景。此步骤代表了仪器计算介质电阻的技术要求，以用作基于单元的计算的基线参考。接下来，将 50 微升浓度为每毫升 144， 000 个细胞的细胞悬液添加到 RTCA 板每个孔中已有的培养基中。
一旦我们的细胞加热，将板在室温下放置 40 分钟以让细胞附着并获得均匀的细胞分布非常重要。将 RTCA 板在培养箱的支架中孵育，并在给药前开始记录接下来 24 个小时的数据，正负两个小时。对于阳性对照，在 DMSO 中稀释 10 毫摩尔星形孢菌素储备液，1 至 10。
将 5 μL 稀释液加入 195 μL 培养基中，以获得 5x 工作溶液。对于有害和可能有害的成分，将它们中的每一种溶解在载体中以生成一摩尔原液。然后，在培养基中将每种供试品储备液 1 至 10 稀释，以生成 100 毫摩尔溶液。
首先在 B 到 F 的孔中加入培养基加 10% 载体，并在 A 孔中加入 100 毫摩尔溶液，生成化合物母板，进行 5 步，1 到 10 的连续稀释，以获得 5x 工作溶液。对于加样，暂停 RTCA 仪器，打开支架以取出暴露板，然后将板放入 RTCA 温度工具中，以避免冷却电池，从而影响阻抗测量。将 25 微升 5x 溶液从 Compound 主板一式三份添加到细胞中，保持与 Compound 主板中的加药顺序相同。
请勿去除现有的细胞培养基。然后，向底行右半部分的细胞中加入 25 微升 5x 阳性对照溶液，而不去除现有培养基。同样，向底行左半部分的细胞中加入 25 μL 培养基。
使用封板机密封板后，将板放回 RTCA 支架中，并锁定。重新开始数据记录以获得所需的曝光时间。数据记录后，分析 RTCA 细胞活力数据以确定在 HCS 分析中使用哪种测试物质。
在本实验中，选择 1-氨基萘烷、砷、铬和巴豆醛进行 HCS 分析。要查看 NHBE 细胞，以每毫升 120， 000 个细胞的密度向 96 孔黑色板的每个孔中加入 100 微升细胞悬液。将 HCS 板置于室温下 30 分钟后，让细胞附着在孔上，在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 24 小时，再加样或减去 2 小时。
对于阳性对照，在第 2 列中分配 40 μL 每个阳性对照的储备液。然后，在第 3 列和第 5 列中分配 20 微升载体。第四列为 40 微升车辆。
从第 2 列的孔中取出 12 μL，分配到第 3 列的孔中，然后混合。继续直到获得每种阳性对照化合物的三种剂量和载体的最终连续稀释。为了生成阳性对照板，在三种剂量和载体的培养基中制备 1 至 40 稀释液。
为了制备化合物母板，重新悬浮并稀释每种测试物质储备溶液，在浓度为 100 毫摩尔的培养基中稀释 1 至 10 种。使用含有 10% 载体的培养基进行稀释，以获得每种测试物质的选定 5 倍剂量。阳性对照和复合板现在都已准备好在曝光板上加样。
接下来，将 25 微升 5x 溶液从 Compound 母板一式三份添加到细胞中，保持与 Compound 母板中的加药顺序相同。请勿去除现有的细胞培养基。然后，将 25 微升来自阳性对照板的 5x 溶液添加到底行的细胞中，保持与阳性对照板中的给药顺序相同。
按照文本方案中的说明准备足够体积的活细胞染色溶液。然后，根据供应商的说明，在活细胞染色溶液中稀释线粒体染料和膜渗透性染料。将 50 μL 活细胞染色溶液加入板的每个孔中，命名为细胞毒性测定。
不要去除细胞培养基，并在 37 摄氏度、5% CO2 下孵育 30 分钟。轻轻吸出培养基和染色溶液，并向每个孔中加入 100 微升固定液。然后，将板在室温下避光孵育 20 分钟。
孵育后，轻轻吸出固定液，并用每孔 100 μL 的洗涤缓冲液洗涤一次。去除洗涤缓冲液，每孔添加 100 微升 1x 透化缓冲液，然后在室温下避光孵育 10 分钟。吸出透化缓冲液，用每孔 100 微升洗涤缓冲液洗涤板两次。
然后，吸出洗涤缓冲液并向每个孔中加入 100 微升 1x 封闭缓冲液。然后，在室温下避光孵育 15 分钟。在一抗溶液中稀释抗细胞色素 C 抗体，稀释 1 至 250。
接下来，吸出封闭缓冲液，每孔添加 50 μL 一抗溶液，然后在室温下避光孵育 60 分钟。在二抗和细胞核溶液中稀释 1 到 500 的抗小鼠抗体。此外，在二抗和核溶液中将细胞核染料稀释 1 比 1， 000。
吸出一抗溶液后，使用洗板机用每孔 100 μL 洗涤缓冲液洗涤板 3 次。吸出洗涤缓冲液，每孔向板的每个孔中加入 50 μL 二抗和细胞核溶液。现在，将板在室温下避光孵育 60 分钟。
吸取二抗和细胞核溶液后，使用洗板机用每孔 100 μL 洗涤缓冲液洗涤板 3 次。然后，每孔加入 100 μL 洗涤缓冲液。现在，该板已准备好在 HCS 仪器上进行评估，并开始采集。
显示了供试品处理的代表性 RTCA 细胞活力结果。仅使用 1-氨基萘烷、砷、铬和巴豆醛，在暴露 24 小时内获得毒性剂量依赖性效应，因为它们的计算 LD50 都小于 20 毫摩尔。与其他化合物无毒性作用。
此处显示的是仅 1-氨基萘及苯他林治疗的代表性 HCS 结果。1-氨基萘的毒性作用正在诱导细胞膜的严重损伤，暴露 4 小时后，导致细胞膜通透性以剂量依赖性方式增加。该化合物还影响线粒体，暴露 4 小时后诱导质量增加，同时释放细胞色素 C，然后在暴露 4 小时和 24 小时后可在细胞核中检测到。
一旦掌握，这项技术可以在两到三天内执行，因为大多数技术每天需要大约一个小时的手动时间来设置和给药。根据所选的方案，高内涵筛选最多需要 3 小时 1/2 小时才能完成整个染色程序。在尝试此过程时，请记住，尽管选择更广泛的终端节点会增加工作流程的复杂性，但不会显著增加时间。
事实上，通过最佳工作流程，可以并行评估多个板。高内涵筛选平台的持续开发，包括全自动细胞设置、化合物稀释、加样和染色，以及新终点的增加，将进一步扩展高内涵筛选平台作为毒理学分析的强大工具的能力。此外，在如此高的通量下结合多个单一毒理学终点将使我们在减少动物化学检测的努力中更进一步。
概述
本研究使用基于阻抗的实时细胞分析仪和高内容筛选平台，调查了15种香烟烟雾成分的生物学效应。该研究旨在提供这些化合物的有效剂量、毒性和作用机制的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 毒理学
- 细胞生物学
- 环境健康
背景
- 香烟烟雾中含有许多有害成分。
- 了解这些化合物的影响对公共健康至关重要。
- 基于阻抗的分析允许对细胞反应进行实时监测。
- 高内容筛选提供了细胞效应的详细见解。
研究目的
- 评估香烟烟雾成分的毒性。
- 确定有效剂量和作用机制。
- 开发这些化合物的全面毒理学概况。
使用的方法
- 基于阻抗的实时细胞分析用于细胞毒性评估。
- 高内容筛选用于评估细胞反应。
- 使用正常人支气管上皮细胞进行测试。
- 每15分钟记录一次数据，共计48小时。
主要结果
- 确定了几种有害成分的有效剂量。
- 观察到细胞毒性和细胞应激反应。
- 选择了化合物进行进一步的高内容筛选分析。
- 提供了评估多种生化参数的框架。
结论
- 综合方法有效地评估了香烟烟雾成分的毒性。
- 结果有助于理解这些化合物的生物学影响。
- 研究结果可能为监管决策和公共健康政策提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assessing the toxicological profiles of individual cigarette smoke constituents enables mechanistic de-risking in early discovery by clarifying pathway-specific effects. This approach supports predictive confidence in target validation by linking compound exposure to defined cellular outcomes such as mitochondrial dysfunction, genotoxicity, oxidative stress, and kinase activation. The integration of impedance-based and high-content screening provides a scalable, reproducible workflow for prioritizing harmful constituents in tobacco product evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking constituent exposure to specific mechanisms like mitochondrial damage and histone H2AX phosphorylation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative LD50 determination and real-time viability tracking.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying constituents with computable toxicity profiles for further mechanistic study.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, multiparametric readouts including cell index, mitochondrial mass, cytochrome C release, and membrane permeability.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via standardized staining protocols and automated imaging on HCS platforms.
- Scalability: Enables parallel processing of multiple plates, supporting medium-throughput screening of toxicant libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Uses disease-relevant normal human bronchial epithelial cells to model respiratory toxicity.
- Mechanistic Continuity: Links early cytotoxicity signals to downstream genotoxic and stress pathway activations for risk-adjusted decision-making.
- Predictive De-risking: Identifies constituent-specific biomarkers such as phosphorylated H2AX and cytochrome C translocation for mechanistic profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges discovery biology and lead identification by providing quantitative toxicity data and mechanistic insights that inform compound selection and optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via real-time impedance measurements and endpoint-specific HCS readouts to clarify mechanisms of action.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized protocols with quantitative outputs for compound comparison and hit confirmation.
- Analytics: Provides LD50 calculation, dose-response curves, and multiparametric imaging data to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro findings to respiratory disease models through use of NHBE cells and pathway-specific biomarker detection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable toxicology profiling platform applicable to diverse compound libraries beyond tobacco constituents.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through multiparametric toxicity profiling.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via defined staining, fixation, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering early, mechanism-based toxicity data to reduce late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated toxicological mechanisms and effective doses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, impedance-based analysis, and high-content screening instrumentation.
- Dependent on access to RTCA and HCS platforms, live-cell dyes, fixation reagents, and automated washers.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, dosing procedures, and image analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or complex mixtures beyond single HPHCs.
- Limited by the need for compound solubility in vehicle and cytotoxicity thresholds that permit LD50 computation (<20 mM).
