Name: 高内涵筛选分析法评价有害和潜在有害成分的毒性效应（HPHC） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 了解高内涵筛选分析法评价有害和潜在有害成分毒性效应的技术。本研究使用人支气管上皮细胞进行实时阻抗分析和多参数细胞成像，为烟草毒理学研究提供可靠的毒性评估框架。

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作者感谢 Karsta Luettich 和 Grégory Vuillaume 对手稿的审阅。

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所有作者均为菲利普莫里斯国际公司的员工。菲利普莫里斯国际公司是本项目的唯一资金来源和资助方。

近年来，人们广泛讨论了替代动物实验以及开发新型高通量检测方法的迫切需求。这促使科研人员和监管机构积极探索用于标准毒性测试的替代方法，利用能够紧密模拟靶组织生理特性的细胞检测技术。在本研究中，我们展示了将实时细胞分析仪（RTCA）与高内涵筛选（HCS）平台相结合，用于评估单一香烟烟雾成分暴露对人肺上皮细胞影响的可行性。该实验体系同样可类比应用于评估其他多种空气污染物、空气颗粒物及纳米颗粒所诱导的细胞毒性。此外，所获得的结果可与全基因组转录组学数据以及基于因果生物网络的计算方法结果进行比对。如先前报道所述，该方法使我们能够将香烟烟雾暴露引起的分子通路扰动数据5与HCS的终点指标相互印证，从而在表型水平上进一步验证这些通路的扰动效应。
作为一种流程图式检测方法，实时细胞分析能够以剂量和时间依赖的方式提供与细胞活力相关的信息，从而有助于更好地决策下游分析所需的合适剂量和作用时间点14。该分析仪的原理基于细胞在覆盖有金微电极的培养孔表面贴附和伸展时所引起的电学阻抗变化。阻抗被转换为一个无量纲参数，称为细胞指数（cell-index），可用于监测细胞的贴附、伸展、形态变化以及最终的细胞活力。尽管该技术不能提供有关细胞毒作用机制的信息，但其高灵敏度使得即使在高内涵筛选（HCS）无法获得有效信息的极低剂量下，也能检测到细胞形态的变化（数据未显示）。根据前期实验结果，我们注意到，与HCS检测终点相比，RTCA方法能够在更低的剂量下检测到细胞形态的变化。
在使用实时细胞分析仪进行初步筛选后，采用高内涵筛选（HCS）平台进一步深入分析每种有害烟气成分（HPHC）所引发的细胞毒性类型。HCS检测组合可对HPHCs在细胞区室/细胞器中的潜在影响进行表征，并识别出具有基因毒性或氧化应激效应的成分。分析结果显示，所选的HPHCs在正常人支气管上皮（NHBE）细胞中诱导出不同的毒性特征。总体而言，除苯酚外，所有化合物在最高测试剂量下均被发现可诱导细胞坏死。与潜在致癌作用一致，1-氨基萘可诱导H2AX磷酸化，作为基因毒性的标志物；然而，HCS检测组合还发现该HPHC在 mitochondrial 毒性检测中具有活性（线粒体质量增加和细胞色素C释放）以及引发氧化应激（谷胱甘肽耗竭）。同样，如先前所述，苯酚被证实可诱导线粒体功能障碍，并导致DNA损伤及谷胱甘肽耗竭。铬（VI）（被归类为I类致癌物的化合物之一）和巴豆醛也被确认具有基因毒性；特别是铬（VI）还可诱导细胞凋亡（caspase级联激活），而巴豆醛则导致活性氧（ROS）生成增加。最后，砷（V）被发现可诱导cJun磷酸化，这是应激激酶通路激活的标志。
在本研究中，我们采用原代人支气管上皮（NHBE）细胞作为肺上皮细胞的模型 体外在高内涵筛选（HCS）环境中使用这些细胞尚属首次，使得研究人员能够检测更广泛的终点指标，包括基因毒性及氧化应激标志物。本方案中描述了活细胞和固定细胞染色两种方法，体现了该技术整体上的灵活性。事实上，相同的方案可拓展应用于更广泛的检测目标，只需使用任何荧光染料或抗体即可实现。在成功实施活细胞染色方案时，需特别注意孵育时间，因为部分染料的半衰期较短，若图像采集尚未完成，荧光信号可能已减弱。此外，若更换不同类型的细胞，所有染色条件均需重新评估，因为最佳染料浓度和孵育时间可能有所不同。
在本研究中，我们描述了一种仅使用高内涵筛选（HCS）方法检测五种化合物的实验场景。根据前述的孔板布局，这些化合物在两组不同的孔板上进行给药，共计24块孔板（6个检测项目，2个时间点）。孔板数量也可进一步增加，从而实现更多化合物的同时筛选或更多终点指标的检测。然而，在实施前需注意，某些终点指标（如GSH和ROS）需要立即进行检测，因此孔板的给药应分批进行，以便为前一块孔板的检测留出时间。另一方面，采用固定细胞染色方案具有优势，因为孔板可在固定后的任意步骤暂停并堆叠存放，待后续阶段再继续完成染色流程。例如，该策略可为操作人员提供充足时间，完成所有活细胞染色孔板的操作，同时不损害数据质量。
为了通过减少培养板数量进一步优化工作流程，还可以将更多检测终点进行多重检测。例如，在本实验中，只需使用两种在不同通道发射荧光的荧光染料标记的二抗，即可同时检测DNA损伤和应激激酶。随着高内涵筛选（HCS）平台的持续发展，包括实现细胞接种、化合物稀释、给药和染色的全自动化，以及新增更多检测终点，HCS平台作为针对上皮细胞及其他细胞类型中高潜力化合物（HPHCs）的强大表型分析工具的能力将进一步拓展。

毒理学风险评估历来依赖动物模型，尽管动物模型在生命科学中具有基础性作用，但也存在诸多缺陷，例如对人类的可转化性不一致以及成本高昂。此外，近年来人们越来越致力于寻找动物实验的替代方法，以践行&#34;3R原则&#34;2（替代、减少和优化）。过去几年中，这一努力不断加速，不仅得益于高通量技术与系统生物学等新方法的进展，也受到立法限制动物实验的推动，尤其是在欧盟地区。
调控细胞对毒性损伤反应的信号通路具有复杂性，这表明仅使用单一的毒理学终点指标不足以描述某些化合物的毒理学基础。因此，还需考虑数百种相互作用的蛋白质所构成的生物网络之间的协同作用。为了研究毒物对这些网络的影响，结合表型中通量和高通量筛选实验的系统毒理学方法，有助于推断毒物的效价，同时提供更多关于单个毒物作用机制的信息。
在本研究中，我们采用高内涵筛选（HCS）作为强大的筛选工具。该工具由自动化显微镜和生物软件应用程序组成，能够获取、处理和分析来自基于荧光的细胞检测的图像数据。这使得可以在单个细胞或亚细胞水平上对细胞内的可视化变化进行定量，并同时分析多个参数。3 例如，通过基于抗体的方法检测组蛋白H2AX的磷酸化来评估DNA双链断裂，同时使用一种可穿透细胞膜且对超氧阴离子敏感的染料来定量活性氧（ROS）。
由于肺上皮细胞是抵御吸入性毒物（包括香烟烟雾）的第一道生物屏障，我们采用原代支气管上皮细胞作为研究模型 体外 用于分析美国食品药品监督管理局公布的有害和潜在有害成分（HPHCs）影响的模型。4 本文是对先前一项研究的后续工作5 我们评估了一组不同HPHCs的生物学影响。
作为我们评估细胞毒性的实验流程的一部分 体外我们首先利用基于阻抗的实时细胞分析（RTCA）系统，评估了15种HPHC化合物的活性，以确定适用于后续高内涵筛选（HCS）分析的剂量范围。图1）。随后使用九个细胞毒性的多参数终点指标进行毒理学高内涵筛选（HCS）评估，每个指标均在两个时间点（4 和 24 小时）进行监测。所用标志物可指示线粒体毒性、DNA 损伤、应激激酶、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）含量、caspase 3 - 7 活性、细胞色素 C 释放以及细胞膜通透性，具体如文中所述 表1.
我们的方法通过剂量和时间依赖性取样，实现了对香烟烟雾成分作用的鉴定与表征。最终，这产生了一个 体外 每种有害和潜在有害成分（HPHC）的毒理学特征。多组学方法也可用于进一步补充高内涵筛选分析，从而深入理解细胞信号传导和/或转录水平上的效应。

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI 高内涵筛选成像系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td>05331625001</td><td></td></tr><tr><td>筛选仪（高内涵筛选，HCS）</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY细胞计数仪TTC</td><td>罗氏</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA 96孔板</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA 心脏温度工具</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>板封膜 Breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>正常人支气管上皮细胞（NHBE）</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>非吸烟的60岁白人男性供体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前置于 C</td></tr><tr><td>ReagentPack 传代培养试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前置于 C</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（100倍浓缩液）</td><td>康宁</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask 滤芯瓶盖 75&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96孔检测板&amp;nbsp; 黑色&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5（用于远红光核染色）</td><td>生物状态</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>线粒体染料：MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>线粒体染料：MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS染料：二氢乙啶</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS染料：CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS染料：MitoSOX</td><td>生命技术</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH 染料：单氯荧光素</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>GSH 染料：单溴二氯荧光素</td><td>生命技术公司</td><td>M-1378</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>膜通透性染料：YO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Y3603</td><td>刺激性&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>膜通透性染料：TO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>生命技术</td><td>T3602</td><td>刺激性&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>膜通透性染料：TOTO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>刺激性&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Caspase 染料：Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>刺激性&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗细胞色素C抗体（小鼠）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化c-Jun抗体（小鼠）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化H2AX抗体（小鼠）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG DyLight 650&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x 穿孔缓冲液</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛溶液</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>10x 封闭缓冲液</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>缬氨霉素</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>百草枯</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>茴香霉素</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>依他尼酸</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>1-氨基萘</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>2-硝基丙烷</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>乙酰胺</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>砷（V）</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>苯</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>六价铬（Cr(VI)）</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>巴豆醛</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>甲基乙基酮</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>镍&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>硝基苯</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>喹啉</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>有毒的</td></tr></tbody></table>

高内涵筛选分析用于评估有害及潜在有害成分（hphc）的毒理学效应

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

香烟烟雾（CS）是心血管疾病和肺部疾病的主要风险因素。由于香烟烟雾是一种复杂的气溶胶，含有超过7,000种化学物质1，因此评估其各种单独组分对整体毒性的贡献具有挑战性。然而，可通过体外（in vitro）高通量筛选工具建立单个组分以及混合物的毒理学特征谱，从而对美国食品药品监督管理局（FDA）定义的烟草烟雾中有害和潜在有害成分（HPHCs）进行表征2。
为进行初步评估，采用基于阻抗的仪器对化合物的毒性进行实时、无标记检测。该仪器的读数依赖于细胞黏附、活力和形态，这些参数共同提供了细胞状态的总体情况。通过一个无量纲参数——细胞指数（cell index）进行定量分析。此外，建立了一套不同的染色方案，结合高内涵筛选（HCS）平台进行荧光成像分析，以更深入地了解每种烟草危害成分（HPHC）所引发的细胞毒性类型。
在测试的15种组分中，仅有5种因测得可计算的LD50 （&#60; 20 mM）而被选用于基于高内涵筛选（HCS）的分析，分别为1-氨基萘、砷（V）、铬（VI）、巴豆醛和苯酚。根据其在HCS中的效应，1-氨基萘和苯酚可被鉴定为可诱导线粒体功能障碍；1-氨基萘、苯酚与铬（VI）均可基于组蛋白H2AX磷酸化水平升高被鉴定为具有基因毒性；巴豆醛被鉴定为氧化应激诱导剂，而砷（V）则被鉴定为应激激酶通路激活剂。
本研究证明，基于阻抗和高内涵筛选（HCS）技术的组合为 体外 CS成分的评估

RTCA
由于在未检测到毒性效应时，HCS终点指标将不具信息性，因此在RCTA中即使在最高浓度下也未显示细胞活力下降的化合物将不进行HCS测试（图3b,c,d,g,k,l,m,p）。仅在最高浓度下显示细胞活力下降的化合物（图3e,o）也被排除在HCS测试之外。最终，仅选择具有可计算LD50 （&lt; 20 mM）的组分进行进一步的HCS分析（图3a,f,h,j,n）。符合上述标准的HPHCs包括：1-aminonaphtalene、Arsenic (V)、Chromium (VI)、Crotonaldehyde 和 Phenol。
HCS
作为质量控制（QC），首先分析阳性对照，以确保染色步骤正确执行。经阳性对照处理的细胞的代表性图像见图6。数据值如前所述以溶剂对照组为基准进行归一化。由于仅测试了三个剂量，且并非在每个时间点都考虑全部三个剂量，因此未绘制剂量-反应曲线。阳性对照的剂量选择基于前期实验（数据未显示），以确保在4小时和24小时两个时间点上，每个检测终点均能观察到适当的反应。具体而言，剂量1和剂量2用于评估4小时的效应，而剂量2和剂量3用于评估24小时的效应。若阳性对照剂量未观察到任何反应，则弃用该培养板。需注意的是，除线粒体膜电位和谷胱甘肽（GSH）含量外，所有其他检测终点均预期信号强度增加。
除苯酚外，所有化合物均诱导产生坏死表型，表现为细胞膜通透性增加（图 7a,f,h,l）。根据组蛋白 H2AX 磷酸化水平升高，1-氨基萘、六价铬、巴豆醛和苯酚被鉴定为具有遗传毒性（图 7e,j,n,p）。苯酚和 1-氨基萘可诱导严重的线粒体功能障碍（图 7b,o），其中 1-氨基萘还导致细胞色素 C 释放增加（图 7c）。检测到的caspase 3/7 活性升高表明铬暴露可引发细胞凋亡事件。在 1-氨基萘、巴豆醛和苯酚处理下也检测到氧化应激（ROS 或 GSH）的诱导（图 7d,m,q）。最后，砷通过转录因子 cJun 的磷酸化水平升高，显示出可诱导细胞应激（图 7g）。
<img alt="使用RTCA和HCS方法进行化合物毒性分析的实时细胞分析示意图。" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig1.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图1"> 
图1. 化合物毒性分析工作流程。 a) 本研究中采用的工作流程示意图。首先，使用RTCA平台进行剂量范围探索，以选择适合后续HCS实验的剂量，从而表征化合物特异性的毒性谱。 b) 本研究的实验设计。细胞接种后24小时给予药物处理，并在接下来的24小时内持续监测阻抗值，而HCS终点指标则在给药后4小时和24小时进行检测。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="化合物稀释过程；用于剂量分析的暴露板示意图；实验装置。" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图 2"> 
图 2. RTCA 暴露板。 首先通过五步 1:10 连续稀释制备化合物母板。随后将每种化合物（包括溶剂对照组，剂量为 0）以三复孔形式加入暴露板中，同时加入培养基和星形孢素作为对照。注意转移过程中保持剂量顺序不变，最高剂量位于第 1 行，而溶剂对照组位于第 7 行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="毒性检测图、LD₅₀ 值、化学物质浓度反应曲线、毒性分析结果。" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图 3"> 
图 3. RTCA 细胞活力检测的代表性结果。 a) 1-氨基萘，b) 2-硝基丙烷，c) 乙酰胺，d) 丙酮，e) 丙烯酰胺，f) 砷 (V)，g) 苯，h) 铬 (VI)，j) 巴豆醛，k) 甲基乙基酮，l) 镍 (II)，m) 硝基苯，n) 苯酚，o) 喹啉，p) 甲苯。给药后 24 小时，计算每个剂量（包括阳性对照和溶剂对照）的曲线下面积（AUC），并将其归一化为 0 至 -100% 活性范围（y 轴），其中 0 表示溶剂对照的活性，-100 表示阳性对照的活性。随后将数值绘图，并使用四参数 Hill 方程进行拟合，在可能的情况下计算 LD50 值。浓度以对数尺度表示（x 轴）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="连续稀释与对照板设置；微量孔板中药物浓度效应；实验图表。" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="Figure 4"> 
图4. HCS检测中阳性对照化合物的稀释方案。 a) 将阳性对照和溶剂加入连续稀释板中。 b) 阳性对照的连续稀释。 c) 200倍浓度的阳性对照剂量。 d-e) 将200倍浓度的阳性对照剂量在培养基中按1:40稀释，以制备含有5倍浓度剂量的阳性对照板。注意每个剂量均设三个复孔，以对应暴露板中的最终布局。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="化合物剂量-反应设置；用于药物筛选的微孔板示意图；阳性对照和溶剂对照。" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图 5"> 
图 5. 高内涵筛选暴露板。 首先通过五步稀释法配制化合物母板。随后，每种化合物（包括溶剂对照，剂量为0）与阳性对照一同以三复孔形式加入暴露板中。请注意，转移过程中保持剂量顺序不变，最高剂量位于第1行，而溶剂对照位于第7行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞染色的荧光显微镜图像；多色标记指示不同的细胞组分。" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图 6"> 
图 6. 抗体或染料染色细胞的代表性荧光图像。 a) 核参数 — 核染料：一种可穿透细胞膜的染料，可与活细胞或固定细胞中的 DNA 结合。该染色用于标记细胞核区域以识别单个细胞。b) 坏死 — 细胞膜通透性染料：基于染料检测细胞膜完整性。该试剂本身不能穿透细胞膜。在发生坏死时，细胞膜变得通透，染料进入细胞并与 DNA 结合，产生强烈的荧光信号。c) 凋亡 — 细胞色素 C：基于抗体检测细胞色素 C 的释放，这是早期凋亡的公认标志之一。在凋亡被诱导后，细胞色素 c 从线粒体释放并扩散至细胞核。d) DNA 损伤 — pH2AX：基于抗体检测组蛋白 H2AX 的磷酸化，这是双链 DNA 断裂的公认标志。e) 应激激酶 — cJun：基于抗体检测 cJun 在 Ser-73 位点的磷酸化，这是细胞应激的公认标志。f) 氧化应激 — DHE：基于染料检测超氧自由基。二氢乙啶（Dihydroethidium）本身在细胞质中发出蓝色荧光，而其氧化产物乙啶（ethidium）插入 DNA 后发出红色荧光。g) GSH — mBcl：基于染料检测游离 GSH 分子。mBcl 与 GSH 反应生成一种高度荧光的产物。h) 凋亡 — Caspase 3/7 活化：基于染料检测 Caspase 3/7 的活性。该试剂本身无荧光，含有一段四氨基酸肽可抑制其与 DNA 结合。当 Caspase-3/7 被活化后，该肽段被切割，使染料能够结合 DNA 并产生明亮的荧光信号。图中 b–h 面板显示经阳性对照处理的细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="剂量-反应曲线；膜通透性、DNA损伤、对数浓度、毒理学数据分析。" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图7"> 
图7. 代表性高内涵筛选（HCS）结果。 1-氨基萘（a-e）、五价砷（f 和 g）、六价铬（h-k）、巴豆醛（l-n）和苯酚（o-q）。每种剂量下的4小时（蓝色线）和24小时（橙色线）信号均被计算，并以溶剂对照组活性（0%）为基准进行归一化。未参与曲线拟合计算的数值以灰色显示。浓度以对数尺度表示（x轴）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>检测</td>
			<td>终点编号</td>
			<td>生物学终点</td>
			<td>细胞区室</td>
			<td>输出特征</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">细胞毒性</td>
			<td>1</td>
			<td>线粒体质量 6</td>
			<td>细胞质</td>
			<td>斑点平均面积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>线粒体膜电位 6</td>
			<td>细胞质</td>
			<td>斑点平均强度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>细胞色素C释放 7</td>
			<td>细胞核</td>
			<td>平均强度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>细胞膜通透性 8</td>
			<td>细胞核</td>
			<td>平均强度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA损伤</td>
			<td>5</td>
			<td>磷酸化-H2AX 9</td>
			<td>细胞核</td>
			<td>平均强度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>应激激酶</td>
			<td>6</td>
			<td>磷酸化-cJun10</td>
			<td>细胞核</td>
			<td>平均强度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROS</td>
			<td>7</td>
			<td>ROS 11</td>
			<td>细胞核</td>
			<td>平均强度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH含量</td>
			<td>8</td>
			<td>GSH 12</td>
			<td>细胞质</td>
			<td>斑点平均强度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>凋亡</td>
			<td>9</td>
			<td>Caspase 313</td>
			<td>细胞质</td>
			<td>斑点平均强度</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 高内涵筛选（HCS）检测方法及终点指标列表。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
			<td rowspan="2">溶剂</td>
			<td colspan="6" rowspan="2">RTCA 剂量 (µM)</td>
			<td rowspan="2">LD50</td>
			<td colspan="5">HCS 剂量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="4">基于细胞活力筛选的剂量 (µM)</td>
			<td>3R4F (nM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1-氨基萘</td>
			<td>EtOH</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>280 µM</td>
			<td>2,000</td>
			<td>500</td>
			<td>200</td>
			<td>150</td>
			<td>0.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2-硝基丙烷</td>
			<td>EtOH</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&gt;20 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">乙酰胺</td>
			<td>EtOH</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&gt;20 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">丙酮</td>
			<td>Water</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&gt;20 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">丙烯酰胺</td>
			<td>Water</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&gt;20 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">砷 (V)</td>
			<td>Water</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>160 µM</td>
			<td>200</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>25</td>
			<td>0.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">苯</td>
			<td>EtOH</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&gt;20 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">铬 (VI)</td>
			<td>Water</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20 µM</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>20</td>
			<td>10</td>
			<td>0.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">巴豆醛</td>
			<td>Water</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>200 µM</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">甲基乙基酮</td>
			<td>Water</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&gt;20 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">镍</td>
			<td>Water</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&gt;20 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">硝基苯</td>
			<td>EtOH</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&gt;20 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">苯酚</td>
			<td>EtOH</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>2,300 µM</td>
			<td>5,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>1,000</td>
			<td>500</td>
			<td>240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">喹啉</td>
			<td>EtOH</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&gt;20 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">甲苯</td>
			<td>Water</td>
			<td>20,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>200</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&gt;20 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 处理24小时后相对LD50的已测试HPHC化合物列表。 用于高内涵筛选（HCS）分析的化合物以橙色标出，同时列出了测试剂量。3R4F剂量相当于一支参考香烟3R4F烟雾中该成分的含量。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>检测</td>
			<td>化合物</td>
			<td>储存液浓度</td>
			<td>溶剂</td>
			<td colspan="3">剂量 (µM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞活力</td>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td colspan="3">50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞毒性</td>
			<td>Valinomycin</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>50</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA损伤</td>
			<td>Paraquat</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>500</td>
			<td>200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>应激激酶</td>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROS</td>
			<td>Rotenone</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1,000</td>
			<td>400</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH含量</td>
			<td>Ethacrynic acid</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1,000</td>
			<td>400</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞凋亡</td>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>40 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>200</td>
			<td>50</td>
			<td>20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 各项检测所用阳性对照及其浓度列表。

本研究旨在利用基于阻抗的实时细胞分析仪与基于高内涵筛选（HCS）的平台相结合的方法，评估15种香烟烟雾成分的生物学影响 体外本研究提供了有关受试化合物的有效剂量、毒性和作用机制的信息。

高内涵筛选分析用于评估有害及潜在有害成分（HPHC）的毒理学效应

香烟烟雾（CS）是心血管疾病和肺部疾病的主要危险因素。由于CS是一种复杂的气溶胶，含有超过7,000种化学物质1，它……

该方法结合了基于阻抗的实时细胞分析仪和基于高内涵筛选的平台，其总体目标是提供有关有效剂量、毒性和生物学效应的信息，以获得受试化合物的毒性特征（Tox Profile）。该方法有助于回答毒理学领域的关键问题，例如细胞毒性、基因毒性和细胞应激反应等。此外，该方法不仅能同时提供多种生化和形态学参数的信息，还可应用于多种不同类型的细胞及细胞培养模型。由于管辖权限和条件限制，整个操作过程将仅针对一段较短的化合物进行评估。出于相同原因，仅展示一种实验方案以演示高内涵筛选评估。演示该实验步骤的是来自本实验室的技术人员 Stefano Acali 和 Alexander Laurent。为观察正常人支气管上皮细胞（即 NHBE 细胞），需对仪器进行编程以设定阻抗测量的次数和持续时间。本研究中，每 15 分钟记录一次数据，持续 48 小时。通过移液将50微升预热的培养基加入96孔RTCA板的每个孔中，以测量板的背景值。此步骤是仪器计算培养基电学电阻所必需的技术环节，该电阻将作为基于细胞计算的基线参考值。随后，向RTCA板各孔中已有的培养基中加入50微升浓度为144,000个细胞/毫升的细胞悬液。细胞加热后，必须将培养板在室温下静置40分钟，以使细胞充分贴壁并获得均匀的细胞分布。将RTCA培养板放入培养箱中的底座内孵育，并在给药前开始记录数据，持续24小时，允许±2小时的偏差。对于阳性对照，用DMSO将10毫摩尔的星形孢菌素储备液按1:10比例稀释。取5微升稀释液加入195微升培养基中，得到5倍工作溶液。对于有害和可能有害的组分，将每种组分溶解于载体中，配制成1摩尔的储备液。然后，将每种待测物质的储备液在培养基中按1:10稀释，得到100毫摩尔的溶液。通过先向B至F孔中加入含10%溶剂的培养基，再向A孔中加入100毫摩尔溶液，制备化合物主母板。进行五步1:10倍比稀释，以获得5倍工作液。给药时，暂停RTCA仪器，打开支架取出暴露板，并将该板置于RTCA温控工具中，以避免细胞冷却，从而影响阻抗测量。从化合物主母板中取25微升5倍溶液，按照化合物主母板中的相同加药顺序，以三复孔形式加入细胞中。不要移除现有的细胞培养基。然后，在不移除现有培养基的情况下，向底部一行右侧的细胞中加入25微升5倍浓度的阳性对照溶液。同样，向底部一行左侧的细胞中加入25微升培养基。使用酶标板封板机密封酶标板后，将酶标板重新放回RTCA仪器的板架中并锁定。重新启动数据记录，持续至设定的暴露时间。数据记录完成后，分析RTCA细胞活力数据，以确定用于高内涵筛选（HCS）分析的待测物质。在本实验中，选择1-氨基萘、砷、铬和巴豆醛进行高内涵筛选分析。为观察原代人支气管上皮细胞（NHBE细胞），将100微升细胞悬液（浓度为每毫升120,000个细胞）加入96孔黑色培养板的每个孔中。将高内涵筛选板在室温下静置30分钟，使细胞贴壁，随后在37摄氏度、5%CO2条件下孵育24小时（±2小时），然后进行给药处理。对于阳性对照，在第二列中加入每种阳性对照储备液 40 微升。然后在第三列和第五列中加入 20 微升溶剂，在第四列中加入 40 微升溶剂。从第二列的孔中取出 12 微升，加入到第三列的孔中，并混匀。重复此操作，直至获得每个阳性对照化合物的三个剂量组及溶剂对照组的最终系列稀释。为制备阳性对照板，将三个剂量组及溶剂对照组在培养基中进行 1 比 40 的稀释。为制备化合物主板，将每种测试物质的储备液用培养基重新悬浮并稀释1至10倍，使其浓度为100毫摩尔。使用含10%溶剂的培养基进行稀释，以获得每种测试物质选定的5倍剂量。此时，阳性对照和化合物板均已准备好，可用于向暴露板加样。接下来，将化合物主板中的5倍浓度溶液各25微升加入细胞中，每组设三个复孔，加样顺序需与化合物主板中的给药顺序保持一致。无需移除现有的细胞培养基。然后，将阳性对照板中的5倍浓度溶液各25微升加入底部一排的细胞中，加样顺序需与阳性对照板中的给药顺序保持一致。按照文本方案中的说明，准备足量的活细胞染色液。然后，根据供应商的说明，将线粒体染料和膜通透性染料分别用活细胞染色液稀释。向指定用于细胞毒性检测的每孔板中加入 50 微升活细胞染色液。不要移除细胞培养基，于37摄氏度、5% CO2条件下孵育30分钟。轻轻吸去培养基和染色液，每孔加入100微升固定液。然后，将培养板在室温下避光孵育20分钟。孵育后，轻轻吸去固定液，每孔加入100 µL洗涤缓冲液洗涤一次。移除洗涤缓冲液后，每孔加入100 µL 1×透化缓冲液，室温避光孵育10分钟。吸去透化缓冲液，再用洗涤缓冲液每孔100 µL洗涤两次。然后，吸去洗涤缓冲液，每孔加入 100 µL 1× 封闭缓冲液。室温下避光孵育 15 分钟。用一抗溶液将抗细胞色素 C 抗体按 1:250 比例稀释。接下来，吸除封闭缓冲液，每孔加入 50 µL 一抗溶液，于室温避光孵育 60 分钟。将抗小鼠二抗按 1:500 比例用二抗与核染溶液稀释。同时，将核染料按 1:1,000 比例用二抗与核染溶液稀释。吸去一抗溶液后，使用板洗机用洗涤缓冲液每孔100微升洗涤3次。吸去洗涤缓冲液，然后每孔加入50微升二抗和核染溶液。将板在室温下避光孵育60分钟。吸取二抗和核染溶液后，使用板洗机，每孔加入100 µL洗涤缓冲液，洗涤3次。然后，每孔再加入100 µL洗涤缓冲液。此时，该板已准备好在HCS仪器上进行检测，并可启动数据采集。展示了测试物质处理后的代表性RTCA细胞活力结果。仅在暴露24小时后，1-萘胺、砷、铬和巴豆醛表现出剂量依赖性的毒性效应，它们的计算LD50均低于20毫摩尔。其他化合物未产生毒性效应。此处展示的仅为1-氨基萘处理的代表性高内涵筛选（HCS）结果。1-氨基萘的毒性效应是诱导细胞膜发生严重损伤，导致细胞膜通透性在暴露四小时后呈剂量依赖性增加。该化合物还会影响线粒体，在暴露四小时后引起线粒体数量增加，并伴随细胞色素C的释放，后者在暴露四小时和24小时后可在细胞核中检测到。一旦掌握，该技术可在两到三天内完成，因为大多数步骤每天仅需约一小时的动手操作时间用于设置和给药。根据所选方案的不同，高内涵筛选的整个染色程序最多需要三又二分之一小时即可完成。在进行该操作时需注意，尽管选择更广泛的检测终点会增加工作流程的复杂性，但并不会显著延长所需时间。通过优化的工作流程，实际上可同时对多块培养板进行评估。高内涵筛选平台的持续开发，包括细胞接种、化合物稀释、给药和染色的全自动化，以及新增检测终点的引入，将进一步提升该平台作为毒理学特征分析强大工具的能力。此外，在如此高通量的条件下整合多种单一毒理学检测终点，将推动我们在减少动物化学物质测试方面再向前迈进一步。

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