共培养化验，以研究胶质母细胞瘤入侵的巨噬细胞和小胶质细胞刺激

本实验的总体目标是在体外测定中模拟胶质母细胞瘤细胞在侵袭过程中与小胶质细胞和巨噬细胞的相互作用。因此，这种方法可以帮助回答肿瘤微环境领域的关键问题，例如哪些化合物或治疗方法会干扰癌症与巨噬细胞的相互作用，巨噬细胞是发展为恶性肿瘤过程中微环境的一种细胞类型。该技术的主要优点之一是它相对容易执行，并且可以在合理的时间完成，并且似乎可以准确地模拟胶质母细胞瘤在体内的侵袭。

首先使用佛波醇肉豆蔻酸酯醋酸酯分化感兴趣的细胞系，如下所示。首先，在 6 孔培养板中的 1.5 毫升培养基中，将 THP-1 细胞接种 2 到 3 次 10 至 5 倍。铺板后，立即加入 100 纳摩尔 PMA，并在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 48 小时。

48 小时后，通过吸出培养基去除 PMA，用 one-X PBS 洗涤一次并加入新鲜培养基。再孵育 48 小时，直到细胞准备好用于检测。然后，将基质预包被室置于含有 500 μL 无血清培养基的孔中，然后在顶部添加 500 μL 无血清培养基，以平衡基质预包被室。

将腔室在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 2 小时。接下来，从含有荧光标记的胶质母细胞瘤细胞系以及小胶质细胞和巨噬细胞的培养容器中轻轻吸出培养基。然后加入 500 微升 2 毫摩尔 EDTA 和 PBS，并在组织培养箱中孵育 5 至 10 分钟。

将细胞收集在含有 0.3% 牛血清白蛋白的 5 毫升培养基中，并以 120 倍 G 离心 5 分钟，离心后，吸出上清液，将细胞沉淀重悬于适当的培养基中，浓度为每毫升 10 至 6 个细胞的 1 倍。使用血细胞计数器对细胞进行计数。接下来，向 24 孔板的孔中加入 500 微升含有 0.3% BSA 的适当培养基。

然后从平衡室中取出培养基，并将腔室放入 24 孔板的孔中。如果使用抑制剂来研究它们对巨噬细胞或小胶质细胞刺激的神经胶质瘤侵袭的影响，请在腔室的底部和顶部添加适当的浓度。根据所使用的细胞系，根据方案书面部分的详细信息混合胶质母细胞瘤细胞和小鼠小胶质细胞或神经胶质瘤细胞以及巨噬细胞。

将细胞混合物添加到顶部腔室中，孵育 24 至 48 小时，具体取决于细胞类型。孵育后，轻轻抽吸从腔室顶部取出细胞。然后将腔室放入 PBS 中的 3.7% 甲醛中固定。

让腔室在室温下在固定剂中保持 15 分钟。最后，通过轻轻抽吸去除固定剂，并替换为 500 微升 one-X PBS。首先，将基质混合物在 4 摄氏度下解冻过夜。

接下来，在冰上的适当培养基中制备每毫升 10 毫克浓度的基质。然后，如前所述，收获标记的细胞以悬浮在基质中。然后将 1.5 倍 10 移液至第 5 个 GL261 细胞（体积为 150 微升），加上 5 倍 10 至第四个 50 微升小胶质细胞，移液至 1.5 毫升微量离心管中。

将 2 乘以 10 的剂量添加到单独的 1.5 mL 微量离心管中，以 200 μL 的体积向第五个 GL261 细胞中加入。将细胞在微量离心机中以 120 次 G 离心 5 分钟，然后，将细胞重悬于 200 μL 冰冷基质中。对于此步骤，在通风橱中准备好冰盘至关重要，将试管放在冰上，尖端在冰箱中，确保所有物品都已冷却，以防止成熟凝胶过早聚合。

重悬后，将 50， 000 个细胞以 50 μL 的体积接种到 8 微米孔径腔室插入物的顶部隔室中心。然后在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，使其发生聚合。30 分钟后，向上腔室中加入 200 μL 无血清培养基，向下孔中加入 700 μL 含血清细胞生长培养基。

孵育 48 小时后，轻轻抽吸从腔室顶部取出细胞。像以前一样固定腔室，并在对细胞成像之前用 500 微升 one-X PBS 更换固定剂。该代表性图像显示了在没有小胶质细胞的情况下侵袭的 mCherry 表达 GL261 细胞。

将细胞接种在基质包被室中并孵育 48 小时。图像是使用 10 倍物镜拍摄的，比例尺代表 400 微米。在这里，GL261 细胞与小胶质细胞结合。

定量了穿过过滤器的 GL261 侵袭细胞的数量。如图所示，在 2D 测定中，将小鼠胶质母细胞瘤细胞系 GL261 与小胶质细胞共培养可将其侵袭性提高多达 10 倍。该图显示了与 DMSO 对照相比，药物抑制剂对小胶质细胞刺激的 GL261 侵袭的影响。

显示的数据来自六个独立实验。该测定也成功用于人类细胞系。孵育 24 小时后，显示了在基质包被室上接种并用 CMFDA 绿色染色的 U87 细胞。

在这里，U87 细胞接种了分化的 THP1 巨噬细胞。该图显示了仅对侵袭性 U87 细胞计数的测定定量。人巨噬细胞系 THP1 刺激 U87 胶质母细胞瘤细胞侵袭。

显示的数据是 10 个独立实验的平均值。该图像来自 GL261 和小胶质细胞共培养的 3D 侵袭测定，是 Z 系列图像的合成图像，显示 GL261 细胞仅用包埋在基质中的 CMFDA 绿色染色。在这里，GL261 细胞与用 CMPTX red 标记的小鼠小胶质细胞共培养。

这里显示了过滤器底部的 GL261 细胞，它们被确定为侵入性的。测定侵袭的 GL261 细胞总数，并将其归一化为单一培养中的 GL261 细胞。显示的数据表示一式两份进行的三个独立实验的平均值。

因此，一旦掌握，这项技术可以在两个小时左右的时间里从头到尾完成。48 小时后即可获得实验的最终结果。因此，在执行这项技术时，将所有东西都冷却并在 4 度下非常重要，包括试管和移液器。

看完这个视频，你应该对如何在巨噬细胞小胶质细胞共培养侵袭试验中建立胶质母细胞瘤有一个很好的了解。