Name: 共培养化验，以研究胶质母细胞瘤入侵的巨噬细胞和小胶质细胞刺激 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习建立胶质母细胞瘤与巨噬细胞及小胶质细胞的共培养侵袭实验方法。该技术利用THP-1细胞分化模型，可在体外准确模拟肿瘤微环境中的细胞相互作用，为研究肿瘤侵袭机制和开发潜在治疗策略提供可靠平台。

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我们感谢 Konstantin Dobrenis 博士为本研究提供了小鼠小胶质细胞。

1. 细胞的荧光标记
注意：用荧光染料标记胶质母细胞瘤细胞系和小胶质细胞9。或者，可构建稳定表达荧光蛋白（如GFP/RFP）的细胞系，方法见文献14。
<ol>
	<li>将细胞接种于6孔板中，使其在染色当天达到70–80%融合度。对于小鼠胶质母细胞瘤细胞系GL261和人胶质母细胞瘤细胞系U87，分别在染色前24小时于6 cm培养皿中接种1 × 106和1.5 × 106个细胞。</li>
	<li>在二甲基亚砜（DMSO）中配制荧光细胞染料溶液，并将5 µM染料加入培养基中（RPMI或无血清巨噬细胞培养基MSFM），充分涡旋混匀。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下，将细胞与染料共同孵育30分钟。</li>
	<li>移除含染料的培养基，向细胞中加入新鲜培养基（RPMI或MSFM）。</li>
	<li>继续孵育细胞30分钟。注意：此时细胞已染色，可直接用于后续实验。</li>
</ol>
2. 预包被基质室共培养侵袭实验
<ol>
	<li>使用佛波酯肉豆蔻酸酯（phorbol myristate acetate, PMA）诱导 THP-1 细胞分化15。
	<ol>
		<li>将 2 - 3 × 105 个 THP-1 细胞接种于 6 孔培养板中，每孔加入 1.5 ml RPMI/10% 胎牛血清（FBS）。接种后立即加入 100 nM PMA，并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。 
		注：48 小时后，成功分化的 THP-1 细胞将贴壁并铺展至孔底，呈现圆形形态。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤一次以去除 PMA，并更换为新鲜的 RPMI/10% FBS。再孵育 48 小时，待细胞可用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将已包被基质的培养小室置于仅含 500 µl 培养基（无血清）的孔中，并在上室加入 500 µl 相同培养基，进行平衡处理。将小室在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 小时。 
	注：预包被小室购自厂商；详见材料与设备表。</li>
	<li>为轻柔地消化细胞（荧光标记的胶质母细胞瘤细胞系及小胶质细胞/巨噬细胞），先通过抽吸去除细胞培养基。用 2 mM EDTA/PBS 洗涤培养皿中的细胞。每孔加入 500 µl 2 mM EDTA/PBS，在细胞培养箱中 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 - 10 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于 5 ml 含 0.3% 牛血清白蛋白（BSA）的培养基中。</li>
	<li>在 120 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀重悬于 MSFM/0.3% BSA 培养基（用于 GL261 细胞和小胶质细胞）或 RPMI/0.3% BSA 培养基（用于 U87 和 THP-1 细胞），使细胞浓度达到 1 × 106 个细胞/ml。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>在 24 孔板的每孔中加入 500 µl 含 0.3% BSA 的培养基。</li>
	<li>移除已平衡至少 2 小时的小室中的培养基（见步骤 2.2）。将小室放入含有 500 µl 含 0.3% BSA 培养基的孔中（见步骤 2.7）。</li>
	<li>若需研究抑制剂对巨噬细胞/小胶质细胞诱导的胶质瘤侵袭的影响，应将相应浓度的抑制剂同时加入小室的上室和下室。 
	注：完全抑制小胶质细胞诱导的 GL261 胶质母细胞瘤侵袭所用的 CSF-1R 抑制剂浓度可参见文献9。</li>
	<li>根据所用细胞系的不同，按以下两个步骤分别加入细胞至上室：小鼠胶质母细胞瘤（2.10.1）和人胶质母细胞瘤（2.10.2）。
	<ol>
		<li>将 1.5 × 105 个 GL261（胶质母细胞瘤）细胞（150 µl）与 5 × 104 个小鼠小胶质细胞（50 µl）混合（培养基信息见步骤 2.6）。加入 300 µl MSFM/0.3% BSA 将总体积补至 500 µl。将细胞混合液加入上室，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。 
		&#8203;注：小鼠小胶质细胞的分离方法如文献16所述。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
将7.5 × 104个U87（胶质母细胞瘤）细胞（75 µl）与2.5 × 104个THP1（巨噬细胞）细胞（25 µl）混合。加入400 µl RPMI/0.3% BSA，使总体积达到500 µl。将细胞混合液加入上室。在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
<ol>
	<li>孵育后，通过轻柔抽吸去除小室上层的细胞，并将小室置于含3.7%多聚甲醛的PBS中固定。室温下固定15分钟（或4 °C过夜）。通过轻柔抽吸去除固定液，加入500 µl 1x PBS。随后进入第4节进行成像分析。 
	&#8203;注意：实验可在此步骤暂停，并在1x PBS中保存以备后续成像。荧光染料信号在固定后最长可稳定检测达2周。</li>
</ol>
3. 侵袭实验 &#34;3D&#34;-在基质中包埋胶质瘤细胞与巨噬细胞/小胶质细胞
<ol>
	<li>在4 °C下过夜解冻基质混合物。所有后续操作均需在冰上、通风橱中进行。</li>
	<li>在冰上用含0.3% BSA的培养基（MSFM或RPMI）配制浓度为10 mg/ml的基质溶液。 
	注：基质的储存浓度通常约为15 mg/ml。</li>
	<li>为将细胞（已在步骤1中标记）悬浮于基质中，先通过抽吸去除细胞培养液。用2 mM EDTA/PBS洗涤培养皿中的细胞。向细胞中加入500 µl 2 mM EDTA/PBS，并在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育5–10分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于5 ml含0.3% BSA的培养基中。</li>
	<li>在120 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>抽吸弃去上清液。将细胞沉淀重悬于含0.3% BSA的培养基中，使细胞浓度达到1 × 106 个细胞/ml。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将1.5 × 105 个GL261细胞（体积150 µl）和5 × 104 个小胶质细胞（体积50 µl）加入一个1.5 ml微量离心管中。另取一个1.5 ml微量离心管，加入2 × 105 个GL261细胞（体积200 µl）。 
	注：仅含GL261细胞而不含小胶质细胞的组作为对照。</li>
	<li>在微量离心机中以120 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀在冰上用200 µl预冷的基质重悬。</li>
	<li>取50 µl（含50,000个细胞）接种至8 µm孔径的Transwell小室上室中央。</li>
	<li>在37 °C孵育30分钟，使基质发生聚合。</li>
	<li>向上室加入200 µl无血清培养基，向下方孔板中加入700 µl含血清的细胞生长培养基。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。</li>
	<li>孵育结束后，通过轻柔抽吸去除小室上表面的细胞，并将小室置于含3.7%甲醛的PBS中固定。室温下固定15分钟（或4 °C过夜）。轻柔抽吸去除固定液，替换为500 µl 1× PBS。随后进入第4节进行图像分析。</li>
</ol>
4. 成像检测
<ol>
	<li>从3.7%甲醛中取出小室，放入含有500 µl新鲜1x PBS的孔中清洗。 
	注意：切勿让小室干燥。</li>
	<li>使用棉签轻轻刮擦滤膜表面（朝向小室内侧的一面），以清除滤膜上部的非侵袭性细胞。操作时先轻柔刮擦，再逐渐增加压力。每个小室至少重复此步骤3次。</li>
	<li>将小室置于玻璃底培养皿中，或保留在24孔板中。</li>
	<li>将样品置于配备相机和图像采集软件的落射荧光显微镜或激光共聚焦荧光显微镜载物台上9,10。</li>
	<li>拍摄数张具有代表性的10X或20X视野图像。</li>
	<li>使用ImageJ等图像分析软件，计数已穿过滤膜到达滤膜下表面的胶质母细胞瘤细胞数量9,10。</li>
	<li>若对第3节所述的&#34;3D&#34;侵袭实验进行成像，需使用荧光激光共聚焦显微镜生成Z轴层扫图像序列5-6。如需对滤膜下表面的侵袭性细胞群体进行成像，请遵循上述第4.2–&#160;4.6步的实验步骤。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

高级别星形细胞瘤和胶质母细胞瘤的高度侵袭性使得这些脑癌具有极高的致死性。因此，理解胶质母细胞瘤侵袭的分子与细胞机制至关重要。目前，关于胶质母细胞瘤侵袭过程的研究已取得诸多进展17。通过本文详述的实验方法，我们的实验室在小鼠和人类模型中均证实，肿瘤相关巨噬细胞可使胶质瘤细胞的侵袭能力增强5至10倍。该共培养模型真实再现了胶质母细胞瘤细胞与巨噬细胞/小胶质细胞发生物理相互作用的能力，从而允许旁分泌和邻近分泌相互作用（例如通过Notch-Delta和Ephrin-Ephs等配体-受体系统），这些作用可能介导肿瘤细胞与巨噬细胞之间的双向通讯。其他旨在研究巨噬细胞对胶质瘤细胞侵袭影响的实验方法通常将细胞物理分隔开，即巨噬细胞接种于孔板底部，而胶质母细胞瘤细胞位于上室3,4。因此，这些研究中巨噬细胞促进的胶质瘤侵袭增幅相对较小（约2倍）。本共培养实验显著增强了该效应（5至10倍），表明在巨噬细胞/小胶质细胞促进的胶质母细胞瘤侵袭过程中，邻近分泌相互作用可能具有重要作用。
本文所述方案包含多个步骤，必须谨慎操作才能获得满意的结果。如果按照此处描述进行实...

多形性胶质母细胞瘤是一种侵袭性的人脑恶性肿瘤，自确诊之日起的中位生存期约为12个月1,2。胶质母细胞瘤是临床上最具致死性和挑战性的癌症之一，因其对标准化疗和手术切除均不敏感。胶质母细胞瘤具有弥散性生长的特性，使得肿瘤细胞能够扩散至正常脑组织中，导致晚期肿瘤几乎无法通过手术完全切除。这种高度侵袭性是胶质母细胞瘤及其他高级别星形细胞瘤的标志性特征。因此，大量研究聚焦于胶质母细胞瘤细胞侵袭的分子机制。胶质母细胞瘤的肿瘤微环境在恶性表型的形成中发挥着关键作用3-6。研究表明，肿瘤相关巨噬细胞/小胶质细胞可促进胶质母细胞瘤的侵袭7,8。然而，大多数研究采用将巨噬细胞/小胶质细胞与胶质母细胞瘤细胞在物理上分离的实验方法来评估其作用。本实验室致力于开发改进的实验方法，以研究在共培养条件下胶质母细胞瘤的侵袭如何依赖于巨噬细胞/小胶质细胞，并实现对侵袭过程中二者之间物理相互作用的成像观察。
用于测量细胞侵袭的经典实验包括&#34;标准&#34;的Boyden小室趋化性和趋化侵袭实验。在此方法中，待研究的细胞被接种于一个塑料小室中，该小室底部含有一层聚碳酸酯滤膜，其上具有特定大小的孔径（通常直径在0.4至8 µM之间）。细胞侵袭过程涉及穿过一种物理屏障，该屏障通常由细胞外基质蛋白构成。在趋化侵袭实验中，常用的基质为Matrigel（下文简称为&#34;基质&#34;），这是一种由Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤细胞分泌的细胞外基质蛋白混合物，主要成分为IV型胶原和层粘连蛋白。随后将小室置于含有细胞培养基的组织培养孔中，培养基中可含有或不含疑似促进侵袭的生长因子。侵袭能力较强的细胞会更频繁地穿过包被有细胞外基质的滤膜，并黏附于滤膜的下表面。我们对该实验方法进行了改进，以评估小胶质细胞和肿瘤相关巨噬细胞在胶质母细胞瘤细胞侵袭中的作用。
我们通过本文所述的共培养实验发现，小胶质细胞可使两种胶质母细胞瘤细胞系的侵袭能力增强5至10倍9,10，这与胶质母细胞瘤动物模型中观察到的现象一致。此外，我们建立了一种三维侵袭实验方法，可更直接地观察胶质母细胞瘤细胞与巨噬细胞/小胶质细胞之间的相互作用。在三维实验中，巨噬细胞/小胶质细胞所诱导的胶质母细胞瘤细胞侵袭程度与基质包被小室方法所观察到的结果相当。此前已有类似实验方法用于研究乳腺癌细胞在侵袭过程中与巨噬细胞的相互作用11-13。本文描述的这两种方法均有助于解析巨噬细胞/小胶质细胞促进胶质母细胞瘤细胞侵袭的分子机制。

<table><tbody><tr><td>Corning BioCoat Matrigel 侵袭小室：含 BD Matrigel 基质</td><td>Corning/Fisher Scientific</td><td>货号: 354481</td><td></td></tr><tr><td>巨噬细胞无血清培养基（MSFM）（500 ml）</td><td>Life Technologies</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX 染料</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA 染料</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>GL261 细胞系</td><td>美国国家癌症研究所（NCI）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U87 细胞系</td><td>美国模式培养物集存库（ATCC）</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 细胞系</td><td>美国模式培养物集存库（ATCC）</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（500 ml）</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 聚碳酸酯膜细胞培养小室（8 &amp;micro;M 孔径），每包 48 个</td><td>Corning</td><td>CLS3422</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3-D 培养基质 低生长因子 基底膜提取物，PathClear</td><td>Trevigen</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life Technologies</td><td>货号: 10500064</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分，热激处理</td><td>Fisherscientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

共培养实验研究巨噬细胞和小胶质细胞对胶质母细胞瘤侵袭的促进作用

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

多形性胶质母细胞瘤（IV级胶质瘤）是一种侵袭性极强的人类癌症，确诊后中位生存期仅为1年。尽管对导致胶质母细胞瘤发生的分子事件的理解不断加深，该肿瘤对常规治疗仍高度耐受。由于胶质母细胞瘤细胞具有高度浸润性，高级别脑肿瘤的手术切除通常难以完全清除。因此，抑制胶质母细胞瘤细胞侵袭的治疗策略具有重要价值。本实验室及其他研究团队已证实，肿瘤相关巨噬细胞及小胶质细胞（脑内常驻巨噬细胞）可显著促进胶质母细胞瘤的侵袭。本文所述实验方案用于建立胶质母细胞瘤与巨噬细胞/小胶质细胞相互作用的模型 体外 培养实验。该方法可显著促进或发现能够阻断肿瘤细胞与巨噬细胞间通信从而抑制此类恶性行为的药物。我们已建立两种可靠的共培养侵袭实验体系，其中小胶质细胞/巨噬细胞可使胶质瘤细胞的侵袭能力增强5至10倍。将带有荧光标记或稳定表达荧光蛋白的胶质母细胞瘤细胞，接种于基质包被的聚碳酸酯膜腔室插入式培养板上，或包埋于三维基质中，分别在有或无巨噬细胞/小胶质细胞的条件下进行培养。通过荧光显微镜对滤膜下表面的侵袭细胞进行成像并计数，以评估细胞侵袭能力。利用这些实验体系，已鉴定出多种可抑制巨噬细胞/小胶质细胞诱导的胶质母细胞瘤侵袭的药理学抑制剂，包括JNJ-28312141、PLX3397、Gefitinib和Semapimod。

利用本文所述方法，我们已证明小胶质细胞和巨噬细胞可显著促进胶质母细胞瘤细胞的侵袭。本研究采用了两种不同的侵袭实验方法，如图1所示。在图2中，将稳定表达荧光蛋白mCherry的GL261细胞接种于预先包被的培养小室中，分别在有或无小胶质细胞的条件下培养48小时。结果显示，GL261细胞单独培养时侵袭能力较弱，而与小胶质细胞共培养时，其侵袭能力约增加10倍。
使用人类细胞系也可观察到类似效应。在图3中，与分化后的THP-1细胞共培养时，用5-氯甲基荧光素二乙酸酯（CMFDA）染成绿色的U87细胞侵袭能力升高了5至6倍。THP-1是一种人类单核细胞系（源自急性单核细胞白血病患者），可通过佛波酯豆蔻酸乙酸盐（PMA）诱导分化为类似巨噬细胞的状态15。分化后的THP-1细胞表现出许多人类巨噬细胞的特征，例如分泌细胞因子以及执行吞噬作用的能力...

要理解癌症的恶性行为，需要建立准确的模型来研究肿瘤细胞与肿瘤微环境组分（如巨噬细胞）之间的相互作用。本文介绍了两种研究胶质母细胞瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞及小胶质细胞相互作用的方法，通过这些方法可评估其对胶质母细胞瘤侵袭能力的影响。

多形性胶质母细胞瘤（IV级胶质瘤）是一种极具侵袭性的恶性人类肿瘤，确诊后中位生存期仅为1年。尽管近年来……

本实验的总体目标是在体外实验中模拟胶质母细胞瘤细胞在侵袭过程中与小胶质细胞及巨噬细胞的相互作用。因此，该方法有助于回答肿瘤微环境领域中的关键问题，例如哪些化合物或处理方式可在恶性进展过程中干扰癌细胞与微环境中的巨噬细胞之间的相互作用。该技术的主要优势之一是操作相对简便，可在合理的时间内完成，且能够较为准确地模拟体内胶质母细胞瘤的侵袭过程。首先使用佛波酯（phorbol myristate acetate, PMA）诱导目标细胞系的分化，具体步骤如下：将 2 至 3 × 10⁵ 个 THP-1 细胞接种于六孔培养板中，每孔加入 1.5 毫升培养基。接种后立即加入 100 纳摩尔的 PMA，并在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 48 小时。48 小时后，通过吸去培养基去除佛波酯（PMA），用一倍浓度的 PBS 洗涤一次，然后加入新鲜培养基。继续孵育 48 小时，直至细胞可用于实验。随后，将预先包被基质的培养小室置于不含血清的 500 微升培养基的孔中进行平衡，并在上室加入 500 微升无血清培养基。在37摄氏度、5% CO2条件下孵育培养室2小时。随后，轻轻吸除含有荧光标记的胶质母细胞瘤细胞系以及小胶质细胞和巨噬细胞的培养容器中的培养基。然后加入500微升含2毫摩尔EDTA的PBS溶液，在组织培养孵箱中孵育5至10分钟。在含有0.3%牛血清白蛋白的5毫升培养基中收集细胞，于120 × g离心5分钟。离心后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于适量培养基中，调整细胞浓度至1 × 10⁶ 个细胞/毫升。使用血细胞计数板对细胞进行计数。随后，向24孔板的各孔中加入500微升含有0.3% BSA的适当培养基。然后移除平衡后小室中的培养基，并将小室放入24孔板的孔中。如果需要使用抑制剂来研究其对巨噬细胞或小胶质细胞刺激的胶质瘤侵袭的影响，需将适当浓度的抑制剂分别加入到小室的底部和顶部。根据所使用的细胞系，按照方案书面部分的详细说明，混合胶质母细胞瘤细胞与小鼠小胶质细胞，或胶质瘤细胞与巨噬细胞。将细胞混合物加入上层小室，根据细胞类型孵育24至48小时。孵育结束后，通过轻柔抽吸去除小室上层的细胞。然后将小室置于含3.7%甲醛的PBS溶液中固定。将腔室在室温下置于固定液中静置15分钟。最后，轻轻抽吸去除固定液，并加入500 µL的1×PBS。首先，在4°C条件下过夜解冻基质混合物。接下来，在冰上用适当的培养基配制浓度为10毫克/毫升的基质溶液。然后，收集之前标记的细胞，用于悬浮在基质中。随后，用移液器将1.5 × 10⁵个GL261细胞（体积为150微升）和5 × 10⁴个小胶质细胞（体积为50微升）加入到一个1.5毫升的微量离心管中。将两份10的5次方个GL261细胞加入到200微升体积中，置于一个独立的1.5毫升离心管内。在微量离心机中以120 × g离心5分钟。随后，将细胞重悬于200微升预冷的基质胶中，并置于冰上。此步骤的关键是：必须提前在生物安全柜中准备好冰盒，保持离心管始终置于冰上，移液枪吸头存放于冰箱中，确保所有实验用品均充分预冷，以防止基质胶过早发生聚合。重悬后，将50,000个细胞以50 µL体积接种至八微米孔径培养插件上室的中央。随后在37°C孵育30分钟，以使凝胶聚合发生。30分钟后，在上室中加入200 µL无血清培养基，在下室中加入700 µL含血清的细胞生长培养基。孵育48小时后，通过轻柔抽吸去除小室上层的细胞。按前述方法固定小室，成像前将固定液替换为500微升1×PBS。该代表性图像显示了在无小胶质细胞存在的情况下侵袭的表达mCherry的GL261细胞。细胞被接种于包被基质的培养皿中，并培养48小时。图像使用10倍物镜拍摄，比例尺代表400微米。此处GL261细胞与小胶质细胞共培养。对穿过滤膜的GL261侵袭性细胞数量进行了定量。如图所示，在2D实验中，将小鼠胶质母细胞瘤细胞系GL261与小胶质细胞共培养，可使其侵袭能力增强高达10倍。该图像显示了药物抑制剂对小胶质细胞诱导的GL261细胞侵袭的影响，与DMSO对照组相比的结果。所示数据来自六次独立实验。该检测方法也已成功应用于人源细胞系。图中显示的是接种于基质包被培养室中、经CMFDA绿色染色的U87细胞，在孵育24小时后的结果。将U87细胞与分化的THP1巨噬细胞共培养。该图像仅对侵袭性U87细胞进行定量分析。人巨噬细胞系THP1可促进U87胶质母细胞瘤细胞的侵袭。数据显示为10次独立实验的平均值。该图像来自GL261细胞与小胶质细胞共培养的三维侵袭实验，为Z轴层扫图像的合成图，显示仅嵌入基质中的GL261细胞经CMFDA绿色染色。在此实验中，GL261细胞与经CMPTX红色标记的小鼠小胶质细胞进行共培养。图中显示了位于滤膜下表面的侵袭性GL261细胞。侵袭的GL261细胞总数被测定，并以单培养条件下的GL261细胞数为基准进行归一化处理。所示数据来自三次独立实验，每组实验均设复孔，取平均值。因此，一旦掌握该技术，便可从头到尾在大约两小时内完成，实验的最终结果可在48小时后获得。因此，在操作该技术时，确保所有物品均处于低温状态，包括离心管和移液器，均需保持在4摄氏度，这一点至关重要。观看本视频后，您应充分了解如何建立胶质母细胞瘤与巨噬细胞/小胶质细胞共培养侵袭实验。

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