Name: 体内生物传感器跟踪非凋亡胱天蛋白酶的活动在果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 了解如何使用CaspaseTracker生物传感器在果蝇中检测非凋亡胱天蛋白酶活性。该方法利用Drosophila melanogaster模型追踪健康细胞中的胱天蛋白酶功能，揭示其在细胞存活中的新作用。

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我们感谢 Polan Santos 和 Darren Obbard 为图 2a 提供的 Drosophila 插图，感谢 Marcelo Jacobs-Lorena 提供 JHMRI 昆虫饲养室的使用。本研究由生命科学研究基金会博士后奖学金（H.L.T.）、香港大学教育资助委员会 AoE/B-07/99（M.C.F.）以及美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NS096677、&#160;NS037402 和 NS083373（J.M.H.）资助。Ho Lam Tang 是生命科学研究基金会 Shurl 和 Kay Curci 基金会博士后研究员。

1. CaspaseTracker 果蝇的制备
<ol>
	<li>为准备用于实验的 CaspaseTracker (DQVD) 果蝇，进行如下杂交：UBI-CaspaseTracker × G-TRACE（UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi&#62;Stop&#62;GFP-nls），将7–10只携带由泛素启动子驱动的半胱天冬酶生物传感器底物mCD8-DIAP1-Gal435的雌性（或雄性） virgin 果蝇与相同数量的G-TRACE雄性（或雌性）果蝇一同转移。G-TRACE果蝇具有第二染色体CyO平衡子，以避免G-TRACE（UAS-RFP、UAS-FLP和Ubi&#62;Stop&#62;GFP-nls）纯合组合导致的致死性34。将果蝇置于装有新鲜酵母糊作为蛋白质来源的新鲜培养基小瓶中。</li>
	<li>在18 °C下培养果蝇5至7天（最长不超过2周），随后从瓶中移除亲代果蝇，以防止新孵化的子代过度拥挤，并用于建立新的繁殖小瓶。</li>
	<li>继续在18 °C下培养，直至子代果蝇羽化。选择具有正确CaspaseTracker基因型的非-CyO（非卷翅）子代，这些子代同时携带CaspaseTracker和G-TRACE转基因元件35。</li>
	<li>同时，平行培育对照用的非转基因亲本w118果蝇以及半胱天冬酶不敏感型（DQVA）果蝇，以验证CaspaseTracker的RFP和GFP荧光特异性。</li>
	<li>使用以下引物进行PCR基因分型，以确认携带CaspaseTracker的果蝇：5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC，3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA，扩增产物为3,897 bp。对G-Trace位点进行基因分型时，使用以下引物：GFP（474 bp），5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G，3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C；RFP（258 bp），5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG，3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC；Flpase（655 bp），5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG，3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C。对pUWR载体中的Gal4进行基因分型（554 bp），使用引物：5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAG TCA CGC，3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA。</li>
</ol>
2. 组织制备、染色与封片
<ol>
	<li>进行果蝇解剖时，为防止解剖组织粘附在塑料移液枪头和离心管上，需用溶于水的1%牛血清白蛋白（BSA）对枪头和离心管进行预处理。</li>
	<li>使用镊子在硅胶垫上进行果蝇解剖。
	<ol>
		<li>为避免在硬质表面上操作时损伤镊子尖端，应在硅胶表面进行组织解剖。制备硅胶解剖板时，按照商品化试剂盒说明书（材料列表）将硅胶融化，然后取3至4 mL加入直径为60 mm的组织培养皿中。硅胶培养皿可重复使用。</li>
		<li>用CO2麻醉一只果蝇，并将其转移至含有1 mL冷PBS的硅胶板上。使用吹管将CO2导入装有果蝇的样品管中，然后将麻醉后的果蝇转移至带有CO2供应的解剖垫上。</li>
		<li>用一对镊子夹住果蝇头部，另一对镊子向相反方向拉扯胸部，以将头部与体壁分离，同时不破坏头部与前肠之间的连接。</li>
		<li>使用两对镊子去除胸部的翅膀和腿。</li>
		<li>用一对镊子固定胸部，另一对镊子拉扯腹部，将其从胸部分离，同时不破坏前肠与中肠之间的连接。</li>
		<li>按照先前报道的方法解剖内部器官，包括脑、肠道、马氏管和卵巢。39-41</li>
		<li>用镊子去除所有体壁碎片和脂肪体，因为这些组织会产生强烈的自发荧光。制备完整器官系统需要耐心和练习。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将解剖得到的组织转移至1.5 mL离心管中，加入0.5 mL含4%多聚甲醛的PBS（磷酸盐缓冲液），在室温下避光旋转固定20至30分钟，以避免组织中RFP和GFP发生漂白。避免长时间固定，以免影响后续染色效果。</li>
	<li>轻轻吸去多聚甲醛溶液，用0.5 mL PBST（PBS + 0.1% Triton X-100）在室温下洗涤3次。</li>
	<li>在4 °C条件下，用0.5 mL PBST轻轻振荡透化组织过夜。较短的孵育时间可能导致透化不完全，影响染色结果。
	<ol>
		<li>若需降低背景染色，可考虑将组织在含1% BSA的0.5 mL PBST中孵育，而非使用PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用0.5 mL PBST在室温下洗涤组织3次。</li>
	<li>为染色细胞核和丝状肌动蛋白（F-actin），加入含10 µg/mL Hoechst 33342蓝色核染料和0.3 µM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-actin染料的0.5 mL PBST，与组织在室温下避光轻柔旋转孵育1小时。避免长时间染色，以防背景增强。
	<ol>
		<li>进行免疫染色时，将固定并透化后的组织在含0.1% Triton X-100的0.5 mL PBS中于4 °C孵育过夜，随后加入1:100稀释的抗ELAV抗体或1:200稀释的抗caspase-3抗体，在4 °C孵育过夜（300 µL）。接着加入相应二抗（1:100稀释），在室温下孵育1至3小时。具体抗体信息见材料列表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用0.5 mL PBST在室温下轻柔旋转洗涤组织3次，每次5分钟。</li>
	<li>用移液器吸尽所有PBST，然后加入200 µL抗淬灭封片剂（见材料），在室温下覆盖组织1至3小时，或在4 °C过夜。组织充分吸收封片剂后会沉降至管底，为最佳状态。</li>
	<li>用清水或70%乙醇预先清洁载玻片，然后将含封片剂的组织转移至载玻片上。</li>
	<li>小心地将盖玻片覆盖在组织上。在载玻片和盖玻片边缘涂抹凡士林，以防止过度压片损伤组织。用纸巾吸去多余的封片剂。</li>
	<li>用指甲油沿盖玻片四周边缘密封，防止封片剂从组织处泄漏。</li>
</ol>
3. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>使用倒置共聚焦落射荧光显微镜。然而，直立显微镜也可使用。利用拼图成像技术对组织进行成像时，需保持稳定的室温，以避免因显微镜组件的热胀冷缩导致焦距漂移和x-y平面偏移。环境控制系统和焦漂补偿系统有助于防止显微镜系统热平衡丧失所引起的问题。</li>
	<li>将载玻片放置在显微镜载物台上。先使用低分辨率（125 × 125 像素）拍摄几张测试图像，确定覆盖整个感兴趣区域（ROI）所需的合适图像拼接数量。</li>
	<li>设置显微镜扫描系统，以500 × 500像素的扫描分辨率采集图像。选择合适的物镜，例如20X NA 0.8或63X NA 1.4平场复消色差物镜，用于透过玻璃盖玻片分析组织，并确保每张图像（拼接块）在所有边缘重叠20%。</li>
	<li>设置激发波长从长到短的成像顺序，因为长波长光引起的光漂白程度较低。激发波长从长到短的顺序为：(i) 633 nm用于Phalloidin标记F-肌动蛋白和活化caspase抗体，(ii) 561 nm用于RFP，(iii) 488 nm用于GFP，(iv) 405 nm用于Hoechst核染色。</li>
	<li>成像过程中，应尽量减少细胞在荧光激光激发下的暴露时间，通过降低激光强度以避免光漂白，从而获得高质量的组织图像。</li>
	<li>图像采集完成后，使用显微镜软件将图像合并。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文阐述了CaspaseTracker的构建及其内部工作机制，该工具可用于检测健康组织中广泛存在的基础性caspase活性。体内检测非凋亡性caspase活性的关键步骤包括：1）构建携带生物传感器转基因的果蝇；2）通过适当的对照验证caspase特异性报告基因功能；3）练习解剖技术，以观察成年Drosophila的全部内部器官系统；4）区分生物传感器信号与自发荧光干扰信号。
为了防止生物传感器产生任何抑制半胱天冬酶（caspase）的活性，对作为caspase特异性传感器的天然可被caspase切割的多肽进行了改造。此外，还进行了其他修饰以避免Gal4转录因子的快速降解，并插入了表位标签。我们还描述了果蝇整体器官的解剖、免疫染色、样品封片以及利用共聚焦显微镜检测果蝇组织中非凋亡性caspase活性的方法。
尽管 CaspaseTracker 非常适合检测在低水平半胱天冬酶活性下存活的细胞，但它并不能实时报告酶活性，因为该生物传感器需要数小时才能被激活。然而，我们尚未确定其检测所需的最短时间，...

Caspase 是一类半胱氨酸蛋白酶，通过切割细胞内多种蛋白质中关键的天冬氨酸残基来介导细胞凋亡。例如，起始型 caspase 可激活效应型 caspase，解除对DNA核酸酶的抑制，切割细胞骨架组分，并改变细胞膜的脂质组成，从而迅速瓦解细胞，促进邻近细胞对死亡细胞的识别与吞噬清除1-4。据估计，人体每天有数十亿个细胞死亡，而凋亡是化疗诱导肿瘤细胞死亡的重要机制之一5。另一类 caspase 可通过不同于凋亡的途径引发细胞死亡，进而激活先天免疫反应6。因此，目前大多数关于 caspase 的研究主要集中在其促死亡功能上。
有趣的是，该领域的早期证据表明，同一种半胱天冬酶（caspase）在促进细胞死亡的同时，也具有非死亡相关的功能。开创性研究已证实，caspase参与健康细胞中多种多样的细胞功能，包括在胚胎发生过程中调控细胞增殖和迁移7-9。在果蝇（Drosophila）中，caspase参与精子细胞的个体化过程10,11，在小鼠中可阻断另一种坏死性凋亡（necroptotic）细胞死亡通路12,13，并在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中参与microRNA的加工过程14,15。在寿命可能最长的细胞——神经元中，caspase及其他凋亡相关分子机制被认为通过修剪突触末梢来调控神经元活性，这一过程被认为对加强其他突触以实现学习与记忆功能至关重要16-18。caspase可能通过引发微小神经突起的“微型凋亡”（mini-apoptosis）来促进突触修剪，而无需导致整个细胞死亡19。然而，caspase也可能具有与凋亡样事件无关的其他功能20,21。在生命与死亡中扮演双重角色的现象并非caspase所独有；BCL-2家族蛋白和细胞色素c在健康细胞中参与细胞能量代谢，但同时也是多种细胞应激所激活的核心凋亡通路的组成部分22-25。尽管尚未被证实，但从进化角度看，将日常功能与促死亡功能整合于同一分子之中，似乎合乎逻辑，这有助于及时清除不适合或不需要的细胞。
目前，非凋亡性caspase活性的分子机制尚不清楚，且在胚胎发育及成体组织中非凋亡性caspase活性的程度也尚未明确。一个主要挑战在于难以区分caspase的“日常功能”与“促死亡功能”。与凋亡和细胞焦亡过程中caspase活性通过蛋白水解级联反应被显著放大不同，caspase的“日常功能”预计发生在更低的酶活性水平，可能低于现有许多技术的检测阈值。
在本研究工作之前，已有其他研究者为不同目的开发了多种半胱天冬酶（caspase）生物传感器。SCAT生物传感器（例如，ECFP-DEVD-Venus）利用FRET技术快速检测培养细胞和动物组织中的实时caspase活性。26,27 当Apoliner（mCD8-RFP-DQVD-nucGFP）的质膜锚定位点被caspase切割后，其细胞核靶向的GFP部分会在数分钟内发生亚细胞重新定位。28 类似地，ApoAlert-pCaspase3-Sensor（NES-DEVD-YFP-NLS）在caspase切割后会从细胞质重新定位至细胞核。29,30 最近，iCasper 中的发色团被巧妙地改造为可在被caspase切割后发生荧光，从而实现在神经元中实时检测生物传感器的活性 果蝇 胚胎，但主要与发育性细胞死亡相关。31 通过免疫检测半胱天冬酶切割的CPV生物传感器形式，证明了嗅觉神经元在衰老过程中的半胱天冬酶依赖性死亡（例如， mCD8-PARP-Venus32,33 重要的是，通过敏感的免疫染色在培养神经元的树突棘中检测到活化形式的caspase-3，同时利用caspase依赖性的核染料CellEvent荧光报告分子在胞体中也检测到其活性，尽管存在光毒性问题，但细胞死亡被延迟至树突棘消除之后才发生。19 因此，需要开发新的半胱天冬酶生物传感器，以检测并追踪具有基础半胱天冬酶活性的细胞 体内.
为克服这些困难，我们开发了一种新型双色caspase生物传感器，命名为CaspaseTracker。该策略结合了一种改良版本的 果蝇 caspase敏感的Apoliner生物传感器28 与 果蝇 G-TRACE FRT 重组酶系统34 永久标记并追踪细胞 体内.35 Gal4激活的G-TRACE系统能够使极低水平的caspase激活CaspaseTracker，从而在曾发生caspase活性的细胞中表达细胞质RFP，并永久表达定位于细胞核的GFP。35 该系统可在整个动物生命周期内对活体动物的细胞进行标记 黑腹果蝇一种易于操作且被广泛应用的模式系统，用于研究半胱天冬酶（caspases）和细胞死亡。36-38

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;耗材与试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont 镊子，生物级，不锈钢</td></tr><tr><td>悬滴玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>玻璃载片</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H1399</td><td>DNA 染料</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A22284</td><td>肌动蛋白染料</td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td><td>发育研究杂交瘤库（DSHB）</td><td>抗体注册编号：&amp;nbsp;AB_528218&amp;nbsp;</td><td>用于染色黑腹果蝇（Drosophila）泛神经元 ELAV 蛋白</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>用于染色活化的 caspase-3 片段</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>用于保护荧光染料&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>用于保护荧光染料&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SylGard 182 硅胶弹性体套件</td><td>Dow Corning&amp;nbsp;</td><td>产品编号：0001023934</td><td>用于制作解剖板</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LSM780 共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>成像</td></tr><tr><td>Carl Zeiss 体视显微镜 Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; 解剖</td></tr><tr><td>AmScope 光纤双蛇形管显微镜照明器，150&amp;nbsp;W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>光源</td></tr></tbody></table>

体内 生物传感器追踪非凋亡性半胱天冬酶活性 果蝇

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

半胱天冬酶（caspases）通过其蛋白水解活性，在介导细胞凋亡性死亡过程中发挥关键作用。当细胞中半胱天冬酶的活性被激活至现有技术可检测的水平时，通常认为细胞将在短时间内发生凋亡。半胱天冬酶可切割多种功能性和结构性组分，从而在数分钟内导致细胞迅速而彻底的破坏。然而，越来越多的证据表明，在正常健康细胞中，相同的半胱天冬酶可能具有其他功能，推测其酶活性处于较低水平。目前，对非凋亡性半胱天冬酶活性的研究受到检测低水平酶活性以及追踪细胞最终命运的技术困难所限制。 体内在此，我们展示了超灵敏的半胱天冬酶（caspase）报告系统CaspaseTracker的应用，该系统可对完整生物体内经历过caspase活性的细胞进行永久性标记。 体内 双色CaspaseTracker生物传感器用于 黑腹果蝇 瞬时表达红色荧光蛋白（RFP）以指示近期或正在进行的caspase活性，而在过去任何时间点曾经历caspase活性但未死亡的细胞则永久表达绿色荧光蛋白（GFP）。重要的是，这种caspase依赖的 体内 生物传感器可快速揭示成年果蝇各器官系统组织中非凋亡性半胱天冬酶（caspase）活性的存在。通过整体解剖单只果蝇，可在健康细胞中检测到该生物传感器的活性，其分布遍及脑、肠道、马尔皮基氏管、贲门、卵巢导管及其他组织。CaspaseTracker能够检测长寿细胞中的非凋亡性caspase活性，因为即使在caspase激活后至少10天，仍可在成年神经元及其他组织中检测到生物传感器信号。该生物传感器是揭示活体动物中非凋亡性caspase活性功能及其分子机制的重要工具。

有两个关键组分使得 CaspaseTracker 能够在正常健康细胞中检测半胱天冬酶（caspase）活性（图1a）。其中第一个是一种由146个氨基酸组成的可被caspase切割的多肽，其设计参考了caspase生物传感器Apoliner（图1b).28 该多肽来源于 DIAP1（果蝇 凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis），含有一个天然存在的半胱天冬酶（caspase）切割位点，在凋亡过程中通常由caspase DrICE切割。42,43 DrICE 相当于哺乳动物中的caspase-3，可切割大多数已知的细胞底物。4,32 caspase 的特征是，DIAP1 及其衍生多肽在 caspase 识别序列 17-DQVD-20 内特定的天冬氨酸 Asp20 之后被切割，而将必需的 Asp20 残基突变为丙氨酸（DQVA）则可消除切割。42,43 与 Apoliner 类似，<su...

为了在整体动物中检测含有低水平半胱天冬酶（caspase）活性的健康细胞，研究人员为黑腹果蝇（Drosophila）开发了高灵敏度的生物传感器，命名为CaspaseTracker。在无死亡刺激条件下、经优化培养的成年动物体内各内脏器官的长寿健康细胞中，均可检测到依赖半胱天冬酶的生物传感器活性。

Caspase 是通过其蛋白水解活性介导细胞凋亡的关键效应分子。当细胞内 Caspase 被激活至可通过……检测到的水平时……

本实验的总体目标是利用黑腹果蝇（Drosophila Melanogaster）作为模型，在活体动物中检测并追踪非凋亡性半胱天冬酶（caspase）活性。半胱天冬酶是一类蛋白酶，可通过切割多种细胞组分引发细胞凋亡。因此，细胞中存在活化的半胱天冬酶通常被认为预示着细胞即将死亡。然而，越来越多的证据表明，引起细胞死亡的相同caspase在健康细胞中也具有正常的生理功能。这些caspase的日常功能包括调控神经元活性、线粒体功能，甚至抑制其他细胞死亡通路。研究caspase的这些日常功能主要存在两大困难。首先，通常情况下，半胱天冬酶（caspase）的基础活性水平低于现有技术的检测限。其次，即使能够检测到基础水平的caspase活性，也很难将其与即将导致细胞死亡的caspase活性区分开来。为了解决这一问题，我们开发了一种caspase示踪器：一种更为灵敏的caspase生物传感器，能够对经历caspase激活后仍存活的细胞进行永久性标记。该生物传感器将使我们能够检测并追踪具有非凋亡性caspase活性的细胞，并在活体动物中研究其功能。果蝇体内caspase追踪生物传感器系统由两个组分构成：caspase可激活的酵母转录因子Gal4，以及由Gal4激活的荧光报告系统G-Trace。将Caspase生物传感器果蝇与G-Trace果蝇杂交，以生成可报告caspase活性的CaspaseTracker果蝇，该活性以红色和绿色荧光显示。当生物传感器在DQVD序列处被活化的caspase切割时，Gal4从细胞膜上释放，从而在子代果蝇中检测到caspase活性。释放的Gal4转移至细胞核，并诱导红色荧光蛋白（RFP）的表达，直至caspase失活为止。然而，Gal4 也会诱导 FLP 重组酶的表达，导致细胞在其整个生命周期中持续表达定位于细胞核的 GFP。对照生物传感器在半胱天冬酶（caspase）切割位点处含有 DQVA 突变。实验开始时，将携带半胱天冬酶敏感型 Gal4 生物传感器的转基因果蝇与携带 G-Trace 荧光报告基因的果蝇进行杂交。将7至10只新生的生物传感器雌蝇与7至10只新生的G-Trace雄蝇配对，置于新鲜培养基的小瓶中。一个重要的阴性对照是该生物传感器的caspase不敏感版本，其caspase切割所必需的天冬氨酸残基存在单点突变。对照组果蝇采用相同的交配程序。设置杂交后，将试管置于18摄氏度环境中。在幼虫发育期间，于子代果蝇羽化前，将亲本果蝇转移至新的试管中以持续产生新的子代。当子代果蝇羽化后，收集具有直立、非卷曲翅膀的个体。该表型表明，这些果蝇同时携带半胱天冬酶生物传感器和荧光G-Trace报告基因的转基因。随后，按照既定方案解剖果蝇，以分离出半胱天冬酶追踪组和对照组果蝇完整的内部软组织。首先，准备不会黏附解剖组织的移液器吸头和离心管。为此，使用溶

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