Name: 透过玻璃看:时间推移显微镜和单细胞的纵向跟踪研究抗癌治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 了解时间推移显微镜技术，用于追踪HT1080和HeLa单细胞对抗癌治疗的实时反应。该方法揭示细胞异质性和药物疗效机制，为癌症研究提供重要的动态观察手段。

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感谢 Joshua Marcus 提供的技术支持，以及理查德·J·麦金托什光学显微镜核心设施主任 Jolien Tyler 博士提供的技术建议。本研究工作得到了科罗拉多大学博尔德分校和科罗拉多大学博尔德分校研究生院向 J.D.O. 提供的资金支持。R.T.B. 的部分资助来自美国国立卫生研究院（NIH）的博士前培训项目（T32 GM008759）。我们感谢 Karyopharm Therapeutics 公司提供的塞利尼索（selinexor）以及默克雪兰诺公司提供的驱动蛋白-5 抑制剂。FUCCI 质粒由日本理化学研究所（RIKEN）的 Atsushi Miyawaki 通过 MTA 提供。mCherry-BP1-2 来自 Addgene。表达 H2b-mCherry 和 β-微管蛋白-EGFP 的 HeLa 细胞由奥地利科学院分子生物研究所（IMBA）的 Daniel Gerlich 提供。

&#160;以下方案采用由实验所定义的参数 图4 和 6 关于采集设置和实验条件。许多参数可根据其他实验的需求进行调整（即， 曝光时间、像素合并、荧光通道 等等）。所有操作必须遵守机构指南和规定，并经机构生物安全委员会批准。显微镜制造商的网站提供了活细胞成像的优质信息。
1. 显微镜和成像软件
<ol>
	<li>在多种倒置显微镜上进行活细胞成像。最常见的显微镜类型包括宽场落射荧光显微镜和转盘共聚焦显微镜。此处使用配备200瓦金属卤化物光源的自动化电动宽场落射荧光显微镜。</li>
	<li>配备载物台顶部或显微镜内置的环境培养室。此处使用载物台顶部环境培养室。</li>
	<li>使用商业软件操作显微镜，并利用其功能执行延时显微成像。</li>
	<li>使用 commercially available software 或 ImageJ 进行图像分析。市面上还有多种其他分析工具，同时存在许多定制化程序，其中不少已被发表8,18。</li>
</ol>
2. 观察细胞过程与表型响应
<ol>
	<li>使用明场显微镜观察细胞。微分干涉差和相差显微镜单独使用时，即可为研究抗癌药物反应提供重要信息。这些过程可包括有丝分裂、细胞运动性和细胞凋亡。</li>
	<li>利用荧光生物传感器观察细胞结构、细胞器及细胞内过程。荧光探针可用于追踪特定的亚细胞过程，具有重要信息价值。这些过程可包括微管动力学、线粒体和内质网动力学、蛋白质积累与定位，以及分子信号传导（e.g., 磷酸化、钙离子信号）。</li>
</ol>
3. 样本制备
<ol>
	<li>在标准、加湿的细胞培养箱中，使用经细胞培养认证的培养皿培养细胞（例如，37 oC，5% CO2, 80% 相对湿度）。
	<ol>
		<li>在 MEM 培养基中培养 HT1080 细胞，并添加 EBSS。每 100 mL 培养基中补充 10 mL v/v FBS、1 mL v/v 青霉素-链霉素溶液、1 mL v/v 丙酮酸钠和 1 mL v/v 非必需氨基酸溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像前两天，在经认证的无菌层流罩中，将 50,000 个 HT1080 FUCCI 细胞接种至 12 孔 #1.5 玻璃底培养皿的 3 个孔中。根据实验起始时所需达到约 60% 汇合度调整接种细胞数量。根据细胞系和实验性质的不同，细胞密度可适当降低。 
	注意：细胞密度可能对细胞系的生长及实验结果产生显著影响。应进行细胞计数，以尽量减少因密度差异导致的实验间变异。
	<ol>
		<li>根据环境控制舱的类型及实验所需的条件，可将细胞接种于单孔培养皿（通常为 35 mm 或 60 mm）、4 孔 35 mm 培养皿、6 孔、12 孔或 24 孔细胞培养板，或各种规格的盖玻片载片。建议使用 #1.5 玻璃的玻璃底培养板，因为大多数物镜均针对此厚度的玻璃进行光学优化，而透过细胞培养塑料进行成像效果极差。 
		注意：某些细胞系在玻璃表面无法良好生长或存活。在此情况下，可通过包被处理增强细胞黏附性（例如，多聚赖氨酸或胶原蛋白）。部分公司生产可用于光学成像的细胞培养级塑料制品，是否适用需通过实验经验确定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 环境箱设置
<ol>
	<li>在进行任何实验之前，设置环境培养箱，使其保持约80%的湿度，并使样品位置的温度达到37 oC。大多数培养细胞在含有碳酸氢钠缓冲液的培养基中生长，因此需要5% CO2/平衡空气的气体环境。根据设备配置，可将环境控制器设定为5% CO2，由系统自动将100% CO2与空气混合，或直接使用预先混合并经过认证的5% CO2/平衡空气气体。请遵循制造商关于气体流速的指导说明。 
	注意：某些细胞系可在不含CO2的独立培养基中生长，此类细胞可在无CO2条件下维持培养。此外，也有专门设计的成像培养基，可减少自体荧光化合物的添加。特定细胞类型在这些培养基中的生长情况需事先通过实验经验确定。</li>
	<li>成像前，确保水箱已按照制造商说明用无菌蒸馏水加满。将环境培养箱开启并设定至所需温度，并将其放置于显微镜载物台的插槽中。为节约气体，此时暂不启动气体流动。 
	注意：若载物台顶部培养箱与载物台插槽之间存在空隙，或连接线缆对培养箱产生拉力，则可能在实验中引入运动伪影。
	<ol>
		<li>在将培养箱插入载物台插槽前，先在插槽开口边缘覆盖数层石蜡膜，以实现培养箱与载物台的耦合，并确保所有连接线缆不会对培养箱造成牵拉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让培养箱升温至37 oC并达到热平衡。保持温度稳定，以防止成像过程中温度波动，避免影响细胞生理状态并引起图像漂移。通常需要30 min&#160;到1小时才能达到温度平衡，具体时间取决于环境条件。
	<ol>
		<li>在预热过程中，将一个装有水的“模拟”培养皿插入培养箱中。装满水的成像皿可模拟实际样品，有助于确保培养箱充分预热并达到稳定状态。使用预热的无菌水填充培养箱，可缩短温度稳定所需时间，并在加入实验样品时最大限度减少温度下降。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 显微镜设置
<ol>
	<li>打开显微镜、相关计算机及任何所需的外围设备。
	<ol>
		<li>根据光源类型，可等待至需要时再开启（例如，LED）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将物镜转盘置于低位，选择将要使用的20X 0.7 NA物镜。</li>
	<li>将样品置于物镜上方——这有助于在样品放入腔室后更容易找到细胞。</li>
	<li>如果已知先前实验的成像参数，此时应进行设置。</li>
</ol>
6. 将细胞转运至显微镜并放入样品室
<ol>
	<li>将待成像的细胞从培养箱转移至环境控制腔室。此过程应迅速完成，以尽量减少较低的CO2浓度和温度下降对细胞的影响。转移过程中须遵守所有机构规定的生物安全指南，以防样本泄漏并做好相应的清理准备。
	<ol>
		<li>将细胞置于密封的泡沫塑料容器或保温袋中，以避免环境条件发生较大变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商的说明，将样本成像培养皿插入腔室内。</li>
	<li>在细胞被固定于环境控制腔室内后，密封腔室以维持稳定的环境，并立即开启气体气源。
	<ol>
		<li>由于某些环境控制腔室不使用紧密密封的盖子，为减缓蒸发，可在培养基表面覆盖一层无菌、适用于胚胎操作的矿物油。用透气的石蜡膜包裹样本培养皿的边缘，注意不要遮挡用于成像的玻璃区域。可采用局部辅助加湿方法。培养皿盖上的冷凝水可能会影响明场显微镜的成像性能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为尽量减少实验初期热漂移的影响，在开始延时成像前需等待30分钟&#160;。所需等待时间可能因成像培养皿的尺寸及其他因素而异，应通过实验确定。</li>
</ol>
7. 设置成像
<ol>
	<li>选择最能准确呈现数据的成像条件。通过缩短曝光时间、使用较低强度的光照以及选择可被较长波长光激发的荧光探针，以尽量减少光毒性。</li>
	<li>为每个待成像位置定义 x、y 和 z 平面以及所需的波长。时间分辨率受限于成像位置的数量和波长数量。对于大多数细胞过程的长期延时成像，建议每 10–20 分钟采集一次图像；更高的时间分辨率（较短的时间间隔，例如，1 分钟）可提供更多的数据点，从而实现更可靠的细胞追踪，但也会导致累积光照增加以及数据量增大。
	<ol>
		<li>由于 HT1080 FUCCI 细胞表达动态变化的绿色和红色荧光蛋白（见代表性结果），建议使用以下曝光时间：FITC/GFP - 50 毫秒，Texas Red/TRITC - 40 毫秒，明场 - 20 毫秒。使用 2 × 2 像素合并（binning）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在高级设置中启用软件控制的自动对焦功能，并采用默认参数。将自动对焦范围设为 10 µm，并使用推荐的步长。务必在开始延时成像前完成此设置。应使用明场图像进行自动对焦，切勿使用荧光图像，以减少光毒性和荧光漂白。
	<ol>
		<li>对于配备电动载物台的任何显微镜，均可使用软件控制的自动对焦系统，并直接对样本进行对焦。但此类系统可能限制实验的采集速度。硬件控制的连续对焦系统在延时显微成像中表现良好，可提高采集速度，从而支持更多位置的成像或更高的采集频率。然而，该系统依赖于空气-玻璃界面的检测，当孔板中玻璃厚度存在差异时，可能导致样本失焦。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一半培养基更换为已预热至 37 oC 并含有目标药物浓度的新鲜培养基。部分换液有助于减少热漂移。本实验中的处理条件包括：溶剂对照组（DMSO）、1 µM selinexor 和 10 µM PD0332991。 
	注意：此步骤也可在成像开始后通过暂停并重新启动实验来完成，从而实现对单个细胞在给药前后反应的纵向追踪。若关注药物稳定性或代谢问题，可采用相同方法暂停实验并更换培养基。为检测药物是否降解或发生代谢，还可将处理过的细胞的培养基转移至未经处理的 naïve 细胞，以检测其药理活性。</li>
	<li>开始延时成像。</li>
	<li>在延时成像过程中，确保成像视野保持对焦，且培养腔室维持在 37 oC 的湿润环境中。
	<ol>
		<li>可根据需要，在时间点之间的间隔暂停采集以调整对焦。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若实验时间较长，必要时可在腔室内添加水分。应避免腔室降温，添加的水必须为预热至 37 oC 的无菌蒸馏水。</li>
</ol>
8. 结束延时拍摄
<ol>
	<li>实验运行结束后，如果未设置自动停止，则需手动停止数据采集。</li>
	<li>确保延时成像数据已正确保存至硬盘；尽管大多数软件在采集过程中会自动保存，但如果未正常完成，数据仍可能丢失。</li>
	<li>从显微镜上取下培养腔室，并按照机构批准的生物安全规程，将细胞弃置于生物危害废物容器中。</li>
</ol>
9. 时间序列数据的纵向追踪与分析
<ol>
	<li>选择适合目标生物学过程的分析方法。目前已开发出许多适用于特定应用的 ImageJ 插件、基于 MatLab 的程序以及定制化平台。以下方法涵盖了细胞核追踪及核荧光探针分析，如文中所示。 图4 和 5.</li>
	<li>在 ImageJ 中打开用于各通道的 .tif 图像堆栈。或者，使用 Bioformats 插件在 ImageJ 中直接打开采集程序的原生文件。</li>
	<li>使用明场图像或细胞核标记通道（如使用）在单个细胞的细胞核内绘制感兴趣区域（ROI），并将其添加至ROI管理器。注意：如果成像细胞具有细胞核标记例如，组蛋白H2B-EGFP），则可利用自动细胞追踪技术随时间生成代表单个细胞核的感兴趣区域（ROIs）。</li>
	<li>进入下一个时间点，将感兴趣区域（ROI）定位在同一细胞核内。将该ROI添加至ROI管理器中。</li>
	<li>继续追踪并为单个细胞创建 ROI，直至发生细胞事件（有丝分裂、凋亡， 等等）或细胞无法再被追踪（即，移出视野或实验结束）。</li>
	<li>当通过细胞在视野中的整个时间段建立感兴趣区域（ROI）后，将其叠加到相应的荧光通道上。测量每个时间点各通道荧光的平均强度。保存ROI列表以供后续使用。
	<ol>
		<li>可在不同实验的应用中对选定区域（ROI）进行多种测量。点击“分析”→“设置测量值…”以打开菜单，选择分析方法例如，ROI 内的平均强度，总强度 等等.).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录单个细胞的细胞命运（例如，凋亡、分裂、存活）的同时进行追踪。这使得能够生成存活曲线并进一步进行群体分析。</li>
	<li>根据两个通道的平均强度，绘制散点图以展示细胞对治疗药物响应的细胞周期动态变化图5B，C). 
	注意：可针对随时间变化的单个细胞创建图表，也可对被追踪细胞群体的平均值进行绘图。定量成像对于揭示细胞在癌症治疗干预下的复杂响应及细胞间关系至关重要。长期延时显微成像、纵向细胞追踪及数据分析是一个多步骤过程，涉及多种显微镜类型和分析工具的选择，其总体流程遵循下述概要方案。 图1.</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

延时显微镜与纵向追踪的优势
显微镜是进行药物反应纵向研究的理想工具，因为它使研究人员能够追踪单个细胞及其命运，同时也能观察整个细胞群体。细胞群体内药物反应的异质性是抗癌治疗设计中的一个主要问题。对单个细胞进行长期追踪，可使研究人员观察到这种异质性，并开始理解其与细胞群体相关的潜在机制和后果。利用多种荧光探针，可以多角度地观察和理解常见及罕见的反应表型。例如，可以了解不同细胞命运对群体反应的时间动态和贡献、特定表型与命运之间的关系，以及不同细胞系之间或处理状态下反应的差异。许多与癌症相关的过程均可通过该方法进行研究。本文未重点提及的一些例子包括：使用凋亡、自噬和坏死报告系统研究细胞死亡39-42、细胞侵袭43,44，以及决定细胞命运的p53动态变化27。此外，该方法不仅限于抗癌药物治疗的研究，还可应用于其他多种生物学过程的研究，例如有丝分裂45、细胞骨架动态46,47和细胞内信号传导48。
<p class="j...

活细胞显微镜观察与单细胞的长期追踪并非新技术。自最早的显微镜问世以来，科学爱好者和研究人员便已开始观察和研究单个细胞及生物体，以及它们的行为与发育过程1-3。20世纪50年代范德比尔特大学已故的大卫·罗杰斯（David Rogers）曾拍摄到一个著名实例：在血涂片中，一个人类中性粒细胞追逐金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），并最终完成吞噬过程4。这段活细胞影像极好地展示了如何在单次实验中同时观察并关联多个生物学过程：化学梯度的感知、细胞运动的力学机制与速度、细胞形态的动态变化、黏附作用以及对病原体的吞噬作用。
全自动显微镜和高灵敏度数字相机的出现，使得越来越多的研究人员开始利用显微技术探讨细胞生物学中的基本问题，例如细胞如何运动5,6 并分装7,8 细胞器动力学和膜运输9-11非荧光的明场显微镜技术，包括1953年因弗里茨·泽尼克（Frits Zernike）的贡献而获得诺贝尔奖的相衬显微技术（PC），以及微分干涉差显微技术（DIC），可用于观察细胞和细胞核，也可用于观察微管束、染色体、核仁、细胞器动态以及较粗的肌动蛋白纤维等亚细胞结构。12基因编码的荧光蛋白以及针对细胞器的荧光染料的开发极大地推动了活细胞延时显微成像技术的发展13-15虽然不是本文的重点，但在细胞球状体中的成像以及 原位 （活体显微成像）采用共聚焦显微镜和多光子显微镜是该方法的另一拓展，已有大量优秀文章使用并讨论了这些技术方法16-19.
细胞对抗癌药物或天然产物的反应是在分子和细胞水平上决定的。理解处理后细胞的反应和命运通常涉及群体平均检测方法（例如，免疫印迹、整孔检测），或通过免疫荧光检测和流式细胞术在固定时间点进行的单细胞测量。在细胞群体中，尤其是肿瘤中，单个细胞对药物反应的异质性可能解释了在相同饱和浓度药物处理下不同细胞系和肿瘤之间所观察到的反应差异。长期纵向追踪特定单个细胞或细胞群体的方法虽不常见，但极为强大，可直接研究分子反应通路、不同表型（例如，细胞死亡或细胞分裂）、群体内细胞间的变异性，以及这些因素如何共同影响群体反应动态20-22。乐观地看，能够观察并量化单细胞反应将有助于加深我们对药物作用机制、失败原因以及如何最优使用药物的理解。
长期延时显微成像、纵向追踪及药物反应分析技术已为众多研究者所采用，且操作简便，仅需利用透射光即可观察表型响应20,21。该方法的主要组成部分包括：目标细胞的适当制备、配备环境控制舱的自动化显微镜、与计算机集成的相机以采集和存储图像，以及用于回放延时图像并测量和分析细胞及任何荧光生物传感器的软件。我们提供了一份详细的实验方案，其中包含大量实用技巧，可用于在明场和/或宽场落射荧光显微镜下对培养细胞进行持续数天的延时显微观察。该方案适用于任何可在体外培养的细胞系，以研究其对抗癌治疗的反应。我们展示了利用多种不同基因编码的荧光生物传感器所获取和分析的数据示例，并提供了相差显微镜的一个实例，简要讨论了不同类型探针的特点、长期延时成像与纵向追踪的优缺点、通过该方法所能获得而传统间接方法难以揭示的信息，以及一些可能对尚未尝试该技术的新手研究者和有经验的研究者均具参考价值的技术变体。

<table><tbody><tr><td>紫杉醇（Paclitaxel）</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>微管稳定药物</td></tr><tr><td>依托泊苷</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>拓扑异构酶II抑制剂</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>XPO1/CRM1抑制剂，赠品</td></tr><tr><td>驱动蛋白-5抑制剂</td><td>Merck Serono</td><td>na</td><td>赠品，也可从American Custom Chemicals Corporation获得。CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>细胞培养基</td><td>HyClone (Fisher) 或 Mediatech</td><td></td><td>多家公司有售</td></tr><tr><td>5% CO2/空气平衡气体，经认证</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿，20 mm 玻璃底</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>多家公司有售</td></tr><tr><td>35 mm 4孔培养皿，20 mm 玻璃底</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>多家公司有售</td></tr><tr><td>35 mm 培养皿，带网格玻璃底</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>多家公司有售</td></tr><tr><td>多孔板，玻璃底</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>多家公司有售</td></tr><tr><td>Olympus IX81 倒置落射荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB 控制器</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III 电动载物台</td><td>Prior Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV 培养室</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>环境控制器单元</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD 及控制器</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon 激光发射装置</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA 光源引擎</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT 培养室</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

透过表象：利用延时显微镜与单细胞纵向追踪研究抗癌治疗药物

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

单个细胞对抗癌药物的反应在决定群体反应中起着重要作用，因此是最终治疗效果的主要影响因素之一。免疫印迹、流式细胞术和固定细胞实验常被用于研究细胞对抗癌药物的反应。这些方法虽然重要，但仍存在若干局限性。由于癌细胞与正常细胞之间、不同来源的癌细胞之间在药物反应上存在差异，且部分反应具有短暂性或稀有性，若依赖群体平均化检测方法，且无法对细胞进行长期直接追踪与分析，则难以全面理解这些现象。显微镜特别适用于活细胞成像。技术的进步使我们能够常规地以高分辨率对细胞进行成像，不仅可实现细胞追踪，还能观察多种细胞反应。本文详细描述了一种可在药物处理期间对细胞进行持续延时成像的方法，成像时间可根据需要尽可能延长，通常可达96小时；通过该方法的变体，甚至可将细胞监测数周。结合使用基因编码的荧光生物传感器，可同时追踪多种细胞过程、信号通路及生物学反应。我们展示了若干应用实例，包括细胞生长与细胞周期进程的追踪与定量、染色体动态变化、DNA损伤以及细胞死亡的监测。此外，我们还讨论了该技术的多种变体及其灵活性，并指出了某些常见的技术误区。

长期延时显微镜观察与直接纵向追踪可用于研究药物反应过程中多种抗癌效应。根据图1中的总体流程，展示了多个表达经验证荧光报告基因的细胞示例，这些细胞经抗癌药物处理后，通过不同方法进行追踪与分析。
仅使用相差显微镜即可获得大量信息，能够可靠地反映细胞间期与有丝分裂期的区别、有丝分裂持续时间及阻滞、异常细胞分裂以及细胞死亡21,23,24。靶向细胞分裂过程的药物，通常称为抗有丝分裂药物，目前仍在持续开发中。图2以及视频1和2展示了两株配对的乳腺癌来源MCF7细胞系在p53状态不同情况下的示例，这些细胞经500 nM浓度的抗癌药物处理，该药物靶向并抑制有丝分裂马达蛋白Kinesin-5（KSP1, Kif11, Eg5），导致有丝分裂延长20。野生型MCF7细胞（图2A）是研究p53依...

本文介绍了一种长期延时显微镜方法，用于纵向追踪单个细胞对抗癌治疗药物的反应。

单个细胞对抗癌药物的反应在决定群体反应中起着重要作用，因此是影响治疗效果的主要因素之一。

本实验的总体目标是在培养的单细胞水平上观察抗癌治疗的反应。该方法可解答癌症研究领域中的一些关键问题，包括治疗反应的异质性以及细胞命运的决定。首先，在经过认证的无菌超净工作台内，根据文本方案在经过培养认证的培养皿中制备 HT1080 细胞，并将细胞置于加湿的细胞培养孵育箱中孵育。成像前两天，将50,000个HT1080 FuGENE细胞接种至12孔玻璃底培养皿（1.5号盖玻片）的每个孔中。根据细胞的生长速度和所用培养皿的规格，调整接种细胞数量，使实验开始时细胞汇合度约为60%。按照制造商的说明，将环境箱的湿度设置为约80%，并将样品位置的温度设为37摄氏度。确保水箱中装有无菌蒸馏水。然后将环境箱开启至设定的温度，并将其放置在显微镜载物台上并进行设置。如果载物台顶部腔室与载物台嵌入部分之间存在任何空隙，请在将腔室插入之前，先在载物台嵌入开口的边缘覆盖几片石蜡膜，以实现腔室与载物台的耦合。确保没有任何连接线对腔室产生牵拉，这些因素均可能引入运动伪影。将装有水的空白培养皿插入腔室内，使腔室温度平衡至37摄氏度，随后维持温度稳定。进行成像前的准备工作时，打开显微镜、计算机及所有必要的外设。根据光源类型，可等待至需要时再开启光源。将物镜转换器调至低位，选择20倍、数值孔径为0.7的物镜。然后将样本置于物镜上方，以便在样本放入腔室后更容易找到细胞。根据文本方案，将待成像细胞转移至环境腔室后，密封腔室以维持稳定的环境，并开启气体环境。接下来，选择成像条件，通过限制曝光时间并使用较低强度的光照，以避免光毒性。确定每个成像位置的X、Y和Z平面以及所需的波长。对于大多数细胞过程的长期延时成像，每隔十到二十分钟采集一次图像。更高的时间分辨率可提供更多的数据点和更可靠的细胞追踪，但会导致累积的光暴露增加，并产生更大的数据集。由于 HT1080 FuGENE 含有动态的绿色和红色荧光蛋白，因此请使用以下曝光时间，并采用 2×2 binning 模式。在高级设置中，使用默认参数启用软件控制的自动对焦功能。将自动对焦范围设为 10 微米，并采用推荐的步长。在实验培养皿中，为减少热漂移，将一半培养基替换为已预热至 37 摄氏度的含目标药物的培养基。最后，启动延时成像，并根据正文方案采集图像。这些视频展示了两株配对的乳腺癌来源 MCF7 细胞系在 p53 状态不同的情况下，经抗肿瘤药物处理后的示例；该药物抑制驱动蛋白-5，导致有丝分裂停滞。如图所示，当通过稳定的p53敲低去除p53后，细胞在退出有丝分裂后不再发生周期阻滞，而是进入重复的细胞周期，继续进行第二轮有丝分裂而非阻滞，并在未发生分裂的情况下退出有丝分裂。图中展示的是来源于宫颈癌的Hela细胞，这些细胞稳定表达与mCherry融合的染色质标记物组蛋白2b以及与EGFP融合的β微管蛋白。当用微管稳定药物紫杉醇处理时，有丝分裂过程中的染色体排列和分离受到破坏，导致核膨出和易发生DNA损伤的微核形成。该细胞系稳定共表达两种荧光泛素细胞周期指示剂，其中 CDT1 为橙色，geminin 为绿色，细胞可正常进行细胞周期。当对相同细胞使用 CDK4/6 抑制剂处理时，细胞可正常通过 G2 期并完成分裂，随后在 G1 期发生强烈阻滞，表明该方法在生长中的肿瘤中具有产生有效细胞静止效应的潜力。该技术的主要优势在于，可直接、实时地连续数天追踪单个细胞的反应，而非通过间接推断获得结果。

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透过玻璃看：时间推移显微镜和单细胞的纵向跟踪研究抗癌治疗

本视频展示了一种在小鼠模型中追踪双特异性抗体诱导T细胞向肿瘤迁移的方法。将经荧光素酶转导的效应T细胞注射到皮下移植肿瘤异种移植物的小鼠体内。随后引入双特异性抗体，使其同时结合T细胞和肿瘤细胞。通过生物发光成像追踪T细胞的定位，信号强度反映T细胞浸润肿瘤的程度。...

一种体内追踪双特异性抗体诱导T细胞向肿瘤迁移的技术

我们描述了一种高通量单细胞检测方法，用于测量T细胞与肿瘤靶细胞共孵育时的细胞毒性。该方法采用高密度的弹性体微孔阵列（每个阵列约10万个亚纳升级微孔），将T细胞与靶细胞以特定比例在空间上进行限定，并结合荧光显微镜技术，实时监测效应细胞与靶细胞的结合以及后续的细胞凋亡过程。...

T细胞的定量高通量单细胞细胞毒性检测方法

本方案描述了利用多光子显微镜对多细胞相互作用进行长时间实时延时成像的方法。 体内...

延长时程活体成像技术用于实时观察肿瘤微环境中多细胞动态变化

本方案描述了一种对人肺肿瘤组织切片中经荧光标记抗体标记的驻留性肿瘤浸润CD8 T细胞进行成像的方法。该技术可利用共聚焦显微镜对CD8...

体外 利用共聚焦显微镜成像人肺癌组织切片中的驻留性CD8 T淋巴细胞

体内免疫荧光定位（IVIL）方法可用于研究抗体及抗体偶联物在活体生物体内的生物分布，该方法结合了体内肿瘤靶向与离体免疫染色技术，适用于肿瘤学研究。...

体内免疫荧光定位法评估治疗性和诊断性抗体在癌症研究中的生物分布

本实验方案的目的是展示如何利用晶格光片显微镜对活细胞中表面受体的动力学过程进行四维可视化观察。此处展示的是CD4+原代T细胞上的T细胞受体。...

使用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学

本研究对巨噬细胞针对癌细胞（特别是4T1小鼠乳腺癌细胞）的吞噬活性进行了成像。通过荧光显微镜与微分干涉差显微镜联用，建立并观察了活细胞共培养模型。利用成像软件对这一评估过程进行成像，生成了多点时间延时视频。...

共培养体系中M1型巨噬细胞与4T1小鼠乳腺癌细胞吞噬活性的延时二维成像

本文介绍了一种在小鼠肿瘤异种移植模型中研究抗体体内定位的实验方案。...

分析靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤及组织中的分布

本研究介绍了一种应用于儿童弥漫性中线胶质瘤细胞系的活细胞三维免疫细胞化学技术方案，可用于实时研究动态过程（如三维细胞侵袭和迁移）中细胞质膜上蛋白质的表达情况。...

儿童弥漫性中线胶质瘤的活体三维细胞免疫细胞化学检测

在此，我们介绍一种将荧光素酶转导至人T细胞的方法，以促进 体内 在评估T细胞结合型双特异性抗体抗肿瘤疗效及作用机制的研究中，对双特异性抗体诱导的T细胞向肿瘤迁移的追踪...

利用荧光素酶转导的人源T细胞追踪双特异性抗体诱导的T细胞迁移

本方案描述了单抗体标记法（SAL），用于解析质膜蛋白的纳米级空间分布。通过利用单分子水平上的抗体-表位累积相互作用，膜蛋白单抗体标记法（mSAL）可在原生细胞环境中同时绘制局部表位分布图并捕获抗体结合行为。...

使用单抗体标记法对膜蛋白进行单分子定位显微成像

了解时间推移显微镜技术，用于追踪HT1080和HeLa单细胞对抗癌治疗的实时反应。该方法揭示细胞异质性和药物疗效机制，为癌症研究提供重要的动态观察手段。

透过表象：利用延时显微镜与单细胞纵向追踪研究抗癌治疗药物

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