使用光纤实现液滴微流控的多色荧光检测

本实验的总体目标是展示一种利用光纤进行液滴微流控荧光检测的简单应用。该方法有助于回答高通量生物筛选中的关键问题，例如稀有表型的鉴定以及酶的定向进化。该技术的主要优势在于，它能够在液滴微流控中实现简单且低成本的荧光检测应用。

首先，将一片预先清洗干净的直径为三英寸的硅片放置在旋涂机的真空吸盘上。然后，在硅片中心滴加一毫升 SU-8 3050 光刻胶，并旋转硅片，形成厚度为 80 微米的光刻胶层。将涂覆好的硅片从旋涂机上取下，置于预热至 135 摄氏度的加热板上。

30分钟后，取下晶圆，使其冷却至室温。接着，将晶圆放置在平坦表面上，将第一层掩模与晶圆对准。在365纳米、190毫瓦的平行LED光源下照射晶圆3分钟。

曝光后，将晶圆置于135°C的热板上加热1分钟，然后使其冷却至室温。冷却后，将晶圆重新放置到旋涂仪上，并固定在卡盘上。在晶圆中心再施加1毫升SU-8 3050光刻胶，以500 r.p.m.转速旋涂20秒。

随后在5,000 r.p.m.转速下离心30秒。接下来，将晶圆放在热板上烘烤。待其冷却至室温后，再将其放回掩模对准表面。

使用解剖显微镜手动将第二层掩模与晶圆上的对准标记对齐。对齐完成后，在与之前相同的条件下对涂覆的晶圆进行曝光，持续 4-1/2 分钟。曝光后，将晶圆置于 135 摄氏度的热板上加热 1 分钟，然后冷却晶圆并重新固定到旋涂仪上。

第三次在晶圆上涂覆1毫升SU-8 3050，并通过旋涂增加100微米的光刻胶层。取下晶圆，在135摄氏度的加热板上烘烤30分钟。然后冷却至室温，将其放置在对准表面上。

将第三层掩模与之前的图形对齐，并使用之前的条件曝光涂覆好的晶圆，持续九分钟。曝光后，将晶圆置于135摄氏度的热板上加热一分钟，然后冷却至室温。冷却后，通过将晶圆浸入搅拌状态的显影液中30分钟来完成掩模的显影。

最后，用异丙醇清洗晶圆，然后在135摄氏度的热板上再进行一次最终烘烤，持续一分钟。将制备好的母模存放于100毫米的培养皿中，直至进行 molding。在塑料杯中将50克硅胶基体与5克固化剂混合，配制成10:1的PDMS混合物。

使用旋转工具混合内容，然后将混合物放入干燥器中脱气30分钟，或直至所有气泡完全去除。将脱气后的PDMS浇注到制备好的母模上，形成三毫米厚的涂层。随后，将培养皿重新放入干燥器中进一步脱气。

待所有气泡完全排除后，将装置置于80摄氏度下烘烤80分钟。冷却后，使用解剖刀从模具上切割下装置，确保装置侧面可同时接触到120微米和220微米的远端几何结构。随后使用0.75 mm的活检打孔器冲出流体入口和出口。

将器件带有微结构的一面朝上放置，同时将一块预先清洗过的载玻片放入等离子清洗仪中，在300瓦功率下使用1毫巴氧气等离子体处理20秒。将PDMS器件的图案面紧密贴合到经等离子处理的载玻片表面，完成键合。随后，将器件置于80摄氏度的烘箱中，对组装好的器件烘烤40分钟。

烘烤后，使用注射器将含氟表面处理液注入装置以冲洗，从而使微通道具有疏水性。随后立即在80摄氏度下烘烤装置10分钟，以蒸发溶剂。准备两根激光激发光纤，去除光纤末端最后5毫米的绝缘层。

同时，准备用于收集荧光信号的光纤：将一根较粗的光纤末端最后5毫米的绝缘层去除。在显微镜下检查所有光纤的端部。如果光纤端部不是平整的表面，需使用光纤刻划刀重新切割端面。

接下来，将激光光纤耦合器连接至一个50毫瓦、405纳米的激光器，并将一根105微米纤芯的光纤连接到该激光器上。将激光功率计传感器的裸露端对准激光输出，利用激光耦合器的微调装置调节，以最大化检测到的激光功率。使用一个50毫瓦、473纳米的激光器，以相同的方法调节另一根光纤。

然后，使用透镜筒将四通道带通滤光片安装到光电倍增管上，以阻断激光并透过发射的荧光。连接光纤耦合器，使光在到达光电倍增管之前先通过滤光片。接着，将收集光纤连接至光纤耦合器。

将制备好的微流控芯片放置在倒置显微镜的载物台上，显微镜需配备数字相机，其快门速度至少可达100微秒。从两侧小心操作，将连接473纳米激光器的光纤插入最上游的120微米通道中，注意避免刺穿至主流动通道。

然后，将连接至405纳米激光器的光纤插入最下游的120微米高侧通道中，光纤间距为300微米。最后，将连接较大光电倍增管的光纤插入垂直于两条激光激发光纤的220微米高通道中。用5毫升注射器吸入含2%离子型氟表面活性剂的HFE 7500，并使用PE2管将其连接至检测装置的隔离油入口。

接下来，用混合了FITC和蓝色染料的乳液填充注射器，并将其安装在垂直放置的注射泵上，通过PE2管路连接至装置的液滴重注入入口。将一段PE管路从装置出口连接至废液容器。然后，启动两个泵，均以每小时1,000 µL的流速运行，直至在装置内观察到油相和液滴稳定地融合并沿下游流动，完成装置的预运行。

调节流速，使间隔油以 6,000 微升每小时流动，液滴以 100 微升每小时流动，从而在液滴通过检测区域时提供足够的间距。然后，打开激光器并启动数据采集程序。接着，调节光电倍增管增益，使信号强度超过基线噪声水平的 100 倍。

最后，调节激光功率，使所有双峰在单个线性时间轨迹上清晰可见。当液滴流经检测通道时，会依次经过每个激光耦合光纤前方的离散激发区域。检测光纤记录下带有时间偏移的荧光信号，其峰间距与液滴从一个激发区域移动到下一个区域所需的时间相对应。

这消除了对进一步光学滤波和独立的光电倍增管的需求。通过检测含有在405纳米和473纳米处激发的染料的混合乳液，验证了该检测方案的有效性。该图显示，当流动频率约为50赫兹时，四种重新注入的液滴类型之间呈现出清晰的分离。

通过测量仅含荧光素的液滴，研究了检测器的动态范围和绝对灵敏度。数据表明，该系统能够检测从 0.1 到 100 纳摩尔的染料浓度。观看本视频后，您应能充分理解如何利用一组插入式光纤和单个光电探测器构建一个简单且紧凑的荧光检测系统。