使用多色荧光检测液滴微流控光纤
May 5th, 2016
液滴微流控中的多色荧光检测通常涉及笨重而复杂的落射荧光显微镜检测系统。在这里，我们描述了一种紧凑的模块化多色检测方案，该方案利用光纤阵列对单个光电探测器收集的多色数据进行时间编码。
该程序的总体目标是展示使用光纤进行液滴微流体荧光检测的简单应用。该方法可以帮助回答高通量生物筛选中的关键问题，例如稀有表型的鉴定和酶的定向进化。该技术的主要优点是它允许在液滴微流体中简单且廉价地进行荧光检测。
首先，将预清洁的 3 英寸直径的硅晶片放在旋涂机的真空吸盘上。然后，在晶圆中心涂上一毫升 SU-8 3050，并旋转晶圆以提供一层 80 微米厚的光刻胶。从旋涂机上取下涂布的晶圆，并将其放在预热至 135 摄氏度的热板上。
30 分钟后，取出晶片，让它冷却回室温。接下来，将晶圆放在平坦的表面上，并将第一层掩模对准晶圆。将晶圆在 190 毫瓦准直、365 纳米 LED 下曝光 3 分钟。
曝光后，将晶圆放在 135 摄氏度的加热板上 1 分钟，然后让它冷却回室温。冷却后，将晶圆放回旋涂机上，并将其固定在卡盘上。在晶圆中心再涂抹一毫升 SU-8 3050，并以 500 rpm 的速度旋转 20 秒。
然后是 30 秒，转速为 5， 000 rpm。接下来，在加热板上烘烤威化饼。让它冷却回室温，然后将其放回面罩对齐表面上。
使用解剖镜手动将第二层掩膜与晶圆上的图案对齐标记对齐。正确对齐后，使用与之前相同的条件将涂层晶圆暴露 4-1/2 分钟。曝光后，将硅片放在 135 摄氏度的热板上 1 分钟，然后冷却硅片并将其放回旋涂机上。
第三次将 1 毫升 SU-8 3050 涂在晶圆上，然后旋转以额外添加 100 微米的光刻胶。取出威化饼，在 135 摄氏度的热板上烘烤 30 分钟。然后，将其冷却至室温并将其放在对齐表面上。
将第三层掩模与之前的几何形状对齐，并使用之前的条件曝光涂层晶圆 9 分钟。曝光后，将晶圆放在 135 摄氏度的热板上 1 分钟，然后冷却至室温。冷却后，将晶片浸入浸入浸渍显影液中 30 分钟，显影掩模。
最后，用异丙醇清洗晶片，然后在 135 摄氏度的热板上最后一次烘烤 1 分钟。将显影的母版储存在 100 毫米培养皿中直至成型。通过在塑料杯中混合 10 克硅基和 50 克固化剂来制备 PDMS 的 50：1 混合物。
用旋转工具混合内容物，然后在干燥器内对混合物脱气 30 分钟，或直到去除所有气泡。将脱气的 PDMS 倒在准备好的母版上，得到 3 毫米的厚度。然后，将培养皿放回干燥器中以进一步脱气。
去除所有气泡后，将设备在 80 摄氏度下烘烤 80 分钟。冷却后，使用手术刀从模具中切下设备，以便可以从设备侧面接触到 120 微米和 220 微米的遥测几何形状。然后用 0.75 mm 活检打孔器对流体入口和出口进行打孔。
在300 瓦等离子清洗器中，将功能面朝上的设备与预先清洁的载玻片和 1 毫巴氧气等离子体一起处理 20 秒。通过将 PDMS 装置的图案化面牢固地放在载玻片的等离子体处理面上，粘合装置。然后，将设备放入 80 摄氏度的设备烤箱中，并将组装好的设备放回 40 分钟。
烘烤后，使用注射器用含氟表面处理液冲洗设备，使通道疏水。然后，立即将设备在 80 摄氏度下烘烤 10 分钟以蒸发溶剂。通过去除光纤最后 5 毫米的绝缘层来准备两根激光激发光纤。
此外，通过去除较大光纤最后 5 毫米的绝缘层来准备用于收集荧光信号的光纤。在显微镜下检查所有纤维的尖端。如果尖端没有末端平坦，请用光纤划线器固定末端。
接下来，将激光光纤耦合器连接到 50 毫瓦、405 纳米激光器，并将其中一根 105 微米纤芯光纤连接到激光器。将激光功率计传感器的剥离端对准，并使用激光耦合器的微调来最大化激光功率。执行相同的过程，使用 50 毫瓦、473 纳米激光器调谐另一根光纤。
然后，使用透镜管在光电倍增管上安装四带通滤光片，以阻挡激光并透射发射的荧光。连接光纤耦合器，使光线在撞击光电倍增管之前穿过滤光片。接下来，将收集光纤连接到光纤耦合器。
将制造的微流控芯片放在倒置显微镜的载物台上，该显微镜与能够达到至少 100 微秒快门速度的数码相机耦合。从侧面小心地工作，将耦合到 473 纳米激光器的光纤插入上游最远的 120 微米通道。注意不要刺穿主流通道。
然后，将耦合到 405 纳米激光器的光纤插入最远的下游 120 微米高侧通道，提供 300 微米的光纤间距。最后，将较大的光电倍增管耦合光纤插入垂直于两根激光激发光纤的 220 微米高的通道中。将装有 2% 离子含氟表面活性剂的 HFE 7500 装满 5 毫升注射器，并使用 PE2 管将其安装到检测装置的储油口。
接下来，用混合的 FITC 和蓝色染料乳液填充注射器，并使用 PE2 管将其安装在垂直方向的注射泵上，作为液滴再注射入口连接到设备。将一段 PE 管从设备出口连接到废液容器。然后，以每小时 1， 000 微升的速度运行每个泵，直到看到油和液滴在设备中定期混合并流向下游。
调整流速，使间隔油以每小时 6， 000 微升的速度运行，液滴以每小时 100 微升的速度运行，从而在通过检测区域的液滴之间提供很大的间距。然后，打开激光器并启动数据采集程序。接下来，调整光电倍增管增益，以提供超过基线本底噪声 100 倍的信号。
最后，调整激光功率，使所有双合峰在一条线性缩放的时间轨迹上清晰可见。流经检测通道的液滴在每根激光耦合光纤前面遇到离散的激发区域。检测纤维以时间偏移记录发射的荧光，其峰值分离与液滴从一个激发区域移动到下一个激发区域所需的时间相关。
这消除了对进一步滤光和单独光电倍增管的需要。通过检测含有在 405 纳米和 473 纳米激发染料的液滴的混合乳液来测试检测方案的有效性。该图显示了当以大约 50 赫兹的速度流动时，四种重新注入的液滴类型之间的明显分离。
通过测量仅荧光素液滴来研究检测器的动态范围和绝对灵敏度。数据显示，该系统能够检测 0.1 至 100 纳摩尔的染料浓度。观看此视频后，您应该对如何利用插入的光纤阵列和单个光电检测器来实现简单而紧凑的荧光检测系统有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种用于液滴微流体学的紧凑型模块化多色荧光检测方案。该方法利用光纤阵列对多色数据进行时间编码，简化了检测过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 荧光检测
- 液滴微流体学
- 生物筛选
背景
- 传统的多色荧光检测系统体积庞大且复杂。
- 生物应用需要更简单和更具成本效益的解决方案。
- 光纤可以为荧光检测提供一种新的方法。
- 这种技术可以促进高通量筛选和酶进化研究。
研究目的
- 展示荧光检测在液滴微流体学中的简单应用。
- 解决生物筛选中的关键问题，例如识别稀有表型。
- 提供一种廉价的荧光检测方法。
使用的方法
- 使用旋涂机准备硅片。
- 应用SU-8 3050光刻胶创建一层。
- 在热板上加热涂层硅片以固化光刻胶。
- 利用光纤进行多色数据收集。
主要结果
- 该方法允许有效的多色荧光检测。
- 与传统系统相比，它简化了过程。
- 该技术具有成本效益且易于实施。
- 它支持高通量生物筛选应用。
结论
- 这项研究提出了一种用于液滴微流体学中的荧光检测的新方法。
- 使用光纤增强了数据收集的效率。
- 该方法对生物研究和筛选具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method addresses the need for compact, cost-effective fluorescence detection in droplet microfluidics, enabling high-throughput screening for rare phenotypes and enzyme evolution. By using optical fibers to temporally encode multicolor signals, it eliminates complex optical filtering, reducing system complexity and maintenance burden. This supports early discovery workflows where scalable, reproducible assays are critical for target validation and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through multiplexed fluorescence readouts in droplet-based assays.
- Operational Value: Provides a simple, inexpensive platform for screening large libraries to identify rare functional variants.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening with quantitative, temporally resolved fluorescence data to de-risk target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated droplet assays for downstream screening by enabling detection of multiple fluorophores without spectral overlap.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through spatially encoded excitation and single-detector collection.
- Scalability: Supports platform reuse across different dye combinations and target classes due to modular fiber-optic design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables screening of enzyme variants or binding agents with relevance to preclinical target validation.
- Mechanistic De-risking: Allows detection of low-abundance signals (sub-nanomolar fluorescein) to assess sensitivity in biomarker-like readouts.
- Predictive Confidence: Generates quantitative, time-resolved fluorescence outputs that support go/no-go decisions in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from assay development to lead identification, providing a reusable detection module for droplet-based screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via multiplexed fluorescence detection in high-throughput droplet formats.
- Screening: Enables assay readiness through spatially separated excitation and temporal signal encoding, improving throughput and multiplexing capability.
- Analytics: Delivers quantitative fluorescence readouts with peak separation correlating to droplet transit time, enabling discrimination of multiple populations.
- Translational Research: Connects to preclinical work by detecting enzyme activity or binding events in clinically relevant concentration ranges.
- Enterprise Reuse: Represents a modular, fiber-based detection system adaptable to various microfluidic chips and dye sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling reliable, multiplexed signal detection in complex mixtures.
- Operational Value: Reduces complexity and cost compared to traditional microscopy-based systems, improving lab throughput and ease of use.
- Strategic Value: Accelerates screening campaigns by simplifying setup and maintenance, supporting faster iteration in enzyme evolution and phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits through reproducible, quantitative fluorescence data across multiplexed conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, optical fiber handling, and laser coupling.
- Depends on access to laser diodes, optical fibers, fiber couplers, and a single-photon detector or PMT.
- Necessitates standardization of fiber positioning and channel geometry for reproducible temporal encoding.
- Involves adaptation considerations when changing dye pairs or channel dimensions to maintain peak separation.
- Practical limitations include sensitivity to fiber alignment and potential signal crosstalk if temporal resolution is insufficient.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:34
Master Fabrication
3:42
PDMS Device Fabrication
5:24
Preparation of Optical Components
6:41
Optical Fiber Insertion
7:33
Fluorescence Detection of Mixed Emulsions
8:53
Results: Sensitive Detection of Fluorescent Droplets Using Optical Fibers
9:55
Conclusion
