Name: 使用多色荧光检测液滴微流控光纤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习使用光纤阵列进行液滴微流控多色荧光检测技术。该方法通过时间编码简化检测流程，为高通量生物筛选和酶定向进化研究提供了一种简便且经济的解决方案。

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本工作得到了美国国防高级研究计划局（DARPA）资助项目（编号 84389.01.44908）、美国国家科学基金会（NSF）职业奖（DBI-1253293）、美国国立卫生研究院（NIH）探索性/发展性研究资助（CA195709）、NIH 新创新者奖（HD080351，DP2-AR068129-01）以及加州大学旧金山分校（UCSF）资源分配计划新方向资助的支持。

1. SU8 母版制作
<ol>
	<li>使用设计软件设计用于三层制造的微流控结构，并将设计文件交由供应商以10 µm分辨率打印在电路板薄膜上。设备设计的详细信息见所附参考文献。 6 通道几何形状如图所示 图1各层应包含对准标记，以帮助对齐每层制造结构中的特征 8.</li>
	<li>将一片预先清洗过的直径为3英寸的硅片放置在旋涂仪上，并打开真空泵以将其固定在卡盘上。在硅片中心加入1 ml SU8-3050光刻胶，先以500 rpm转速旋涂20秒，再以1,750 rpm转速旋涂30秒，形成厚度为80 µm的薄膜层。</li>
	<li>取出晶圆，在135 °C的加热板上烘烤30分钟。待晶圆冷却至室温后再进行下一步操作。</li>
	<li>将涂覆好的晶圆暴露于 1st 在365 nm、190 mW的平行LED光下曝光3分钟，形成层掩模。曝光后，将晶圆置于135 °C的热板上1分钟，随后冷却至室温，再进行下一步操作。</li>
	<li>将晶圆放置在旋涂仪上，打开真空以将其固定在卡盘上。在晶圆中心加入1 ml SU8-3050，先以500 rpm转速旋涂20秒，再以5,000 rpm转速旋涂30秒，形成一层额外厚度为40 µm的薄膜。</li>
	<li>取出晶圆，在135 °C的加热板上烘烤30分钟，然后冷却至室温，再进行下一步操作。</li>
	<li>对齐 2nd 将掩模层覆盖在1.3步骤中已图形化的基底上，将涂覆好的晶圆置于准直的190 mW、365 nm LED光源下曝光3分钟。曝光后，将晶圆置于135 °C热板上加热4分30秒，随后冷却至室温，再进行下一步操作。</li>
	<li>将晶圆放置在旋涂仪上，并打开真空以将其固定在卡盘上。在晶圆中心加入1 ml SU8-3050，先以500 rpm转速旋转20秒，再以1,000 rpm转速旋转30秒，形成一层额外厚度为100 µm的薄膜。</li>
	<li>取出晶圆，在135 °C的加热板上烘烤30分钟，然后冷却至室温，再进行下一步操作。</li>
	<li>对齐 3rd 将掩模层覆盖在1.3步骤中已图形化的基底上，将涂覆好的晶圆置于190 mW、365 nm的平行LED光下曝光3分钟。曝光后，置于135 °C热板上加热9分钟，随后冷却至室温，再进行下一步操作。</li>
	<li>将掩模浸入搅拌的丙二醇单甲醚醋酸酯溶液中30分钟以进行显影。用异丙醇清洗晶圆，并在135 °C的热板上烘烤1分钟。将显影后的母模置于100 mm培养皿中，用于聚二甲基硅氧烷（PDMS） molding。</li>
</ol>
2. PDMS 装置的制备
<ol>
	<li>通过将50 g硅胶基质与5 g固化剂在塑料杯中混合，配制10:1的PDMS。使用装有搅拌棒的旋转工具混合内容物，并将混合物置于真空干燥器中脱气30分钟，或直至所有气泡完全去除。</li>
	<li>将PDMS浇注在模具上，使其厚度达到3 mm，然后重新放入真空干燥器中进一步脱气。待所有气泡去除后，在80 °C下烘烤80分钟以固化器件。</li>
	<li>使用手术刀从模具上切割出器件，并将其图案面朝上放置于洁净表面上，使用0.75 mm活检打孔器冲出流体进出口。切割时应确保器件侧面可接触到120 µm和220 µm高的结构区域。</li>
	<li>将器件图案面朝上，与预先清洗过的2英寸×3英寸玻璃载片一同置于300 W等离子清洗机中，在1 mbar O2等离子条件下处理20秒。将PDMS器件的图案面贴合至经等离子处理的玻璃载片表面以实现键合。随后将器件放入80 °C烘箱中，加热40分钟以完成组装。</li>
	<li>使用注射器向器件通道内注入氟化表面处理液，以使通道表面具备疏水性。随后立即在80 °C下烘烤10分钟，以蒸发溶剂。</li>
</ol>
3. 光学元件的制备
<ol>
	<li>通过剥离一根芯径105 µm、包层125 µm、数值孔径NA = 0.22的光纤末端最后5 mm的绝缘层，制备激光激发光纤。</li>
	<li>制备 2nd 重复3.1步骤，对2号彩色激光激发光纤进行操作nd 相同的纤维</li>
	<li>通过重复步骤3.1，为一根纤芯200 µm、包层225 µm、数值孔径（NA）= 0.39的光纤准备用于收集荧光信号的光纤。</li>
	<li>检查所有光纤的端面——如果端面不是平整的，需使用光纤刻划刀重新切割端面。</li>
	<li>将激光光纤耦合器连接至50 mW、405 nm的激光器，并将一根芯径为105 µm的光纤连接到激光器。将光纤剥除涂覆层的一端对准激光功率计的传感器，调节激光耦合器的微调装置，使激光输出功率最大化。</li>
	<li>重复步骤3.5，使用50 mW、473 nm的激光器。</li>
	<li>使用透镜筒将446/510/581/703 nm四通道带通滤光片安装到PMT上，以阻断激光光并透过发射的荧光。安装光纤耦合器，使光在到达PMT之前先通过滤光片。</li>
	<li>将3.3中的光纤连接到3.7组装的装置上。</li>
</ol>
4. 离线混合乳液的制备
<ol>
	<li>获取一个带有 60 µm × 60 µm 孔径的流动聚焦微流控液滴生成装置。</li>
	<li>用含 2% 离子型氟化表面活性剂9的 HFE 7500 油填充 1 ml 注射器。</li>
	<li>准备一系列 1 ml 注射器，分别装入以下在 PBS 中配制的荧光素（FITC）与蓝色葡聚糖偶联染料（CB）的混合溶液：1 nM FITC/10 nM CB、10 nM FITC/10 nM CB、1 nM FITC/100 nM CB 和 10 nM FITC/100 nM CB。</li>
	<li>将液滴生成装置安装在倒置显微镜载物台上，并将水相和油相注射器安装在注射泵上。使用 PE-2 管将注射器与装置连接。</li>
	<li>将油相注射泵流速设为 500 µl/hr，水相注射泵流速设为 250 µl/hr，生成直径约 80 µm 的液滴，其中包含步骤 4.3 中的溶液。每种水相样品均需使用新的液滴生成装置，以避免交叉污染。将每种染料组合产生的约 200 µl 乳液收集至空注射器中。</li>
	<li>当四种类型的液滴均收集至同一收集注射器后，通过反复旋转注射器混合乳液。</li>
	<li>重复步骤 4.2–4.6，使用在 PBS 中含有 0.1、1、10 和 100 nM FITC 的水相溶液进行操作。</li>
</ol>
5. 光纤插入
<ol>
	<li>将第2步制备的微流控芯片放置在倒置显微镜的载物台上，显微镜需配备能够实现 &#60; 100 µsec 快门速度的数字相机。</li>
	<li>小心地从侧面操作，将连接473 nm激光器的光纤插入最上游的120 µm通道中，注意避免刺穿至主流动通道。</li>
	<li>将连接405 nm激光器的光纤插入最下游的120 µm高侧通道中，使两根光纤间距为300 µm。</li>
	<li>将连接光电倍增管（PMT）的光纤插入垂直于两根激光激发光纤的220 µm高通道中。</li>
</ol>
6. 混合乳液的荧光检测&#160;
<ol>
	<li>将装有含2%离子型氟化表面活性剂的HFE 7500的5 ml注射器通过PE-2管路连接至检测装置的间隔油入口。</li>
	<li>将装有混合FITC/CB乳液的注射器安装在垂直放置的注射泵上，并通过PE-2管路连接至装置的液滴再注入入口。从装置出口连接一段PE-2管路至废液容器。</li>
	<li>启动两个泵，均以1,000 µl/hr的流速运行，直至在装置中观察到油相和液滴稳定合并并沿下游流动，完成装置的预灌注。</li>
	<li>调节流速，使间隔油流速为6,000 µl/hr，液滴流速为100 µl/hr，确保液滴在通过检测区域时具有足够的间距。</li>
	<li>打开激光器，启动数据采集程序，并调节PMT增益，使信号强度超过基线噪声水平100倍以上。调节激光功率，使所有双峰在单条线性时间轨迹图上清晰可见。</li>
	<li>以至少20 kHz的采样频率采集60秒的PMT电压时间轨迹数据。将数据导入Matlab等计算程序，并使用自定义计算程序脚本测量记录的双峰信号的峰高。 
	注：该脚本作为补充信息提供。</li>
	<li>使用步骤4.7中制备的仅含FITC的混合乳液重复步骤6.2–6.7，此时关闭405 nm激光器。</li>
</ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004(2010).</li>
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<li>Guo, F., Lapsley, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+droplet-based%2C+optofluidic+device+for+high-throughput%2C+quantitative+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis.</a> Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).</li>
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<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882(2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li>
<li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li>
<li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li>
<li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li>
<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

光纤检测需要将光纤与流体通道进行对准。由于本装置采用多层光刻技术制备的导引通道，因此在光刻过程中各掩模之间的相对位置至关重要。如果光纤导引通道距离流体通道过近，可能导致液体泄漏；若导引通道距离过远或发生错位，则检测光纤所收集的荧光信号可能会显著减弱。可通过在掩模上设计对准标记（例如同心圆）以辅助实现精确对准，这些标记在光刻图形化过程中需精确重合。此外，将光纤手动插入装置的过程较为精细，操作不当可能导致光纤尖端在装置内部断裂，从而导致光纤无法使用。成功插入光纤的关键在于：将光纤紧贴键合在PDMS装置上的玻璃载片，并在显微镜下观察的同时缓慢插入。最后，预生成乳液的重新注入应尽量减少操作步骤。理想情况下，乳液制备完成后应直接注入空注射器中，并在用于液滴重注入前不再转移。
多色检测要求信号双峰之间的峰彼此区分开，并且连续液滴的信号不发生重叠。我们在此使用的检测装置采用一对中心间距为300 µm的125 µm光学纤维，从而在激发区域之间形成约175 µm的非照明区域。这使得80 µm的液滴每次仅被一个光源激发，确保双峰中的每一个峰仅由一种类型的激光激发产生。当激发区域之间的间距接近液滴直径时...

液滴微流控技术通过将实验分隔在大量悬浮于载油中的水相液滴内，为高通量生物学研究提供了平台1。液滴已被应用于多种场景，例如单细胞分析2、数字聚合酶链式反应（PCR）3以及酶的定向进化4。荧光检测是液滴微流控的标准检测方式，因其信号强、响应速度快，能够适应在千赫兹频率下对亚纳升级别液滴体积的检测。许多应用需要同时进行至少两种颜色的荧光检测。例如，我们实验室通常开展基于PCR激活的液滴分选实验，其中一个检测通道用于读取检测结果，另一个通道则使用背景染料使未发生反应的阴性液滴可被计数5。
液滴微流控技术的典型检测装置基于落射荧光显微镜，需要复杂的光学调控方案，将来自自由空间激光器的激发光引入显微镜并聚焦到样品上。当液滴发出荧光后，发射的荧光信号经过滤光处理，使每个检测通道使用一个以特定波长范围为中心的光电倍增管（PMT）。基于落射荧光显微镜的光学检测系统由于成本高、结构复杂且需要定期维护，限制了其广泛应用。而光纤为构建简化且稳定的检测方案提供了可能，因为光纤可手动插入微流控装置中，无需基于反射镜的光路引导，并可通过光纤连接器实现光路的对接。
本文描述了一种紧凑且模块化的多色荧光检测方案的组装与验证过程，该方案利用光纤阵列和单个光电探测器实现检测6。各光学光纤分别耦合至独立的激光器，并以规则的空间间隔垂直插入L形流动通道。一条荧光收集光纤与激发区域平行放置，并连接至单个光电倍增管（PMT）。由于液滴在不同时间依次通过各激光束，PMT记录的数据呈现出时间上的偏移，从而使用户能够区分液滴被不同激光束激发后所发射的荧光信号。这种时间位移消除了使用一系列二向色镜和带通滤光片将发射光分配至多个PMT的需要。为验证该检测器的有效性，我们对包裹不同颜色和浓度染料的液滴群体进行了荧光定量分析。系统对单色荧光素检测的灵敏度进行了考察，结果表明其可检测低至0.1 nM浓度的液滴，相较于文献中近期报道的基于光纤的方法，灵敏度提高了200倍7。

<table><tbody><tr><td>光刻掩模</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3&quot; 硅片，P型，原始测试级</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 号针头</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 聚乙烯管</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>通常称为 HFE 7500</td></tr><tr><td>离子型 Krytox 表面活性剂</td><td></td><td></td><td>合成方法见参考文献 #10</td></tr><tr><td>级联蓝染料偶联葡聚糖</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>荧光素钠盐</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>四通道带通滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>光电倍增管（PMT）</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>光纤端口</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>透镜套管</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>一端剥除涂覆层、另一端带 FC/PC 连接器的 200 &amp;#956;m 纤芯 / 225 &amp;#956;m 包层光纤跳线</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>一端剥除涂覆层、另一端带 FC/PC 连接器的 105 &amp;#956;m 纤芯 / 125 &amp;#956;m 包层光纤跳线</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &amp;#956;m 光纤剥线工具</td><td>Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &amp;#956;m 光纤剥线工具</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>激光光纤适配器</td><td>OptoEngine</td><td>FC/PC Adapter</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;nbsp;mW 的 405 nm 连续波激光器</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>CNI 激光器的经销商</td></tr><tr><td>50&amp;nbsp;mW 的 473 nm 连续波激光器</td><td>OptoEngine</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

使用光纤实现液滴微流控的多色荧光检测

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

由于荧光信号明亮且响应速度快，荧光检测是液滴微流控中最常用的检测方式。多重检测、酶进化以及分子生物学增强的细胞分选等应用均需要检测两种或更多颜色的荧光信号。传统的多色检测系统通常将自由空间激光器与落射荧光显微镜耦合，这类系统体积庞大、成本高昂且维护困难。本文介绍了一种通过将激光耦合至光纤并激发微流控通道中不同空间区域来实现多色检测的方法。发射光由耦合至单一光电探测器的光纤收集。由于激发发生在不同的空间位置，发射光的身份信息可被编码为时间上的位移，从而无需采用更复杂的光学滤光方案。该系统已成功用于检测包含四种不同染料组合的液滴群体，并可检测亚纳摩尔浓度的荧光素。

制造可插入光学纤维的PDMS器件需要采用多步光刻工艺，以形成不同高度的通道（图1）。首先，将一层80 µm高的SU-8旋涂在硅片上，并使用掩模进行图形化，以构建流体操控结构。接着，在硅片上再旋涂一层额外的40 µm SU-8，并使用第二张掩模进行图形化，形成将构成120 µm高激光光纤插入通道的结构。最后，在硅片上再旋涂100 µm的SU-8，并进行图形化，以获得220 µm高的检测光纤插入通道。将制备好的模具显影后用于成型PDMS器件，再将该器件键合到玻璃载片上。最终的器件包含80 µm高的流道结构，通过在器件顶部打孔实现通路；而120 µm和220 µm高的光学纤维通道则通过器件侧面实现通路。
用于检测的装置几何结构如图2所示。外部生成的80 µm乳液通过液滴重注入口重新注入，并由间隔油进行分隔，随后流入L形检测通道。两根激光耦合光纤插入120 µm高的通道中，可在流动通道内的特定...

在液滴微流控中，多色荧光检测通常需要使用体积庞大且结构复杂的基于倒置荧光显微镜的检测系统。本文介绍一种紧凑且模块化的多色检测方案，该方案利用光纤阵列通过单个光电探测器对采集的多色数据进行时间编码。

荧光检测是液滴微流控技术中最常用的检测信号，因其信号强且响应时间快。此类应用包括……

本实验的总体目标是演示一种利用光纤进行液滴微流控荧光检测的简单应用。该方法有助于回答高通量生物筛选中的关键问题，例如稀有表型的鉴定以及酶的定向进化。该技术的主要优势在于，它能够在液滴微流控中实现简单且低成本的荧光检测应用。首先，将一片预先清洗过的直径为三英寸的硅片放置在旋涂机的真空卡盘上。然后，在硅片中心滴加一毫升 SU-8 3050 光刻胶，并旋转硅片，使其形成一层厚度为 80 微米的光刻胶层。将涂覆好的硅片从旋涂机上取下，置于预热至 135 摄氏度的加热板上。30分钟后取出晶圆，使其冷却至室温。接着将晶圆放置于平整表面，对准第一层掩模。使用准直的190毫瓦、365纳米LED光源照射晶圆3分钟。曝光后，将晶圆置于135摄氏度的热板上加热一分钟，然后使其冷却至室温。冷却后，将晶圆重新放回旋涂仪上，并固定到卡盘上。在晶圆中心再加入1毫升SU-8 3050，以500 r.p.m.转速旋涂20秒。随后在5,000 r.p.m.下离心30秒。接下来，将晶圆放在热板上烘烤。待其冷却至室温后，再将其放回掩模对准表面。使用解剖显微镜手动将第二层掩模与晶圆上的对准标记对齐。对齐完成后，在与之前相同的条件下对涂覆的晶圆进行曝光，持续 4-1/2 分钟。曝光后，将晶圆置于 135 摄氏度的热板上加热 1 分钟，随后冷却晶圆并重新固定到旋涂仪上。第三次在晶圆上涂覆1毫升SU-8 3050光刻胶，并通过旋涂增加100微米的光刻胶厚度。取下晶圆，在135摄氏度的加热板上烘烤30分钟，随后冷却至室温，置于对准面上。将第三层掩模与之前的图形对齐，并使用之前的条件曝光涂覆后的晶圆，持续九分钟。曝光后，将晶圆置于135°C的热板上加热一分钟，然后冷却至室温。冷却后，通过将晶圆浸入搅拌状态的显影液中30分钟来显影掩模。最后，用异丙醇清洗晶圆，然后在135摄氏度的热板上再烘烤一分钟。将制备好的母模存放于100毫米的培养皿中，直至进行 molding。在塑料杯中将50克硅胶基质与5克固化剂混合，配制成10:1的PDMS混合物。使用旋转工具混合内容物，然后将混合物置于干燥器中脱气30分钟，或直至所有气泡完全去除。将脱气后的PDMS浇注在制备好的模具上，形成三毫米厚的涂层。随后，将培养皿重新放入干燥器中进一步脱气。待所有气泡完全排除后，将装置在 80 摄氏度下烘烤 80 分钟。冷却后，使用解剖刀从模具上切割下装置，使装置侧面可暴露 120 微米和 220 微米的远端几何结构。随后使用 0.75 毫米活检打孔器冲出流体进出口。将器件的特征面朝上放置，与一片预先清洁过的载玻片一同置于300瓦等离子清洗仪中，在1毫巴氧气等离子体条件下处理20秒。将PDMS器件的图案面紧密贴合到经等离子处理的载玻片表面，完成键合。随后，将器件放入80摄氏度的烘箱中，加热固化40分钟。烘烤完成后，使用注射器将含氟表面处理液注入

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用多色荧光检测液滴微流控光纤

本文中，我们描述了如何利用自动扫描共聚焦显微镜，从固定在表面的单个DNA分子获得FRET轨迹。...

用于表面固定生物分子单分子荧光测量的自动化系统

展示了一种无透镜片上荧光显微成像平台，可利用基于压缩采样的解码算法，对例如&gt;0.6–8...

芯片上的无透镜荧光显微镜技术

基于液滴的微流控平台有望用于高通量实验，因其能够以千赫兹速率低成本生成皮升级、自成隔室的微小反应容器。通过与快速、灵敏且高分辨率的荧光光谱方法相结合，可高效地提取、利用并整合这些系统中产生的大量信息。...

微流控液滴平台的荧光检测方法

本视频展示了利用荧光涨落光谱技术检测细胞间接触处细胞表面蛋白相互作用的方法。通过表达带有荧光蛋白标记的跨膜黏附受体，并混合携带两种光谱可区分荧光标记的不同细胞群体，可评估相邻细胞间不同颜色荧光标记受体之间的跨膜相互作用。 通过...

利用荧光涨落光谱研究细胞接触处的蛋白质相互作用

荧光核心微腔传感器在石英微毛细管的通道内采用高折射率量子点涂层。泵入毛细管通道的流体折射率发生变化时，会引起微腔荧光光谱的偏移，该偏移可用于分析通道内的介质。...

荧光核微腔的合成与操作用于折射率传感

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。...

同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

本研究展示了一种在气动液滴操控平台上检测多位点核苷酸多态性的简单且可视化的方 法。利用该方法，整个实验过程（包括液滴操控和多位点核苷酸多态性检测）均可在接近23 °C的条件下完成，无需借助复杂的仪器设备。...

基于气动液滴操控平台的多位点核苷酸多态性可视化比色检测

本文介绍了一种在活细胞细胞器中对单个膜蛋白进行多色定位的实验方案。通过使用自标记蛋白来连接荧光染料，可对同一细胞器不同膜区室中分布的蛋白质实现约18...

活体哺乳动物细胞器中单个膜蛋白的多色定位显微成像

本文介绍了一种构建集成显微系统的实用指南，该系统以经济高效的方式将传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像以及多色单分子检测（包括单分子荧光共振能量转移成像）整合到一个装置中。...

使用一台荧光显微镜实现多种成像模式

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。...

使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

该方案描述了一种先进的微流控平台，用于定量测量单个外周血单个核细胞的细胞因子分泌动态。以脂多糖刺激为例，该平台可对每个单个细胞并行检测多达三种细胞因子（IL-6、TNFα 和...

微流控方法解析单个多功能细胞同时与顺序性细胞因子分泌

学习使用光纤阵列进行液滴微流控多色荧光检测技术。该方法通过时间编码简化检测流程，为高通量生物筛选和酶定向进化研究提供了一种简便且经济的解决方案。

使用光纤实现液滴微流控的多色荧光检测

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